Name: 실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: 학습하세요 미토콘드리아에 국소화된 세포주기 키나아제 Cdk1의 기능을 연구하는 실험 방법을. 이 기법은 미토콘드리아 기질 표적화와 세포주기 진행 분석에 활용됩니다.

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이 작업은 NIH 보조금 CA133402, CA152313 및 에너지부 과학 사무소 DE-SC0001271의 지원을 받았습니다. NCI P30 CA0933730, NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 및 S10 RR 026825 보조금의 자금 지원과 유세포 분석 실험에 도움을 준 Bridget McLaughlin 및 Jonathan Van Dyke의 기술 지원을 받은 University of California Davis 유세포 분석 공유 자원 실험실에 감사드립니다.

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

다른 세포 내 소기관으로 향하는 단백질 마찬가지로 미토콘드리아 표적 단백질은 정교한 단백질 전좌 접지기 (21, 22)의 도움 소기관에 직접 일차 또는 이차 구조 내의 표적 신호를 갖는다. 이러한 COX8 같은 독점적으로 미토콘드리아 상주 단백질에서 얻은 시퀀스 (MTS)을 대상으로 미토콘드리아는 미토콘드리아 11,23,24에 특정 단백질을 대상으로하는 유전자 서열의 N 말단에 추가 할 수 있습니다. 여기에, CyclinB1과는 Cdk1 유전자 벡터를 포함 COX8의 MTS에 표현에 복제하고, 재조합 CyclinB1과는 Cdk1는 미토콘드리아로 현지화되었다. 이 방법의 장점은 전체 유전자의 발현을 변경하지 않고,이 경우 미토콘드리아에, 특정 서브 - 세포 구획에서 유전자 발현의 변형을 가능하게한다는 것이다. 이 전략으로, 미토콘드리아 특정 핵 키나제의 기능은는 Cdk1는 해제되었다termined. 마찬가지로 우성 네가티브는 Cdk1에 MTS를 추가하여, 아래는 Cdk1의 미토콘드리아 특정...

포유 동물에서 세포주기의 진행은 cyclins과 cyclin-dependent kinases (Cdks) 1에 의해 제어 높은 순서 이벤트에 따라 달라집니다. 그 세포질, 핵 및 centrosomal 지역화를 통해 CyclinB1 /는 Cdk1는 핵 봉투 고장 및 중심체 분리 2와 유사 분열에서 다양한 이벤트를 동기화 할 수 있습니다. CyclinB1 /는 Cdk1는 세포 사멸 (3)에 대해 유사 분열 세포를 보호하고 미토콘드리아 분열, 새로 형성된 딸 세포 4 미토콘드리아의 평등 한 분배를위한 중요한 단계를 촉진한다. 포유류 세포 증식에​​서 미토콘드리아 ATP 5 멀티 소단위 복합체로 구성되어 산화 적 인산화 (OXPHOS) 기계 (전자 전달계)를 통해 생성된다; 복잡한 I - 복잡한 V (CI-CV). 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NADH) : 유비 퀴논 산화 환원 효소 복잡한 I (CI)는 다섯 단지 (5)의 이해 최대 규모 이상이다. 복잡한 C45 서브 유닛의 14 onsists는 촉매 코어를 형성한다. 일단 복합 한 팔이 매트릭스 내부의 막에 매립 -6,7- 다른 아암에 돌출하여 L 자형 구조를 가정 조립. CI 단위체의 돌연변이는 미토콘드리아 장애 8의 다양한 원인이다. OXPHOS에서 기능적으로 효율적 CI는 전체 미토콘드리아 호흡 9, 또한 성공적인 세포주기 진행 10뿐만 아니라 필요합니다. 건강과 질병이 막 결합 효소 복합체의 기능을 기본 메커니즘을 해결했습니다 것은 소설 진단 절차 및 고급 치료 전략의 개발을 가능하게 할 수있다. 최근 연구에서는 CyclinB1 /는 Cdk1 착체 셀 중 셀 증가 에너지 요구를 상쇄하기 위해 GAP (2) G2 / (유사 분열) M 단계에서 미토콘드리아에 전위 시키며 잠재적으로, 미토콘드리아의 에너지 생산을 향상 CI 소단위 인산화 것을 발견 사이클 11. 여기에서 우리는 쇼실험 절차와 달리 핵 / 세포질 키나제의 미토콘드리아 전위을 연구하는데 사용될 수있는 전략들은 미토콘드리아 기질뿐만 아니라 예를 들어 CyclinB1 /는 Cdk1을 사용하여 미토콘드리아 지역화 기능적 결과 wcase. 필요한 미토콘드리아 고유의 과발현이 단지의 최저의 연구를 묻는 메시지가 나타나면 CyclinB1 /는 Cdk1 단지가 미토콘드리아로으로 전위 것을 발견. 단백질의 미토콘드리아 - 특이 적 발현을 달성하기 위하여, 하나는 관심있는 단백질의 N 말단에 미토콘드리아 타겟팅 서열 (MTS)을 추가 할 수있다. 시퀀스를 대상으로 미토콘드리아는 일반적으로 12있는 미토콘드리아에 미토콘드리아 단백질의 정렬을 할 수 있습니다. 우리는 CyclinB1 또는 적색 형광을 -tagged 인간 시토크롬 C 산화 효소 서브 유닛 8A (COX8)의 전구체에서 파생 된 87베이스 미토콘드리아 대상 시퀀스를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP)로 그것을 복제 한단백질 (RFP)는는 Cdk1 프레임에 플라스미드를 포함 -tagged. 이 방법은 특히 핵 풀에 영향을주지 않고 이들 단백질의 미토콘드리아 표현을 변경, 우리가 미토콘드리아에 CyclinB1과는 Cdk1를 대상으로 할 수있었습니다. 형광이 단백질에 태그를 추가함으로써, 우리는 실시간으로 자신의 위치 파악을 모니터링 할 수 있었다. 마찬가지로, 우리는 우리가 구체적으로는 Cdk1의 미토콘드리아 표현과 기능을 노크 할 수 RFP 태그가 지배적 인 부정적인는 Cdk1 포함하는 플라스미드로 MTS를 도입했습니다. 는 Cdk1 같은 듀얼 현지화를 키나제의 미토콘드리아 및 핵 기능을 구별하는 것이 필수적이다. 이러한 이중 기능성 키나제의 N 말단에 MTS 공학이 사용될 쉽고 효과적인 다양한 전략을 제공한다. 는 Cdk1은 세포주기 키나제이므로,는 Cdk1은 미토콘드리아에 국소 때 세포주기 진행을 결정하는 기본이다. 이를 위해, 우리는 새로운 운전 방식을 이용했다D는 세포의 DNA 함량을 모니터한다. 전통적인 방법은 티미 딘으로 대체하는 세포주기의 S 단계에서 새로 합성 된 DNA 내로 통합 BrdU (브로 모데 옥시 우리 딘), 티미 딘의 합성 유사체를 포함하여. 이어서 적극적으로 DNA를 복제 세포는 항 BrdU의 항체를 이용하여 검출 될 수있다. 이 방법의 하나의 단점은, 결과 (13, 14) 사이의 불일치가 발생할 수 산 또는 열처리 등 열악한 방법에 의해 BrdU의 항체에 대한 액세스를 제공하는 DNA의 변성이 필요하다는 것이다. 대안 적으로, 우리는 다른 티미 딘 유사체, 듀와 적극적 분할 셀을 모니터링하는 유사한 방법을 이용했다. 중성 세제를 처리 새로 합성 된 DNA에 EDU에 액세스 할 수있는 검출 시약을 가능으로 에듀 검출 거친 DNA 변성을 필요로하지 않습니다. 듀 방법보다 신뢰성 일관된 높은 처리량 분석 15 가능성이 입증되었다. 마지막으로, tO는 Cdk1의 미토콘드리아 기질을 결정, 우리는 고전 이차원 전기 영동의 향상된 버전 2D-DIGE라는 프로테오믹스 도구를 사용했다. 두 차원 전기 영동은 두 번째의 첫 번째 차원과 분자량에서의 등전점에 따라 단백질을 분리한다. 이러한 인산화와 같은 번역 후 변형은 단백질의 등전점과 분자량을 결정하므로, 2D 겔 상이한 샘플 내 단백질의 인산화 상태의 차이를 검출 할 수있다. 단백질의 크기 (면적 강도)는 다수의 샘플들 사이의 양적 비교를 허용하는 단백질의 발현 수준의 변화 스폿. 이 방법을 사용하여, 우리는 돌연변이 미토콘드리아 타겟팅는 Cdk1 발현 세포에 비해 야생형에서 인산화 단백질을 구별 할 수 있었다. 야생형에 보여하지만 미토콘드리아 타겟 돌연변이는 Cdk1 준비에 누락 된 특정 단백질 관광 명소 격리하고,질량 분석을 통해 확인 하였다. 전통적인 2D 젤에서 트리 페닐 메탄 염료 겔 단백질을 가시화하기 위해 사용된다. 2D-DIGE 단백질 전기 영동 이동성에 최소한의 효과 형광 단백질 라벨을 사용합니다. 다른 단백질 시료는 다른 형광 염료를 함께 혼합 한 겔 (16)상의 복수의 샘플 공동 전기 있도록, 동일한 겔에 의해 분리로 표지 될 수있다. 이 겔 기반 프로테오믹스 연구에서 중요한 문제이다 겔을 겔 변형을 최소화한다.

<table><tbody><tr><td>32P ATP&nbsp;</td><td>퍼킨엘머</td><td>BLU002001MC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>항-마우스 2차 항체</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 결합</td></tr><tr><td>항토끼 2차 항체</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 conjugated</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>시험관 내 키나아제 분석</td></tr><tr><td>Cdk1 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 키나아제 완충액</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 이미징 키트</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>EdU 라벨링</td></tr><tr><td>을 사용한 세포주기 분석COX IV 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4844S</td><td>미토콘드리아 면역 염색</td></tr><tr><td>Cyclin B1 항체</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>CyclinB1 / Cdk1 효소 복합체</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>동결 / 해동 방지</td></tr><tr><td>CyDye DIGE 형광 라벨링 키트</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE 젤 및 DIGE 버퍼 키트</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>디메틸포름아미드&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td></td><td>dNTP EMD Millipore</td><td>71004</td><td>부위 지시 돌연변이 유발</td></tr><tr><td>Dpn I 효소</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>부위 지시 돌연변이 유발</td></tr><tr><td>드라이 스트립 커버 유체</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>미네랄 오일로 사용</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge Concentrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>진공 원심 분리기 농축기로 사용</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Anti-fade mounting solution</td></tr><tr><td>Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>649908</td><td>For cell cycle EdU 라벨링을 사용한 분석</td></tr>: <tr><td>Histone H1</td>, <td>Calbiochem</td><td>382150</td>, <td>시험관 내 키나아제 분석,</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>, <td>Qiagen</td><td>28704</td>, <td>아가로스 젤의 DNA 단편 정제,</td></tr><tr><td>Immobiline, DryStrip Gel,</td><td>GE Healthcare, Life Sciences</td><td>18-1016-61</td>, <td>IEF(등전체 포커싱) 스트립,</td></tr><tr><td>Immobilized Glutathione</td><td>, Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>글루타티온-아가로스 비즈</td></tr><tr><td>요오도아세트아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 이소전기 포커싱 유닛</td><td>GE 헬스케어 라이프 사이언스</td><td>11-0033-64</td><td>IPGphor 스트립 홀더</td></tr><tr><td>이소프로필-b-D-thio-갈락토피라노사이드&nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>세포 용해 완충액</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Aldrich</td><td>L5501</td><td>CyDye 라벨링</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker Red/Green</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>미토콘드리아 형광 염료</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD 화학물질</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>GFP 발현 벡터</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td>GST 발현 벡터</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 투석 튜빙</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>투석용 다공성 멤브레인 튜빙</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>2D 겔의 인단백질 염색용</td></tr> 단백질분해효소 <tr><td>억제제 칵테일</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>세포 용해 완충액</td></tr><tr><td>QuikChange 부위 지정 돌연변이 유발 키트</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>MiniPrep Plasmid Isolation Kit</td></tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Cdk1 억제제</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>Complex I 억제제</td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>EMD 화학</td><td>SX0420-5</td><td>세포 용해 완충액용</td></tr><tr><td>오르토바나데이트</td><td>나트륨 MP 생물의학</td><td>159664</td><td>세포 용해 완충액용</td></tr><tr><td>피로인산나트륨 decahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>세포 용해 완충액</td></tr><tr><td>나트륨 &beta;-글리세로인산</td>염 <td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>세포 용해 완충액</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&nbsp;</td><td>분자 장치</td><td>M2E</td><td>마이크로플레이트 리더</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>조직 분쇄기 유봉</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>미토콘드리아 분리용</td></tr><tr><td>조직 분쇄기 튜브</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>미토콘드리아 분리용</td></tr><tr><td>트리클로로아세트산 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>레이저 젤 스캐너 2D-DIGE</td></tr><tr><td>유비퀴논</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 cdk1의 기능을 연구하는

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

미토콘드리아는 자체 전사 기계를 가지고 있지만, 미토콘드리아 단백질의 1%만이 세포 기관 내에서 합성됩니다. 핵으로 인코딩된 단백질은 미토콘드리아 표적 염기서열(MTS)에 의해 유도되는 미토콘드리아로 운반됩니다. 그러나 대부분의 미토콘드리아 국소 단백질에는 식별 가능한 MTS가 없습니다. 그럼에도 불구하고 MTS가 단백질이 미토콘드리아로 들어가도록 지시할 수 있다는 사실은 일반적으로 핵 및/또는 세포질 단백질의 미토콘드리아 기능을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 우리는 최근에 미토콘드리아에서 세포주기 키나아제 CyclinB1/Cdk1 복합체를 확인했습니다. 이 복합체의 미토콘드리아 기능을 구체적으로 연구하기 위해서는 핵 또는 세포질 기능을 방해하지 않으면서 이 복합체의 미토콘드리아 과발현과 녹다운이 필수적이었습니다. CyclinB1/Cdk1에 MTS를 태그함으로써 이 복합체의 미토콘드리아 과발현을 달성하여 미토콘드리아 표적과 기능을 연구할 수 있었습니다. 우성-음성 Cdk1에 MTS를 태깅함으로써 특히 미토콘드리아에서 Cdk1 활성을 억제했습니다. CyclinB1/Cdk1 복합체의 잠재적인 미토콘드리아 표적은 겔 기반 단백질체학 접근법을 사용하여 식별되었습니다. 기존의 2D 겔 분석과 달리, 당사는 2차원 차이 겔 전기영동(2D-DIGE) 기술을 사용한 후 인단백질 염색을 수행하여 미토콘드리아 Cdk1 발현 세포에서 차등 인산화 단백질을 형광 라벨링했습니다. 미토콘드리아를 함유한 우성 음성 Cdk1과 야생형에서 변형된 인단백질 반점의 식별은 Cdk1의 미토콘드리아 표적의 정체를 밝혔습니다. 마지막으로, 세포주기 진행에 대한 CyclinB1/Cdk1 미토콘드리아 국소화의 효과를 확인하기 위해 합성 티미딘 유사체 EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)를 사용한 세포 증식 분석을 사용하여 세포가 세포주기를 거치고 DNA를 복제할 때 세포를 모니터링했습니다. 전체적으로 우리는 미토콘드리아 국소화 및 세포주기 키나아제의 활성을 연구하는 데 사용할 수 있는 다양한 접근 방식을 보여주었습니다. 이는 발전되었지만 따라하기 쉬운 방법으로 많은 세포 생물학 연구자에게 도움이 될 것입니다.

CyclinB1과는 Cdk1의 하위 미토콘드리아 현지화 탄산나트륨 추출 단백질이 미토콘드리아의 내부 또는 외부 표면, 즉, 외막에 위치하는지 여부를 결정하는데 사용된다. 단백질이 미토콘드리아 안에 지역화 도시되면 서브 미토콘드리아 지역화 상기 판정 프로테아제 소화 결합 mitoplasting 통해 이루어질 수있다. CyclinB1 또는는 Cdk1의 서브 미토콘드리아 현지화를 지정하려면 mitoplasts 25 밀리미터에 200 밀리미터의 삼투압 자당의 농도를 감소와 저장성 버퍼의 미토콘드리아를 희석하여 분리 하였다. 내막은 자당의 25 mM의 (그림 1A)의 최종 농도가 될 때까지 그대로 유지하면서 외막은 자당 150 밀리미터에서 파열하기 시작합니다. mitoplasting와 조합 프로테아제 보호 t...

여기에서는 (세포주기) 키나아제의 미토콘드리아 국소화를 연구하는 방법과 미토콘드리아 아래 위치 및 잠재적인 미토콘드리아 기질/표적을 결정하는 방법을 간략하게 설명합니다. 단백질을 미토콘드리아로 강제 발현하는 것은 관심 단백질의 미토콘드리아 국소화의 기능적 결과를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

다음 절차의 전체적인 목표는 일반적으로 핵에 존재하는 세포 주기 키나아제의 미토콘드리아 내 국소화를 결정하고, 이러한 미토콘드리아 국소화가 세포 주기의 진행에 어떤 영향을 미치는지 분석하는 것입니다. 이 방법은 세포 주기 동안 핵이 미토콘드리아와 어떻게 소통하는지와 같은 미토콘드리아 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질에 미토콘드리아 표적 서열을 부착함으로써, 미토콘드리아 내에서 단백질을 특이적으로 과발현시켜 그 미토콘드리아 특이적 기능을 연구할 수 있습니다.이 방법은 특정 단백질의 미토콘드리아 타겟팅에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 핵, 소포체(ER), 골지체 및 리소좀과 같은 다른 세포 소기관에도 적용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 배양, 균질화 및 펠렛화한 후, 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 그리고 시료를 7,000 g, 4 °C에서 10분 동안 원심 분리합니다.그 다음 200 µL의 차가운 IBC 버퍼를 사용하여 펠렛을 재현탁하고, 균질액을 두 개의 분주액으로 나눕니다. 샘플을 7,000 g, 4 °C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 그리고 세척 과정을 반복합니다.상층액을 제거한 후, 펠렛 중 하나에 세포 용해 버퍼 30 µL를 첨가하고, 면역블롯 분석을 위해 용해물을 80 °C에서 보관합니다. 용해성 단백질과 막 결합 단백질을 분리하기 위해 두 번째 펠렛으로 탄산나트륨 추출을 수행하려면, 0.1 M 탄산나트륨(pH 11.0) 250 µL를 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 100,000 g에서 20분 동안 원심분리합니다.그런 다음 상층액을 수집하고, 단백질을 침전시키기 위해 갓 제조한 20% trichloroacetic acid를 동일한 부피로 첨가합니다. 30분 동안 얼음에 보관하십시오. 그동안 펠릿에 30 µL의 세포 용해 버퍼를 첨가하고, 텍스트 프로토콜에 따라 초음파 처리한 후 면역블로팅을 위해 -80 °C에서 보관하십시오.30분간의 TCA 배양 후, 반응물을 15,000 g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 버린 후, 80 µL의 세포 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포에서 미토콘드리아 분획을 분리한 후, 미토콘드리아 분획을 10개의 동일한 분량으로 나눕니다.7,000 g, 4 °C에서 10분 동안 샘플을 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. trypsin 포함 여부에 따라 다양한 농도의 저장성 sucrose 버퍼 30 µL를 사용하여 각 펠렛을 용해시킵니다. 그 후 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.트립신 소화를 중단시키기 위해 트립신이 포함된 바이알에 10 millimolar PMSF 3 µL를 첨가합니다. 그리고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 14,000 g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.그리고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 용해하기 위해 30 µL의 세포 용해 버퍼를 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 초음파 처리하고 80 °C에서 보관합니다.미토콘드리아 표적 GFP/RFP 태그 cyclinB-1 Cdk-1 벡터를 구축하려면, 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 인간 cytochrome-c oxidase subunit 8A 전구체에서 미토콘드리아 표적 서열을 클로닝하고, pEGFP-N1 또는 pERFP-N1의 Nhe1 및 bAmH1 부위에서 GFP 또는 RFP의 n-말단과 프레임을 맞춥니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 프라이머를 사용하여 표준 기술에 따라 Cdk1 및 cyclinB1 유전자를 증폭합니다. 그다지 BamH1을 사용하여 PCR 생성물을 절단합니다.1% agarose gel에서 반응물을 전기영동한 후, 면도날을 사용하여 적절한 크기의 DNA 단편을 절단합니다. 그다음 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다. 이어서 1 µg의 MTS-pEGFP-N1 및 MTS-pERFP-N1 플라스미드를 1 µL의 BamH1으로 37 °C에서 2시간 동안 제한효소 처리합니다.그다음 1 µL의 송아지 장 알칼리성 포스파타아제(calf intestinal alkaline phosphatase)를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 앞서 설명한 대로 1% 아가로스 겔에서 소화 산물을 전기영동하고 DNA를 정제한 후, 텍스트 프로토콜에 나열된 시약을 사용하여 라이게이션 반응을 준비합니다. 그런 다음 반응물을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.ligation 혼합물 10 µL를 사용하여 e. coli dH5-alpha competent cells를 형질전환합니다. 그리고 10 mg/mL의 kanamycin이 첨가된 LB agar 플레이트에서 37 °C로 하룻밤 동안 박테리아를 배양합니다.다음 날, 멸균된 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 콜로니를 하나 선택합니다. 그리고 5 mL의 LB kanamycin이 들어 있는 튜브에 팁을 넣습니다. 배양액을 하룻밤 동안 배양하고, 다음 날 아침에 텍스트 프로토콜에 따라 mini prep 키트를 사용하여 플라스미드를 분리합니다.지수 성장기의 MCF-10A 세포를 형질전환시키기 위해, Cdk1 또는 cyclinB-1 플라스미드를 사용하여 혈청 및 항생제가 없는 배지 100 microliters 내에서 1:2 비율로 플라스미드 형질전환 시약을 준비합니다. 세포를 형질전환시킨 후 37 degrees Celsius에서 48시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미토콘드리아를 염색하고 시각화합니다.세포 분리를 수행하려면, 2.5 mL의 혈청 및 항생제 무첨가 배지로 준비한 DNA와 transfection 시약의 1:2 비율을 사용하여 6-well 플레이트 내의 2 x 10⁵개 세포에 원하는 벡터를 transfection합니다. transfection 후 48시간 동안 배양한 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 유세포 분석법을 사용하여 GFP 태그가 붙은 Cdk-1 및 RFP 태그가 붙은 cyclinB1 단백질을 안정적으로 발현하는 세포를 live-sort로 분리합니다. EdU 라벨링 유세포 분석법을 사용하여 세포 주기 길이를 측정하려면, 분리된 세포를 6-well 플레이트에 well당 2.5 x 10⁵개 밀도로 seeding합니다.하룻밤 동안 배양한 후, 최종 농도가 25 micromolar가 되도록 배양액에 EdU를 첨가하고 1시간 더 배양합니다. 그 후 2시간 간격으로 1% BSA가 포함된 500 microliters의 PBS를 사용하여 세포가 담긴 웰 하나를 세척합니다. 그리고 1.5-milliliter 튜브에 수집합니다.세포를 350 g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후 상층액을 제거합니다. 고정액 100 microliters를 첨가하여 펠렛을 풀어줍니다.잘 섞은 후 상온에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, PBS에 1% BSA를 함유한 용액 1 milliliter를 사용하여 세포를 3회 세척합니다. 그 후 70% ethanol 0.5 milliliters를 사용하여 4 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 세포를 고정합니다.GFP 및 RFP 태그 단백질이 transfection된 세포로 EdU 라벨링을 수행할 때, GFP와 RFP의 형광 신호를 소광시키는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해 70% ethanol을 사용하여 세포를 하룻밤 동안 고정하는 단계를 추가합니다. 다음 날, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 세척하고 투과화한 후, 각 튜브에 0.5 milliliters의 반응 칵테일을 넣고 잘 섞어줍니다.암소에서 배양하고 다시 한 번 세척한 후, 1% BSA PBS에 희석된 50 µg/mL의 propidium iodide(PI)를 사용하여 DNA를 염색합니다. 유세포 분석법으로 세포를 분석하여 EdU 양성 집단을 추적합니다. DNA 함량과 EdU로 염색된 EdU 표지 세포의 산점도를 제시합니다.670 30-bandpass 필터를 사용하여 Alexa 647 EdU를 위한 APC 채널을 설정하며, 해당 필터에는 685 nanometers 미만의 모든 빛이 도달하도록 합니다. 또한 PI를 위한 phycoerythrin 채널에는 581 15-bandpass 필터를 배치하며, 해당 필터에는 600 nanometers 미만의 모든 빛이 도달하도록 설정합니다. 데이터 수집을 위한 표준 게이팅 전략에 따라, 먼저 형태학적 분석을 위해 FSC area와 SSC area를 플롯하고, 이어서 세포 염색 확인을 위해 PI와 Alexa 647 EdU를 플롯합니다. 모든 튜브의 데이터를 순차적으로 기록하며, 샘플당 10,000 events를 수집합니다.이 그림에서 미토콘드리아 기질 단백질인 Hsp60과 막간 공간 단백질인 Timm13이 미토콘드리아 내 국소화 마커로 사용되었습니다. cyclinB1과 Cdk1은 Timm13과는 달리 Hsp60과 유사하게 trypsin 소화로부터 보호되었으며, 이는 이들이 미토콘드리아 기질에 국소화됨을 나타냅니다. 여기에 표시된 바와 같이, MTS 및 GFP 태그가 붙은 cyclinB1 및 Cdk-1 구조체를 사용하여 분리된 미토콘드리아 분획을 Western blotting으로 분석한 결과, 미토콘드리아 내에서 cyclinB1 및/또는 Cdk-1의 과발현이 이루어졌음을 확인하였습니다.EdU 펄스 체이스 분석법을 사용하여, 야생형 미토콘드리아 cyclinB1 Cdk-1을 발현하는 세포에서는 라벨링된 S기 세포가 G2M기를 거쳐 이르면 4시간 만에 G1기에 나타나는 것이 입증되었습니다. 이는 벡터 대조군이나 돌연변이 cyclinB1 Cdk-1을 형질전환시킨 세포에서 6시간이 걸린 것과 대비되는 결과로, 미토콘드리아 cyclinB1 Cdk-1의 강화가 세포 주기 진행을 가속화한다는 것을 나타냅니다. 본 절차 이후에, 세포 주기 키나아제 Cdk-1의 미토콘드리아 국소화가 미토콘드리아 호흡 및 에너지 출력에 어떠한 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 미토콘드리아 ATP 생성, 산소 소비, 막 전위 및 활성 산소종 측정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 핵 키나아제(nuclear kinase)의 미토콘드리아 국소화와 미토콘드리아 특이적 기능을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

experimental-approaches-to-study-mitochondrial-localization-function

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

안달 기반 기자 점점 라이브 세포 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링하는 데 사용됩니다. 여기 대상 인산화에서 세포주기 종속 변화를 평가하기 위해 안달 기반의 기자를 사용하는 방법에 대한 방법을 설명합니다.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 - 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

미토콘드리아 기능의 조절 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 미토콘드리아 구조-기능 관계에 대한 분석이 필요합니다. 살아 있고 고정된 초파리 난소에서 미토콘드리아 구조와 기능을 연구하는 구체적인 방법이 이 논문에 설명되어 있고 시연됩니다.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 초파리 난소

이 프로토콜은 세포 분화 및 Xenopus 배아 발달 동안 mitogen - 활성화 단백질 키니 아제 (MAPK) 활동을 조절하는 optogenetic 전략을 설명합니다. 이 방법은 포유류 세포 배양 및 높은 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 Xenopus 태아와 같은 다세포 생균에서 MAPK 신호 전달 경로의 가역적 활성화를 허용한다.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

 종속 키 1 (Cdk1) 세포 주기의 g 2 단계에서 활성화 되 고 많은 세포 경로 조절. 여기, Cdk1, Cdk1-특정 한 인 산화 위치의 식별이 중요 한 키의 셀룰러 목표 설정에 대 한 수와 함께 체 외에 니 분석 결과 대 한 프로토콜 선물이.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

베이커의 효모 미토콘드리아 게놈은 8개의 폴리펩티드를 인코딩합니다. 현재 프로토콜의 목표는 모든 프로토콜에 레이블을 지정한 다음 별도의 대역으로 시각화하는 것입니다.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

경미토콘드리아 사이브리드는 미토콘드리아 장애에 의해 영향을 받는 환자로부터 유래된 세포플라스트(enucleated cells)와 미토콘드리아 DNA(mtDNA)-고갈 세포(rho0 cells)를 융합시켜 얻은 하이브리드 세포이다. 그들은 질병의 핵 또는 미토콘드리아 기원의 결정, 생화학 적 활성의 평가 및 mtDNA 관련 변이체의 병원성 역할의 확인을 허용합니다.

미토콘드리아 기능 장애를 연구하기위한 체외 접근법 : Cybrid 모델

이 프로토콜은 노화 중 예쁜꼬마선충 의 여러 조직에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

이 기사에서는 Dendra2 광전환 형광을 통해 미토콘드리아 핵분열/융합 역학을 평가하기 위해 공초점 현미경 및 ImageJ를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

신장 근위 세뇨관 세포에서 미토콘드리아 분열/융합 역학 평가

학습하세요 미토콘드리아에 국소화된 세포주기 키나아제 Cdk1의 기능을 연구하는 실험 방법을. 이 기법은 미토콘드리아 기질 표적화와 세포주기 진행 분석에 활용됩니다.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

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