간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

이 비디오는 간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 구슬의 췌장섬과 같은 포유류 세포를 고정시키는 방법을 설명합니다. 이 방법의 원리는 물과 오일 에멀젼에 의해 알긴산 액적을 생성한 다음 알긴산 액적의 내부 겔화를 생성하는 것입니다. 절차의 첫 번째 단계는 알긴산 세포와 탄산칼슘을 포함하는 수성상이 미네랄 오일 유기상에 분산되는 에멀젼을 생성하는 것으로 구성됩니다.

두 번째 단계는 아세트산과 같은 지용성 산을 첨가하여 에멀젼을 산성화하는 것인데, 이 산은 수성상으로 빠르게 분할됩니다. pH 강하는 탄산칼슘의 용해로 이어지며 알긴산 방울의 내부 겔화로 이어집니다. 마지막 단계는 수용액을 첨가하여 에멀젼에서 비드를 회수하고, 원심분리로 상을 분리한 다음, 비드를 세척하고 여과하는 것으로 구성됩니다.

그런 다음 고정된 세포를 시험관내에서 배양하거나 이식에 사용할 수 있습니다. 우리가 설명한 방법은 노즐 기반 세포 캡슐화기를 사용하여 알긴산 비드를 생성하는 것의 대안입니다. 이것은 1992년 Poncelet과 다른 사람들에 의해 처음 보고된 효소 및 미생물 세포 고정화 방법에서 파생되었습니다.

우리가 가장 관심을 갖는 응용 분야는 이식된 세포를 면역분리하는 수단으로 알긴산 캡슐화를 사용하여 거부 반응 방지 약물의 필요성을 줄이거나 제거하는 것입니다. 노즐 기반 장치에 비해 에멀젼 기반 공정의 주요 장점은 확장성과 견고성입니다. 액적이 거의 동시에 생성되기 때문에 매우 희석되거나 매우 농축된 알긴산 용액에서 매우 짧은 시간 내에 매우 많은 양의 비드를 생산할 수 있습니다.

또한 공정은 매우 견고하고 고장이 발생하지 않으며 노즐을 방해할 수 있는 입자가 있는 경우에도 공정 장비가 매우 간단하여 대부분의 실험실에서 매우 상대적으로 저렴하게 접근할 수 있습니다. 주요 가공 단계는 알긴산 방울을 형성하기 위한 유화와 내부 칼슘 공급원을 방출하기 위한 산성화입니다. 액적 크기는 주로 임펠러 설계, 교반 속도 및 교반 지속 시간의 영향을 받습니다.

구슬의 기계적 특성과 세포 생존은 산성화의 정도와 기간에 의해 영향을 받습니다. 이 비디오에서는 이식을 위해 세포를 5%알긴산 비드로 캡슐화하는 데 사용되는 방법을 보여줍니다. 이러한 매개변수는 다른 잠재적 응용 분야에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.

LVM과 MVG 알긴산의 반/반 혼합물을 함유한 5%알긴산 비드를 생성하려면 LVM 583밀리그램과 MVG 알긴산 분말의 무게를 583밀리그램 측정해야 합니다. 20mL 공정 완충액을 마그네틱 교반 플레이트에 놓습니다. 이식 응용 분야의 경우 pH 7.4에서 170 밀리몰 염화나트륨을 함유한 10 밀리몰 HEPES 버퍼를 사용합니다.

용액에 알긴산 분말을 점진적으로 첨가하십시오. 용액을 저속으로 밤새 저어줍니다. 필요한 경우 플라스크를 교반 플레이트에 고정합니다.

다음날 알긴산이 불완전하게 용해되면 항아리를 회전식 믹서에 고정하고 섭씨 37도에서 밤새 계속 혼합합니다. 알긴산이 완전히 용해되면 30분 동안 고압증기멸균으로 용액을 살균합니다. 오토클레이브를 열기 전에 온도가 섭씨 50도 이하로 떨어지도록 하십시오.

20ml 공정 완충액에 탄산칼슘 1g을 첨가하여 탄산칼슘 현탁액을 준비합니다. 탄산칼슘 현탁액과 에멀젼 공정에 사용되는 교반 용기를 오토클레이브합니다. 사용하기 전에 용기에서 응축수의 흔적을 제거하십시오.

에멀젼 공정 직전에 44 밀리리터 원추형 튜브에 넣은 11 밀리리터 미네랄 오일에 50 마이크로 리터 빙초산을 용해시킵니다. 흔한 실수는 아세트산의 불완전한 용해, 10 마이크로리터 미만의 피펫팅 피험, 반복적인 와류에 의해 산이 완전히 용해되도록 하는 것입니다. 세포 캡슐화를 진행하기 전에 모든 용액이 실온에 도달하도록 합니다.

스피너 플라스크에 10ml의 미네랄 오일을 넣고 250RPM으로 저어주기 시작합니다. 베타-tc3 세포와 같은 부착 세포를 사용하는 경우 세포를 트립신화합니다. 완전한 배지를 추가하여 반응을 종료하고 세포 계수를 위해 샘플을 채취합니다.

세포 농도를 수동으로 또는 자동화된 세포 계수기를 사용하여 측정합니다. 300g에서 7분 동안 세포를 원심분리한 다음 세포 팔레트를 완전한 배지에 재현탁합니다. 원심분리 단계를 반복한 다음 적절한 부피의 완전한 배지에서 세포를 재현탁시켜 비드에서 원하는 최종 농도를 10 및 1/2 폴

9.9 밀리리터의 알긴산 용액을 평평한 바닥 튜브로 옮긴 다음 1.1 밀리리터의 셀 스톡과 550 마이크로 리터의 탄산 칼슘 현탁액을 첨가합니다. 알긴산염, 탄산칼슘 및 세포 현탁액을 가벼운 와류로 혼합합니다. 즉시 주사기를 사용하여 이 혼합물 10.5ml를 교반 오일에 옮깁니다.

교반 속도를 높인 다음 타이머를 시작하십시오. 교반 속도를 측정하려면 먼저 비드 크기와 교반 속도와 관련된 표준 곡선을 생성해야 합니다. 12분 후 10ml의 오일과 아세트산 용액을 첨가하여 에멀젼을 산성화하고 탄산염에서 칼슘을 방출하며 겔화된 비드를 얻습니다.

이 내부 겔화 단계에 8분을 허용합니다. 페놀 레드 pH 지시약을 포함하는 유화 방울의 색상 변화를 주목하십시오. 교반 속도를 400 RPM으로 낮추고 10% 매체와 혼합된 40ml의 공정 완충액을 첨가하여 산을 중화하면 상 반전이 발생합니다.

1분 후에 교반을 멈추고 혼합물을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 스피너 플라스크를 20ml의 매체로 헹구고 튜브에 추가합니다. 유상을 흡인하기 전에 가능한 한 많은 수용액을 흡인하십시오.

630g에서 3분 동안 튜브를 원심분리하여 비드 침강 및 상 분리를 가속화합니다. 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 오일과 과도한 공정 완충액을 제거합니다. 세척 사이에 630g의 원심분리를 사용하여 중간으로 비드를 한 번 이상 세척합니다.

40미크론 나일론 셀 스트레이너의 비드 현탁액을 여과하고 아래에서 스트레이너의 과도한 액체를 흡입합니다. 주걱을 사용하여 비드를 알려진 부피의 배지로 옮깁니다. 비드 부피를 측정하고 배지를 보충하여 원하는 비드 농도를 얻습니다.

일반적인 농도는 총 부피 5밀리리터당 1밀리리터 비드입니다. 이 시점부터는 비드가 손상되지 않도록 항상 큰 구멍의 피펫으로 비드를 다루십시오. 캡슐화된 세포는 이제 T 플라스크로 옮겨져 체외 배양 또는 이식에 사용할 수 있습니다.

에멀젼 공정이 끝나면 고정화된 세포를 포함하는 알긴산 비드를 얻어야 합니다. 이 과정이 끝나면 비드 크기 분포와 세포 생존율을 정기적으로 평가해야 합니다. 비드 크기 분포를 결정하기 위해 비드를 톨루이딘 블루로 염색한 다음 이미지 분석을 수행할 수 있습니다.

이 과정에서 광범위한 비드 크기 분포가 예상됩니다. 세포 생존을 평가하기 위해 비드는 calcein-AM 및 ethidium homodimer와 같은 살아있는 죽은 염색체와 함께 배양할 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 프로세스를 사용하여 76%의 beta-tc3 세포 생존을 측정했습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 간단한 교반 시스템을 사용하여 알긴산 비드에서 포유류 세포를 고정시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 비디오에 표시된 기본 프로토콜은 광범위한 알긴산 유형 및 석회화를 사용하여 다양한 세포 유형을 고정시키는 데 적합해야 합니다. 평균 비드 크기를 알긴산 또는 오일의 모든 새로운 로트에 대한 교반 속도와 관련된 표준 곡선을 생성하는 것이 좋습니다.

우리가 설명한 유화 공정은 노즐 기반 세포 캡슐화기에 대한 유망한 대안입니다. 이는 알긴산 비드에서 포유류 세포를 고정시키는 강력하고 간단한 방법입니다. 우리와 전 세계의 다른 사람들이 노즐 세포 치료법을 개발함에 따라 수천 명의 당뇨병 환자를 위해 이러한 규모의 방법이 필요할 것입니다.

당사는 5%알긴산 비드에 베타 세포주를 이식하여 얻은 유망한 결과를 발표했으며, 이식 거부에 대한 이 개선된 장벽의 생체 내 성능을 계속 연구하고 있습니다.