실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

다음 절차의 전체적인 목표는 일반적으로 핵에 존재하는 세포 주기 키나아제의 미토콘드리아 내 국소화를 결정하고, 이러한 미토콘드리아 국소화가 세포 주기의 진행에 어떤 영향을 미치는지 분석하는 것입니다. 이 방법은 세포 주기 동안 핵이 미토콘드리아와 어떻게 소통하는지와 같은 미토콘드리아 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질에 미토콘드리아 표적 서열을 부착함으로써, 미토콘드리아 내에서 단백질을 특이적으로 과발현시켜 그 미토콘드리아 특이적 기능을 연구할 수 있습니다.

이 방법은 특정 단백질의 미토콘드리아 타겟팅에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 핵, 소포체(ER), 골지체 및 리소좀과 같은 다른 세포 소기관에도 적용될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 배양, 균질화 및 펠렛화한 후, 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 그리고 시료를 7,000 g, 4 °C에서 10분 동안 원심 분리합니다.

그 다음 200 µL의 차가운 IBC 버퍼를 사용하여 펠렛을 재현탁하고, 균질액을 두 개의 분주액으로 나눕니다. 샘플을 7,000 g, 4 °C에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 그리고 세척 과정을 반복합니다.

상층액을 제거한 후, 펠렛 중 하나에 세포 용해 버퍼 30 µL를 첨가하고, 면역블롯 분석을 위해 용해물을 80 °C에서 보관합니다. 용해성 단백질과 막 결합 단백질을 분리하기 위해 두 번째 펠렛으로 탄산나트륨 추출을 수행하려면, 0.1 M 탄산나트륨(pH 11.0) 250 µL를 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 100,000 g에서 20분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 상층액을 수집하고, 단백질을 침전시키기 위해 갓 제조한 20% trichloroacetic acid를 동일한 부피로 첨가합니다. 30분 동안 얼음에 보관하십시오. 그동안 펠릿에 30 µL의 세포 용해 버퍼를 첨가하고, 텍스트 프로토콜에 따라 초음파 처리한 후 면역블로팅을 위해 -80 °C에서 보관하십시오.

30분간의 TCA 배양 후, 반응물을 15,000 g에서 10분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 버린 후, 80 µL의 세포 용해 완충액을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포에서 미토콘드리아 분획을 분리한 후, 미토콘드리아 분획을 10개의 동일한 분량으로 나눕니다.

7,000 g, 4 °C에서 10분 동안 샘플을 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. trypsin 포함 여부에 따라 다양한 농도의 저장성 sucrose 버퍼 30 µL를 사용하여 각 펠렛을 용해시킵니다. 그 후 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

트립신 소화를 중단시키기 위해 트립신이 포함된 바이알에 10 millimolar PMSF 3 µL를 첨가합니다. 그리고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 샘플을 14,000 g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.

그리고 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 용해하기 위해 30 µL의 세포 용해 버퍼를 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 초음파 처리하고 80 °C에서 보관합니다.

미토콘드리아 표적 GFP/RFP 태그 cyclinB-1 Cdk-1 벡터를 구축하려면, 표준 분자 클로닝 기술을 사용하여 인간 cytochrome-c oxidase subunit 8A 전구체에서 미토콘드리아 표적 서열을 클로닝하고, pEGFP-N1 또는 pERFP-N1의 Nhe1 및 bAmH1 부위에서 GFP 또는 RFP의 n-말단과 프레임을 맞춥니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 프라이머를 사용하여 표준 기술에 따라 Cdk1 및 cyclinB1 유전자를 증폭합니다. 그다지 BamH1을 사용하여 PCR 생성물을 절단합니다.

1% agarose gel에서 반응물을 전기영동한 후, 면도날을 사용하여 적절한 크기의 DNA 단편을 절단합니다. 그다음 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 정제합니다. 이어서 1 µg의 MTS-pEGFP-N1 및 MTS-pERFP-N1 플라스미드를 1 µL의 BamH1으로 37 °C에서 2시간 동안 제한효소 처리합니다.

그다음 1 µL의 송아지 장 알칼리성 포스파타아제(calf intestinal alkaline phosphatase)를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 앞서 설명한 대로 1% 아가로스 겔에서 소화 산물을 전기영동하고 DNA를 정제한 후, 텍스트 프로토콜에 나열된 시약을 사용하여 라이게이션 반응을 준비합니다. 그런 다음 반응물을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

ligation 혼합물 10 µL를 사용하여 e. coli dH5-alpha competent cells를 형질전환합니다. 그리고 10 mg/mL의 kanamycin이 첨가된 LB agar 플레이트에서 37 °C로 하룻밤 동안 박테리아를 배양합니다.

다음 날, 멸균된 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 콜로니를 하나 선택합니다. 그리고 5 mL의 LB kanamycin이 들어 있는 튜브에 팁을 넣습니다. 배양액을 하룻밤 동안 배양하고, 다음 날 아침에 텍스트 프로토콜에 따라 mini prep 키트를 사용하여 플라스미드를 분리합니다.

지수 성장기의 MCF-10A 세포를 형질전환시키기 위해, Cdk1 또는 cyclinB-1 플라스미드를 사용하여 혈청 및 항생제가 없는 배지 100 microliters 내에서 1:2 비율로 플라스미드 형질전환 시약을 준비합니다. 세포를 형질전환시킨 후 37 degrees Celsius에서 48시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미토콘드리아를 염색하고 시각화합니다.

세포 분리를 수행하려면, 2.5 mL의 혈청 및 항생제 무첨가 배지로 준비한 DNA와 transfection 시약의 1:2 비율을 사용하여 6-well 플레이트 내의 2 x 10⁵개 세포에 원하는 벡터를 transfection합니다. transfection 후 48시간 동안 배양한 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 유세포 분석법을 사용하여 GFP 태그가 붙은 Cdk-1 및 RFP 태그가 붙은 cyclinB1 단백질을 안정적으로 발현하는 세포를 live-sort로 분리합니다. EdU 라벨링 유세포 분석법을 사용하여 세포 주기 길이를 측정하려면, 분리된 세포를 6-well 플레이트에 well당 2.5 x 10⁵개 밀도로 seeding합니다.

하룻밤 동안 배양한 후, 최종 농도가 25 micromolar가 되도록 배양액에 EdU를 첨가하고 1시간 더 배양합니다. 그 후 2시간 간격으로 1% BSA가 포함된 500 microliters의 PBS를 사용하여 세포가 담긴 웰 하나를 세척합니다. 그리고 1.5-milliliter 튜브에 수집합니다.

세포를 350 g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 그 후 상층액을 제거합니다. 고정액 100 microliters를 첨가하여 펠렛을 풀어줍니다.

잘 섞은 후 상온에서 15분 동안 배양합니다. 다음으로, PBS에 1% BSA를 함유한 용액 1 milliliter를 사용하여 세포를 3회 세척합니다. 그 후 70% ethanol 0.5 milliliters를 사용하여 4 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 세포를 고정합니다.

GFP 및 RFP 태그 단백질이 transfection된 세포로 EdU 라벨링을 수행할 때, GFP와 RFP의 형광 신호를 소광시키는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해 70% ethanol을 사용하여 세포를 하룻밤 동안 고정하는 단계를 추가합니다. 다음 날, 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 세척하고 투과화한 후, 각 튜브에 0.5 milliliters의 반응 칵테일을 넣고 잘 섞어줍니다.

암소에서 배양하고 다시 한 번 세척한 후, 1% BSA PBS에 희석된 50 µg/mL의 propidium iodide(PI)를 사용하여 DNA를 염색합니다. 유세포 분석법으로 세포를 분석하여 EdU 양성 집단을 추적합니다. DNA 함량과 EdU로 염색된 EdU 표지 세포의 산점도를 제시합니다.

670 30-bandpass 필터를 사용하여 Alexa 647 EdU를 위한 APC 채널을 설정하며, 해당 필터에는 685 nanometers 미만의 모든 빛이 도달하도록 합니다. 또한 PI를 위한 phycoerythrin 채널에는 581 15-bandpass 필터를 배치하며, 해당 필터에는 600 nanometers 미만의 모든 빛이 도달하도록 설정합니다. 데이터 수집을 위한 표준 게이팅 전략에 따라, 먼저 형태학적 분석을 위해 FSC area와 SSC area를 플롯하고, 이어서 세포 염색 확인을 위해 PI와 Alexa 647 EdU를 플롯합니다. 모든 튜브의 데이터를 순차적으로 기록하며, 샘플당 10,000 events를 수집합니다.

이 그림에서 미토콘드리아 기질 단백질인 Hsp60과 막간 공간 단백질인 Timm13이 미토콘드리아 내 국소화 마커로 사용되었습니다. cyclinB1과 Cdk1은 Timm13과는 달리 Hsp60과 유사하게 trypsin 소화로부터 보호되었으며, 이는 이들이 미토콘드리아 기질에 국소화됨을 나타냅니다. 여기에 표시된 바와 같이, MTS 및 GFP 태그가 붙은 cyclinB1 및 Cdk-1 구조체를 사용하여 분리된 미토콘드리아 분획을 Western blotting으로 분석한 결과, 미토콘드리아 내에서 cyclinB1 및/또는 Cdk-1의 과발현이 이루어졌음을 확인하였습니다.

EdU 펄스 체이스 분석법을 사용하여, 야생형 미토콘드리아 cyclinB1 Cdk-1을 발현하는 세포에서는 라벨링된 S기 세포가 G2M기를 거쳐 이르면 4시간 만에 G1기에 나타나는 것이 입증되었습니다. 이는 벡터 대조군이나 돌연변이 cyclinB1 Cdk-1을 형질전환시킨 세포에서 6시간이 걸린 것과 대비되는 결과로, 미토콘드리아 cyclinB1 Cdk-1의 강화가 세포 주기 진행을 가속화한다는 것을 나타냅니다. 본 절차 이후에, 세포 주기 키나아제 Cdk-1의 미토콘드리아 국소화가 미토콘드리아 호흡 및 에너지 출력에 어떠한 영향을 미치는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 미토콘드리아 ATP 생성, 산소 소비, 막 전위 및 활성 산소종 측정과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 핵 키나아제(nuclear kinase)의 미토콘드리아 국소화와 미토콘드리아 특이적 기능을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.