실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

다음 절차의 전반적인 목표는 정상적인 핵 세포주기 키나아제의 제출 콘드리아 국소화를 결정한 다음 미토콘드리아 국소화가 세포주기의 진행에 어떤 영향을 미치는지 분석하는 것입니다. 이 방법은 세포주기 동안 핵이 미토콘드리아와 어떻게 통신하는지와 같은 미토콘드리아 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질에 미토콘드리아 선행 염기서열을 태그하면 미토콘드리아의 단백질에서 특이적으로 과발현을 활용할 수 있으므로 미토콘드리아 특이적 기능을 연구할 수 있습니다.

이 방법은 특정 단백질의 미토콘드리아 표적화에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 핵, ER, 골기 및 리소좀과 같은 다른 소기관에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 배양, 균질화 및 펠릿화한 후 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 그리고 10 분 동안 7, 000 g 및 4 섭씨 온도에서 샘플을 원심 분리하십시오.

그런 다음 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 IBC 완충액을 사용하여 펠릿을 재현탁하고 균질액을 두 개의 분취액으로 나눕니다. 샘플을 7, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 그리고 세탁을 반복하십시오.

상등액을 버린 후 펠릿 중 하나에 30마이크로리터의 세포 용해 완충액을 추가하고 면역 블로팅을 위해 용해물을 섭씨 80도에서 보관합니다. 두 번째 펠릿으로 탄산나트륨 추출을 수행하여 수용성 단백질과 멤브레인 결합 단백질을 분리하려면 pH 11.0의 0.1몰 탄산나트륨 250마이크로리터를 추가하고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 100, 20 분 동안 000 g에서 원심 분리기.

그런 다음 상등액을 수집하고 갓 만든 20% 트리클로로아세트산을 동일한 부피로 첨가하여 단백질을 침전시킵니다. 얼음 위에 30분 동안 보관합니다. 그 동안, 펠릿에 30마이크로리터의 세포 용해 완충액을 추가하고 텍스트 프로토콜에 따라 초음파 처리한 후 면역 블로팅을 위해 섭씨 80도에서 보관합니다.

30분 TCA 배양 후 15, 000g에서 10분 동안 반응을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 80마이크로리터의 세포 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포에서 미토콘드리아 분획을 분리한 후, 미토콘드리아 분획을 10개의 동일한 부분으로 분리합니다.

샘플을 7, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 펠렛으로 만듭니다. 트립신이 있거나 없는 다양한 농도의 저장성 자당 완충액 30마이크로리터를 사용하여 각 펠릿을 용해합니다. 그리고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

트립신 함유 바이알에 10밀리몰 PMSF 3마이크로리터를 첨가하여 트립신 분해를 중지합니다. 그리고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 14, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.

그리고 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 용해하려면 30마이크로리터의 세포 용해 완충액을 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 초음파 처리하고 섭씨 80도에서 보관합니다.

미토콘드리아 표적 GFP/RFP 표지 cyclinB-1 Cdk-1 벡터를 구성하려면 인간 사이토크롬-c 산화효소 서브유닛 8A의 전구체에서 미토콘드리아 표적 염기서열을 복제하고 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 pEGFP-N1 또는 pERFP-N1의 Nhe1 및 bAmH1 부위에서 GFP 또는 RFP의 n-말단으로 프레임을 형성합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 프라이머를 사용하여 표준 기술에 따라 Cdk1 및 cyclinB1 유전자를 증폭합니다. 그런 다음 BamH1을 사용하여 PCR 산물을 소화합니다.

면도날을 사용하여 올바른 크기의 DNA 단편을 잘라내기 전에 1% 아가로스 젤에서 반응을 실행합니다. 그런 다음 겔 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다. 다음으로, 1마이크로그램의 MTS-pEGFP-N1 및 MTS-pERFP-N1 플라스미드를 섭씨 37도에서 2시간 동안 1마이크로리터의 BamH1으로 분해합니다.

그런 다음 1마이크로리터의 송아지 장 알칼리 포스파타아제를 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 1% 아가로스 겔에 분해 산물을 실행하고 방금 설명한 대로 DNA를 정제한 후 텍스트 프로토콜에 나열된 시약을 사용하여 결찰 반응을 설정합니다. 그런 다음 밤새 섭씨 4도에서 반응을 배양합니다.

대장균 dH5-알파 수용 세포를 10마이크로리터의 결찰 혼합물로 형질전환시킵니다. 그리고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 LB 한천과 카나마이신 10밀리그램을 더한 플레이트에서 박테리아를 성장시킵니다.

다음 날, 멸균 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 콜로니를 선택합니다. 그리고 팁을 LB 카나마이신 5ml가 들어있는 튜브에 삽입합니다. 하룻밤 동안 배양을 배양하고 다음 날 아침에 텍스트 프로토콜에 따라 미니 준비 키트를 사용하여 플라스미드를 분리합니다.

기하급수적으로 성장하는 MCF-10A 세포를 형질전환하려면 Cdk1 또는 cyclinB-1 플라스미드를 사용하여 100마이크로리터의 혈청과 무항생제 배지에서 1:2의 비율로 플라스미드 형질주입 시약을 준비합니다. 세포를 transfection하고 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미토콘드리아를 염색하고 시각화합니다.

세포 분류를 수행하기 위해 2.5ml의 혈청 및 무항생제 배지에서 제조된 DNA와 형질전환 시약을 1:2 비율로 사용하여 6웰 플레이트에서 원하는 벡터를 가진 세포를 2배 10에서 5번째 세포로 transfection합니다. transfection을 48시간 동안 배양한 후, 유세포 분석을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 GFP 태그가 지정된 Cdk-1 및 RFP 태그가 지정된 clyclinB1 단백질을 안정적으로 발현하는 세포를 라이브 분류합니다. EdU 라벨링 유세포 분석 분석을 사용하여 세포 주기 길이를 측정하기 위해 6웰 플레이트에서 웰당 5번째 세포에서 2.5배 10의 밀도로 세포를 시드 분류했습니다.

하룻밤 배양 후 최종 농도인 25마이크로몰로 배양 배지에 EdU를 추가하고 추가로 한 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 2시간 간격으로 500마이크로리터의 PBS에 1%BSA를 사용하여 세포 1웰을 세척합니다. 그리고 1.5 밀리리터 튜브에 모으십시오.

350g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버리십시오. 100마이크로리터의 고정 용액을 추가하여 펠릿을 제거합니다.

잘 섞어 실온에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, PBS에 1%BSA 1ml를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 0.5ml의 70% 에탄올을 사용하여 밤새 세포를 섭씨 4도에서 고정합니다.

GFP 및 RFP 표지 단백질로 transfection된 세포로 EdU 라벨링을 수행할 때는 GFP 및 RFP의 형광 신호를 소멸시키는 것이 중요합니다. 이를 위해 70% 에탄올을 사용하여 하룻밤 동안 세포를 고정하는 추가 단계를 추가합니다. 다음 날, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 세척하고 투과시킨 후 각 튜브에 0.5ml의 반응 칵테일을 넣고 잘 섞습니다.

어두운 곳에서 배양한 후 다시 한 번 세척한 후 프로피듐 요오드화물 밀리리터당 50마이크로그램 또는 1% BSA PBS의 PI를 사용하여 DNA를 염색합니다. 유세포 분석으로 세포를 분석하여 EdU 양성 집단을 추적합니다. DNA 함량 및 EdU에 대해 염색된 EdU 표지 세포의 산발된 점도표를 제시합니다.

모든 빛이 존재하는 670 30 대역 통과 필터를 사용하는 Alexa 647 EdU의 APC 채널은 685 나노미터 미만의 모든 빛이 해당 필터에 부딪히는 681 15 대역 통과 필터와 함께 PI의 phycoerythrin 채널을 사용합니다. 획득을 위한 표준 게이팅 전략을 사용하여 형태학을 위해 FSC 면적을 SSC 면적별로 플롯한 다음 세포 염색을 위해 Alexa 647 EdU로 PI를 플롯합니다. 모든 관을 위한 자료를 하나씩 기록해, 10 의 표본 당 000의 사건을 취득.

이 그림에서는 미토콘드리아 기질 단백질 Hsp60과 막간 공간 단백질 Timm13을 submitochondrial localization marker로 사용했습니다. Hsp60과 유사하지만 Timm13과 달리 cyclinB1 및 Cdk1은 트립신 소화로부터 보호되어 미토콘드리아 기질에 국한되어 있음을 나타냅니다. 여기에서 볼 수 있듯이, MTS 및 GFP 표지된 cyclinB1 및 Cdk-1 구조체를 사용하여 분리된 미토콘드리아 분획의 웨스턴 블로팅에 의해 미토콘드리아에서 cyclinB1 및/또는 Cdk-1의 과발현이 달성되었습니다.

EdU 펄스 추적 분석을 사용하여 표지된 S상 세포가 G2M 단계를 거쳐 야생형 미토콘드리아 cyclinB1 Cdk-1을 발현하는 세포에서 4시간 이내에 G1 단계로 나타나는 것을 입증했습니다. 6시간과 비교하여, 벡터 대조군 또는 돌연변이 cyclinB1 Cdk-1로 transfection된 세포에서 미토콘드리아 cyclinB1 Cdk-1의 향상이 세포주기 진행을 가속화함을 나타냅니다. 이 절차에 따라 미토콘드리아 ATP 생성, 산소 소비량, 막 전위 및 활성 산소 종과 같은 다른 방법을 측정하여 세포주기 키나아제 Cdk-1의 미토콘드리아 국소화가 미토콘드리아 호흡 및 에너지 출력을 어떻게 변화시키는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 미토콘드리아 국소화와 핵 키나아제의 미토콘드리아 특이적 기능을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.