생체모방 비드를 사용한 박테리아-숙주 세포 상호 작용 평가

포유류 상피 세포 배양물이 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져 와십시오.

테스트 웰에 박테리아 표면 단백질에 결합된 폴리머 비드와 함께 박테리아 병원체를 추가합니다.

대조군 웰에 박테리아 표면 단백질이 부족한 병원체와 비드를 추가합니다. 인큐베이트.

테스트 웰에서 비드는 박테리아 표면을 모방하고 상피 세포막 포스파티딘산에 결합하기 위해 병원체와 경쟁하여 박테리아 부착을 감소시킵니다.

제어 우물에서 구슬은 박테리아 부착에 영향을 미치지 않습니다.

배지를 제거하고 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 성분을 제거합니다.

비이온성 세제와 함께 배양하여 세포를 용해하고 막에 부착된 박테리아와 비드를 방출합니다.

용해물을 피펫팅하여 균질한 현탁액을 만들고 완충액을 사용하여 균질액을 연속적으로 희석합니다.

희석액을 한천 플레이트에 옮기고 콜로니 형성을 허용하도록 배양한 다음 콜로니 수를 계산합니다.

테스트 플레이트는 대조군보다 적은 수의 콜로니를 나타내며 이는 박테리아-숙주 상호 작용이 감소했음을 나타냅니다.

박테리아 배양액을 첨가물 없이 무색 DMEM으로 희석하여 감염 배지를 준비합니다.

섭씨 37도로 예열하여 10% 부피 대 부피 비드 현탁액을 함유했습니다. MOI를 10으로 제공하려면 웰당 1밀리리터와 샘플당 10-20%의 과잉 부피를 준비합니다. 웰에서 오래된 배지를 제거하고 섭씨 37도로 예열된 멸균 PBS 1밀리리터를 각 웰에 추가하여 배양된 HeLa 세포를 세척합니다. PBS를 제거하고 웰당 1밀리리터의 감염 배지를 추가합니다. 대조군 비드와 박테리아를 포함하는 용액을 양성 대조군으로, 접착 비드와 박테리아가 없는 용액을 음성 대조군으로 추가합니다.

0.1% Triton X 100을 함유한 DMEM을 용해 대조군으로 첨가합니다.

를 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 배양합니다.

박테리아 부착 측정은 감염 후 1시간 후에 이루어집니다. 세포층에서 배지를 제거하고 멸균된 예열된 PBS로 세포층을 철저히 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 매번 1밀리리터의 PBS로 최소 3-4회 세척하십시오. PBS에 멸균 1% 부피 대 부피 Triton X 100 용액 1밀리리터를 각 웰에 첨가하여 숙주 세포를 용해합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.

각 웰의 내용물을 별도의 1.5밀리리터 튜브로 옮기기 전에 각 샘플을 위아래로 여러 번 피펫팅합니다. 멸균 PBS에 샘플의 10배 연속 희석액을 준비합니다. 해양 LB 한천에 각 샘플의 100마이크로리터를 도금하고 세포 스프레더를 사용하여 퍼뜨립니다. 박테리아 균주 및 시점에 따라 도금할 희석액을 최적화합니다.

이 실험 설정의 경우 10에서 5배 또는 10에서 6배 희석하면 적절한 수의 CFU가 제공됩니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 콜로니 카운팅으로 박테리아를 열거합니다.