Name: 간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 배우세요 간단한 교반 용기를 사용하여 포유류 세포를 알긴산 염 비즈에 캡슐화하는 방법을. 이 기법은 세포 치료 및 조직 공학 연구에 활용될 수 있습니다.

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유화 공정에 대한 그녀의 토양 개발에 대한 질 오스본 (Jill Osborne)과 기술 지원에 대한 로렌 윌킨슨 (Lauren Wilkinson)에게 감사드립니다. Igor Laçik, Timothy J. Kieffer 박사 및 James D. Johnson 선생님의 의견과 협조에 감사드립니다. Diabète Québec, JDRF, ThéCell, 센터 연구 센터 (CQMF), 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC), 인간 섬 이식 및 베타 세포 재생 센터, 캐나다 줄기 세포 네트워크, 마이클 스미스 보건 연구 재단, 자금 지원에 대한 비용 및 비용 865

1. 알긴산 염 용액, CaCO3 서스펜션 및 산성화 오일 준비 <ol><li> 프로세스 버퍼와 매체를 준비하십시오. <ol><li> 10 mM HEPES, 170 mM NaCl을 사용하여 고농도 알긴산염 구슬을 생성하는 데 사용되는 일반적인 공정 완충액을 준비하십시오. pH를 7.4로 맞추십시오. </li><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 6 MM 글루타민, 100 U / ML 페니실린, 100 MG / ML streptomycin을 포함하는 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM)를 사용하여 전형적인 문화 매체를 준비합니다. </li></ol></li><li> 구슬의 최종 원하는 농도의 1.17 배에서 알지네이트 원액을 준비합니다. <ol><li> 먼저 알긴산 염 분말의 적절한 양을 칭량하십시오. 예를 들어, 50:50 LVM 및 MVG 알긴산 염을 함유 한 5 % 알긴산 염의 최종 농도를 얻으려면 0.583g LVM 알긴산 염 분말과 0.583g MVG 알긴산 염 분말을 합하여 총 1.17g 알긴산 나트륨을 계량하십시오. </li><li> autoc에 20 mL 공정 완충액 넣기자석 교반 접시에 유리 용기를 넣고 ~ 200 rpm으로 교반하십시오. 이 용액에 sodium alginate powder를 점차적으로 첨가하십시오. </li><li> 용액을 저속으로 밤새 저어 준다. 필요한 경우 플라스크를 저어 플레이트에 고정시킵니다. </li><li> 용액이 불완전하게 용해 되었다면, 병을 회전식 혼합기에 고정시키고 37 ℃에서 추가로 24 시간 동안 혼합을 계속하십시오. </li><li> 절반 만 채워진 용기에서 30 분 동안 용액을 고압 증기 멸균하여 알지네이트 용액을 멸균하십시오. 솔루션을 검색하기 전에 온도가 60 ° C 이하로 떨어지게하십시오. </li><li> 필요한 경우, 점도가 충분히 낮게 유지되면서 오토 클레이브 직후에 알지네이트 용액을 실온에 도달하기 전에 여과하여 입자를 제거하십시오. </li></ol></li><li> 내부 겔화에 대한 최종 원하는 농도의 21 배로 탄산 칼슘 현탁액을 준비합니다. <ol><li> CaCO3 분말의 무게를 잰다. 예를 들어, 광고d g CaCO 3 를 20 mL 공정 완충액으로 옮겨서 최종 겔 화제 농도로서 24 mM CaCO3를 얻는다. </li><li> 30 분 동안 CaCO3 서스펜션을 오토 클레이브하십시오. 참고 : CaCO 3 농도는 중탄산염 - CO 2 평형으로 인해 시간이 지남에 따라 변합니다. 10 캡슐화 절차 이상을 위해 동일한 스톡 CaCO3 서스펜션을 사용하지 마십시오. </li></ol></li><li> 유화 공정에 사용되는 교반 용기를 오토 클레이브합니다. 사용하기 전에 스피너 플라스크에 남아있는 응축수 흔적을 제거하십시오. </li><li> 유화 공정 직전에 산성화 된 오일을 준비하십시오. 50 ML 원뿔 튜브에 배치 11 ML 미네랄 오일 당 44 μL 아세트산을 해산. 참고 : 일반적인 실수는 아세트산의 불완전한 용해입니다. 소량의 아세트산을 피펫 팅하지 않도록하고 아세트산이 반복적으로 볼 텍싱되어 오일에 완전히 용해되도록하십시오. 주의 : 아세트산은 독성이 있으며<html> 휘발성 산. 이 시약을 흄 후드 아래에서 취급하고 유화 단계까지 아세트산 / 오일 용액을 밀폐 된 용기에 보관하십시오. 자세한 내용은이 시약의 MSDS 정보를 참조하십시오. </li><li> 모든 솔루션은 세포 캡슐에 진행하기 전에 실온에 도달 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 유화 및 내부 겔화에 의한 알긴산염 비드 생성 <ol><li> 스피너 플라스크에 10 mL의 미네랄 오일을 넣고 낮은 회전 속도 ( 예 : 이 비디오에 사용 된 스피너 플라스크의 경우 250 rpm)에서 교반을 시작하십시오. </li><li> 과정에 사용되는 세포가 접착 성 문화의 경우 세포를 정지시키기 위해 트립신을 적용하십시오. FBS 함유 배지 또는 트립신 억제제를 첨가하여 반응을 종결시키고 세포 계수를위한 샘플을 수집한다. <ol><li> 이전에 설명한대로 hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용하여 Trypan 블루 얼룩 후 세포 농도와 생존 능력을 결정ass = &quot;xref&quot;&gt; 32. </li></ol></li><li> 300 XG에서 7 분 동안 세포를 원심 분리하고 세포 고정을위한 원하는 매체에 한번 그들을 씻으십시오. 이 배지에 FBS 나 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 유화제가 포함되어 있는지 확인하십시오. 예를 들어 10 % FBS가 포함 된 DMEM을 사용하십시오. </li><li> 구슬에서 원하는 최종 농도의 10.5 배를 얻기 위해 동일한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁하십시오. </li><li> 9.9 mL의 알지네이트 용액에 10.5 배 농축 세포 저장 액 1.1 mL를 넣는다. 그런 다음 550 μL의 CaCO3 현탁액을 첨가하고 CaCO3가 고르게 분포되도록 살균 된 주걱으로 저어 준다. </li><li> 즉시 알지네이트, 세포 및 CaCO 3 혼합물 10.5 mL를 주사기를 사용하여 진탕 오일에 옮긴다. 참고 : 고점도 용액의 경우 공기 방울을 피하기 위해 혼합물을 매우 천천히 흡인하고 배출하십시오. 어떤 경우에는, 플라스크에 혼합물을 첨가하는 동안 교반을 멈추는 것이 바람직하다알지네이트는 임펠러 샤프트에 동반된다. </li><li> 알지네이트, 세포 및 CaCO3 혼합물을 오일에 첨가 한 직후에 교반 속도를 증가시킨다. 참고 : 여기에 사용 된 5 % LVM : MVG 알지네이트의 경우 시험 구내 배양에 적합한 직경 약 900 μm의 구슬을 생성하기 위해 1025 rpm의 회전 속도를가했습니다. 높은 회전 속도와 낮은 알긴산 염 농도는 이전의 출판물 25 , 32 에서 설명한 것처럼 평균 구슬 직경을 줄입니다. 임펠러 및 혈관 기하학의 약간의 변화뿐만 아니라 알긴산 염의 특성은 평균 구슬 직경에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 혈관 형상 또는 알기 네이트 로트의 각 변화에 대해, 표면적 모멘트 평균 비드 직경과 회전 속도를 관련시키는 표준 곡선이 생성되어야한다. </li><li> 타이머를 시작하고 알지네이트를 12 분 동안 유화시킵니다. </li><li> 10 mL의 t그는 오일과 아세트산 용액을 사용하여 에멀젼을 산성화시키고, CaCO3를 용해시켜 알지네이트를 겔화 된 구슬로 물리적으로 가교 결합시킨다. 이 산성화 단계에 8 분을 허용하십시오. </li></ol> 3. 비드 복구 <ol><li> 교반 속도를 400 rpm으로 줄입니다. 10 % 배지와 혼합 된 공정 완충액 40 mL를 첨가하여 pH를 증가시키고 상 전환을 일으킨다. </li><li> 1 분 후 교반을 멈추고 혼합물을 50 mL 원심 분리 튜브로 옮긴다. 추가 20 ML 매체와 스피너 플라스크를 씻어 튜브에 추가합니다. 유상과의 비드 접촉을 최소화하기 위해 유상을 흡입하기 전에 스피너 플라스크에서 가능한 한 많은 수성 상을 흡인하십시오. 참고 :이 단계에서 큰 구경 피펫 ( 예 : 25 mL 피펫)을 사용하고이 시점부터 구슬이 손상되지 않도록하십시오. 소량의 경우, 비드 서스펜션은 절단 된 피펫 팁으로 조작 할 수 있습니다. 팁을 얻으려면 가위로 피펫 팁 끝 부분을 자릅니다.눈 보호 장치를 착용하십시오. </li><li> 비드 정착과 상 분리를 촉진하기 위해 630 xg에서 3 분 동안 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 오일과 과도한 수용액을 제거하십시오. </li><li> 매체로 적어도 한 번 비드를 씻으십시오. 40 μm 나일론 셀 스트레이너에서 비드 현탁액을 걸러 내고 스트레이너 아래에서 비드와 관련된 과도한 액체를 흡인하십시오. 멸균 주걱을 사용하여 매체의 알려진 볼륨에 구슬을 전송하십시오. 참고 : 목표 최소 구슬 직경에 따라이 단계에서 더 작거나 더 큰 기공 크기 필터를 사용할 수 있습니다. 그러나 구슬의 손상을 방지하기 위해 서브 마이크론 기공 크기 필터를 통한 압력 구동 여과보다는 중력 여과가 권장됩니다. </li><li> 볼륨 변위 (구슬을 추가 한 후 부피 - 구슬을 추가하기 전에 부피를 뺀 값)로 비드 부피를 측정하고 원하는 구슬 : 총 부피비 (일반적으로 1 : 5) 또는 구슬4 mL 배지. 이 시점부터 구슬이 손상되는 것을 피하기 위해 큰 보어 피펫을 사용하십시오. </li><li> 체외 배양이나 이식 실험을 위해 캡슐화 된 세포를 T-flasks로 옮깁니다. </li></ol> 4. 품질 관리 및 응용 참고 : 캡슐화 된 세포 및 비드 품질을 보장하기 위해 프로세스 후의 비드 크기 분포 및 세포 생존을 정량화해야합니다. 추가 분석을 위해 비드 내에서 세포를 회수하기 위해 겔을 역전시키는 것이 일반적으로 수행된다. <ol><li> 구슬 크기 분포를 평가하기 위해 톨루이딘 블루 오로 염색합니다. <ol><li> 10 % 완전 배지가 들어있는 4 mL 공정 완충액에 0.5 mL 구슬을 넣습니다. </li><li> 프로세스 버퍼에서 준비한 1 g / L 톨루이딘 블루 솔루션 500 μL를 추가합니다. </li><li> 50 rpm의 회전 쉐이커 (rotary shaker)에있는 원추형 튜브에서 60 분 동안 인큐베이션한다. </li><li> 10 % 완전 배지 및 담금질을 포함하는 5 mL 공정 완충액을 첨가한다비즈 니스 및 용액을 페트리 접시에 옮기고 저배율 현미경 또는 휴대용 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 얻습니다. 필요한 경우 손잡이가 달린 카메라로 이미지를 획득하기 전에 페트리 접시를 밝은 상자에 올려 놓아 대비를 강화하고 그림자를 피하십시오. </li><li> 예를 들어 이미지 분석 프리웨어 36을 사용하여 앞서 설명한 32 와 같이 비드 크기 분포를 정량화하기 위해 이미지 분석을 수행하십시오. </li></ol></li><li> 세포 생존을 정 성적으로 평가하기 위해 죽은 세포를 확인하기 위해 ethidium homodimer를 사용하고 살아있는 세포를 확인하기 위해 calcein AM을 사용하여 세포를 염색합니다. <ol><li> 10 % 완전 배지를 포함하는 4 부피의 공정 완충액에 1 부피의 비드를 첨가한다. </li><li> calcein 오전과 에티 디움 homodimer 주식 솔루션의 적절한 금액을 각각 4 μm의와 2 μm의 농도를 얻기 위해 추가합니다. 일부 비드 샘플에 시약 중 하나만 추가하여 단일 얼룩 컨트롤을 생성하십시오.</li><li> 20 분 동안 얼음에 구슬을 품어. </li><li> 구슬을 압축하지 않도록 O 링과 같은 스페이서를 사용하여 슬라이드와 커버 슬립 사이에 용액을 놓습니다. </li><li> 형광 현미경으로 진행합니다. 형광 얼룩을 평가하기 위해 단일 얼룩 조절 장치를 사용하십시오. calcein AM (494/517 nm) 및 DNA에 결합 된 ethidium homodimer (528/617 nm)와 관련된 여기 / 방출 파장을 기반으로 적절한 형광 필터를 선택하십시오. </li></ol></li><li> 추가 분석을 위해 구슬에서 세포를 복구하려면 구연산염이나 다른 chelating 솔루션을 사용하여 알지네이트를 degel. <ol><li> pH 7.4에서 55 mM 구연산염, 10 mM HEPES 및 95 mM NaCl을 포함하는 증발 용액을 준비한다. </li><li> 이 용액을 10 % 배지와 섞은 다음, 혼합물 9 mL에 1 mL 알긴산 염 비즈를 첨가하십시오. </li><li> 20 분 동안 75 rpm의 교반으로 얼음 위에서 구슬을 탈기시킨다. 참고 : 이제 세포를 분석에 사용하거나 degelled alginate solut에서 제거 할 수 있습니다이온. 예를 들어, degener 후 세포 생존 능력은 Trypan 블루 염색법으로 정량화 할 수 있습니다. 또는 세포를 원심 분리하고 세척 한 다음 mRNA, DNA 및 / 또는 단백질 샘플링 및 분석을 수행 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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내부 겔화 반응 동안 다양한 단계 ( 그림 2 )가 전체 반응 속도를 제한 할 수 있습니다. ~ 2.5 μm보다 큰 탄산 칼슘 입자의 경우, 탄산염 용해 속도는 속도 제한 26 , 44 로 나타났습니다. 내부 칼슘 방출을 유도하는 산성화 단계는 또한 세포 생존에 영향을 미치는 중요한 공정 변수로도 나타났습니다 32 . 따라서 내부 겔화를 유발하는 조건은 세포 생존뿐만 ​​아니라 비드 품질에도 중요합니다. 비드에 대한 최종 적용에 따라, 상이한 최적 공정 조건이 선택 될 수있다. 예를 들어, 높은 pH 강하 ( 예 : 알지네이트 용액을 완충시키는 10 mM HEPES 사용)는 구슬의 장기간 안정성이 중요한 이식 용도에 바람직합니다. 다른 한편, 더 낮은 pH 강하 ( 예 : 60 mM MOPS를 사용하여 buffe알지네이...

포유류 세포 캡슐화는 면역 거부 반응으로부터 이식 된 세포를 보호하거나 고정화 된 세포 배양을위한 3 차원 지지체를 제공하는 수단으로 광범위하게 연구되어왔다 2 , 3 , 4 . 알지네이트 구슬의 췌장 섬모 캡슐화는 동종 제 5 , 6 또는 이종 동물 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 개의 설치류에서 당뇨병을 역전시키는 데 사용되었습니다. 제 1 형 당뇨병을 치료하기위한 캡슐화 된 췌도 이식의 전임상 시험과 임상 시험이 진행 중이다 ( 13 , 14 , 15) . 이식 용도 또는보다 큰 규모의 경우체외 고정화 세포 생산, 노즐 기반 비드 발생기가 일반적으로 사용됩니다. 전형적으로, 알지네이트와 세포의 혼합물은 노즐을 통해 펌핑되어 2가 양이온을 함유하는 진탕 된 용액에 떨어지는 액 적이 형성되어 액적의 외부 겔화를 일으킨다. 동축 가스 흐름 ( 16 , 17) , 노즐 진동 ( 18) , 정전 반발력 ( 19) 또는 회전 와이어 ( 20) 는 노즐 팁에서 액적 형성을 용이하게한다. 기존의 비드 발생기의 주요 단점은 제한된 처리량과 적절한 비드 형성을 가져 오는 용액 점도 범위가 제한된다는 것입니다. 높은 유속에서, 노즐을 빠져 나가는 유체는 노즐 직경보다 작은 방울로 분열되어 크기 조절을 감소시킵니다. 다중 노즐 비드 발생기를 사용하여 처리량을 늘릴 수 있지만노즐 사이의 균일 한 유량 분포와 용액의 사용&gt; 0.2 Pas는 문제가있다. 마지막으로 모든 노즐 기반 장치는 사용되는 노즐의 직경이 100 μm와 500 μm 사이 인 반면 섬의 ~ 15 %는 200 μm보다 클 수 있기 때문에 섬에 약간의 손상을 줄 것으로 예상됩니다 23 . 이 비디오에서는 드롭 다운 드롭 대신 단일 유화 단계에서 드롭 릿을 형성하여 포유류 세포를 캡슐화하는 대체 방법에 대해 설명합니다. 비드 생산이 간단한 교반 용기에서 수행되기 때문에,이 방법은 장비 비용이 저렴한 (~ 1 mL)에서 대규모 (10 3 L 범위) 비드 생산에 적합합니다. 이 방법은 비드 생성 시간이 짧은 ( 예 : 20 분) 넓은 알긴산 점도를 사용하여 구형도가 높은 비드를 생산할 수 있습니다. 이 방법은 원래 Poncelet et al에 의해 개발되었다 .엘. 25 , 26 및 DNA 27 , 인슐린 29 및 박테리아 30을 포함한 단백질 28 을 고정시키는 데 사용되었습니다. 우리는 최근에 췌장 베타 세포주 31 , 32 및 일차 췌장 조직 32를 사용하여 포유 동물 세포의 캡슐화에 이러한 방법을 적용했습니다. 이 방법의 원리는 미네랄 오일에 알지네이트 방울로 구성된 유 중수 에멀젼을 생성 한 다음 알긴산 방울을 내부 겔화시키는 것입니다 ( 그림 1 ). 먼저, 봉입 제 ( 예 : 세포)는 초기 공정 pH에서 낮은 용해도를 갖는 미세 입자 칼슘 염을 함유하는 알긴산 염 용액에 분산된다. 이어서 알긴산 염 혼합물을 교반 된 유기상에 첨가하여 보통 에멀젼의 존재하에 에멀젼을 생성시킨다.계면 활성제. 포유 동물 세포 캡슐화의 경우, 혈청에 존재하는 성분은 계면 활성제로 작용할 수 있습니다. 다음으로, 수성 상으로 분할되는 유용성 산을 첨가함으로써 칼슘 염을 가용화시키기 위해 pH를 감소시킨다. 미네랄 오일 / 물 분배 계수가 &lt;0.005 33 인 초산은 오일에 미리 용해시킨 다음에 유상에 첨가하여 유상에 혼합하고 신속하게 수성 상에 분배한다. 그림 2 는 산성화 및 내부 겔화 단계에서 일어나는 화학 반응과 확산을 보여줍니다. 마지막으로, 캡슐화 된 세포는 상 전이, 원심 분리에 의한 상분리 촉진, 반복 된 세척 단계 및 여과에 의해 회수된다. 이러한 단계는 품질 관리 분석, 시험 관내 세포 배양 및 / 또는 캡슐화 된 세포의 이식을위한 비드 및 세포 샘플링에 의해 수행 될 수있다. 그림 1 : 포유 동물 세포를 캡슐화하는 유화 기반 공정의 개략도. 구슬은 처음에 알긴산 염, 세포 및 CaCO3 혼합물을 미네랄 오일 (도식의 1 단계와 2 단계)에 유화시켜 아세트산을 첨가하여 내부 겔화를 유발함으로써 생성됩니다 (3 단계). 이어서, 겔화 된 비드를 수성 완충액을 첨가하여 위상 반전 (단계 4), 원심 분리 및 오일 흡인 (단계 5), 및 여과 (단계 6)를 수행함으로써 오일로부터 분리 하였다. 마지막으로, 필터 상에 수집 된 비드 는 시험 관내 배양 또는 이식을 위해 세포 배양 배지로 옮겨진다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <imgalt = &quot;그림 2&quot;class = &quot;xfigimg&quot;src = &quot;/ files / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 : 내부 겔화 동안 일어나는 반응 및 확산 단계. (1) 아세트산은 유기상에 첨가되고 대류에 의해 알지네이트 방울로 수송된다. (2) 아세트산은 수상으로 분리된다. (3) 물의 존재 하에서, 산은 해리하고 확산되어 진한 파란색으로 묘사 된 CaCO3 입자에 이른다. (4) H + 이온은 CaCO3에서 Ca2 + 이온과 교환되어 Ca2 + 이온을 방출한다. (5) 칼슘 이온은 미 반응 알지네이트를 만나 알지네이트 사슬의 이온 결합 가교 결합을 일으킬 때까지 확산한다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55280/55280fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 종래의 노즐 기반의 세포 캡슐과는 달리, 넓은 비드 크기 분포가 얻어진다이는 교반 된 유화에서 액적 형성의 메카니즘으로 인해이 공정으로부터 유래된다. 일부 응용 프로그램의 경우이 구슬 크기 분포가 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어, 더 큰 조각의 세포가 작은 비드의 비드 표면에 노출 될 수 있습니다. 영양소 ( 예 : 산소)의 제한이 우려된다면 큰 구슬에서는 이러한 한계가 악화 될 수 있습니다. 교반 된 유화 방법의 장점은 평균 비드 크기가 유화 단계 동안 교반 속도를 변화시킴으로써 쉽게 조절 될 수 있다는 것이다. 광범위한 비드 크기 분포는 또한 캡슐화 된 셀 성능에 대한 비드 크기의 효과를 연구하기 위해 이용 될 수 있습니다. 유화 및 내부 겔화에 의한 포유류 세포 캡슐화는 비드 발생기가 장착되지 않은 실험실에 대한 흥미로운 대안입니다. 또한,이 방법은 사용자에게 처리 시간을 줄이거 나 매우 낮은 또는 매우 높은 알긴산 염 농도에서 비드를 생성하는 옵션을 제공합니다ations. 아래에 약술 된 프로토콜은 10mM 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충액에서 제조 된 5 % 알긴산 염 용액 10.5mL에 세포를 캡슐화하는 방법을 기술한다. 알지네이트는 이식 등급 LVM (낮은 점도의 높은 만 뉴론 산 함량)과 MVG (중간 점도의 높은 guluronic acid 함량) 알지네이트의 50:50 혼합물로 구성됩니다. 최종 농도 24 mM의 탄산 칼슘이 물리적 가교제로 사용됩니다. 경질 미네랄 오일은 유기상을 구성하고 아세트산은 유제를 산성화하고 내부 겔화를 유발하는 데 사용됩니다. 그러나, 알지네이트 유형 및 조성뿐만 아니라 선택된 공정 완충액은 원하는 적용 32 에 의존한다. 다양한 알지네이트 유형 (물질 표 참조)이이 프로토콜을 사용하여 비즈를 생산하는 데 사용되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents and consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LVM alginate (transplantation-grade)Novamatrix</td><td></td> <td>Non-applicable</td><td>결과에서 "alginate #1"이라고 불렀다.</td></tr><tr><td>MVG 알긴산염(이식 등급)</td><td>Novamatrix</td><td>해당 없음</td><td>결과에서 "알긴산 #2"라고 합니다.</td></tr><tr><td>알긴산염(세포 배양 등급)</td><td>Sigma</td><td>A0682(저점도) 또는 A2033(중간 점도)</td><td>A2033은 결과에서 "알긴산 #3"으로 참조됩니다.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 특성화, 캐나다 유래</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 세포 배양 테스트</td><td>Sigma</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Fine-grain CaCO3</td><td>Avantor Materials</td><td>1301-01</td><td>CaCO3 현탁액을 준비한 후 초음파 처리하여 1개월 이내에 사용하십시오.</td></tr><tr><td>경량 미네랄 오일</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O121-4</td><td>멸균 필터는 0.22 &mu; 사용하기 전에 M 기공 크기의 멤브레인을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>취급 주의: MSDS를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>멸균 주걱</td><td>Sigma</td><td>CLS3004-100EA</td><td></td></tr><tr><td>멸균 나일론 셀 여과기, 40 &micro; m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫 (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 및 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue-O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL 마이크로캐리어 스피너 플라스크</td><td>Bellco</td><td>1965-00100</td><td>최신 모델의 임펠러 구성은 적절한 유화에 적합하지 않을 수 있습니다. 플라스크 바닥에서 0.5cm 떨어진 곳까지 오일을 쓸어낼 수 있는 블레이드는 테프론 시트로 맞춤 제작할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>속도 조절이 가능한 마그네틱 교반 플레이트</td><td>Bellco</td><td>7760-06005</td><td>회전 속도는 사용하기 전에 보정해야 합니다(예: 회전 속도계 사용).</td></tr><tr><td>셀 카운터</td><td>Innovatis</td><td>Cedex AS20</td><td>이 시스템은 현재 Roche에서 판매하고 있습니다. 이 자동화된 세포 계수기는 혈구계를 사용한 Trypan blue 염색 후 수동 세포 계수기로 대체할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>LED 라이트 박스</td><td>Artograph</td><td>LightPad&reg; PRO</td><td>이 항목은 다른 유형의 조명기로 교체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>핸드헬드 카메라</td><td>Canon</td><td>PowerShot A590 IS</td><td>다양한 핸드헬드 카메라를 사용하여 톨루이딘 블루-o 스테인드 비드 이미지를 캡처할 수 있습니다. 이미지를 획득하기 전에 구슬이 들어 있는 페트리 접시 옆에 자를 놓아야 합니다.</td></tr><tr><td>위상차 및 적절한 형광 필터가 있는 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>비드를 이미지화하기 위해 여러 현미경 시스템이 사용되었습니다. 여기에 표시된 결과는 GFP 및 TRITC 형광 필터가 장착된 IX81 현미경으로 얻은 것입니다. 전체 비드를 캡처하기 위해 교반 속도에 따라 4X에서 20X 대물렌즈가 사용되었습니다. 살아있는/죽은 염색 이미지는 일반적으로 20X에서 40X 대물렌즈로 캡처되었습니다.</td></tr><tr><td>이미지 획득 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td>다양한 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 위상차 및 형광 이미지를 획득할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>이미지 분석 프리웨어</td><td>CellProfiler</td><td>해당 없음</td><td>다양한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 비드를 물체로 식별하고 비드 크기(예: ImageJ)를 분석할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

알기 네이트 비드에서의 세포 캡슐화는 시험 관내 뿐만 아니라 생체 내 면역 분리 를 위해 고정화 된 세포 배양 에 사용되어왔다. 췌도 소포 캡슐화는 동종 또는 이종 이식에서 랑게르한 생존을 증가시키는 수단으로서 광범위하게 연구되어왔다. 알지네이트 캡슐화는 일반적으로 노즐 압출 및 외부 겔화에 의해 달성됩니다. 이 방법을 사용하여, 노즐의 끝에 형성된 세포 함유 알지네이트 물방울은 물방울로 확산 될 때 이온 성 알지네이트 겔화를 유발하는 2가 양이온을 함유하는 용액에 빠지게된다. 노즐 팁에서의 액적 생성에 대한 요구는 용적 처리량 및 달성 될 수있는 알긴산 염 농도를 제한한다. 이 비디오는 포유류 세포를 70 % ~ 90 %의 세포 생존율을 갖는 0.5 %에서 10 %의 알지네이트로 캡슐화하는 확장 가능한 유화 방법을 설명합니다. 이 대체 방법에 의해, 세포 및 탄산 칼슘을 함유하는 알긴산 방울을 미네랄 오일,내부 칼슘 방출 및 이온 성 알기 네이트 겔화를 유도하는 pH의 감소로 낮아진다. 현재 방법은 유화 20 분 이내에 알지네이트 구슬의 생산을 허용합니다. 캡슐화 단계에 필요한 장비는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 단순 교반 용기로 구성됩니다.

<html> 유화 및 내부 겔화 공정이 끝나면 초기 알긴산염 및 세포 혼합물 부피와 유사한 비드 부피가 회복되어야합니다. 구슬은 결함이 거의없는 구형이어야합니다 ( 그림 3 ). 구슬은 대구경 피펫을 통해 피펫 팅을 견딜 수있을만큼 충분히 강해야합니다. 높은 알긴산 염 농도에서 캡슐화 된 오일 또는 공기 방울이 구슬에서 관찰 될 수 있습니다. 이는 유화 단계 (유성 / 물 / 유성 이중 유제) 동안 알긴산 염료에 오일이 포획되어 발생하기 쉽습니다. 우리의 손에서,이 구슬은 구슬 부피의 작은 부분 (5 % 미만)을 나타 냈고, 구슬 회수 단계에서 오일을 흡입하는 동안이 구슬의 대부분이 제거되었습니다. <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55280/55...

이 동영상과 원고는 단순 교반 용기를 사용하여 큰 배치로 생산할 수있는 0.5 % ~ 10 % 알긴산 염 비즈로 포유류 세포를 캡슐화하는 유제 기반 방법을 설명합니다. 캡슐화 된 세포는 시험 관내에서 배양 되거나 세포 치료 응용을 위해 이식 될 수 있습니다.

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

이 영상은 단순 교반 용기를 사용하여 알긴산 비드 내에 췌도와 같은 포유류 세포를 고정화하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 원리는 수중유 에멀젼을 통해 알긴산 액적을 생성한 후, 알긴산 액적을 내부 겔화시키는 것입니다. 절차의 첫 번째 단계는 알긴산 세포와 탄산칼슘을 포함하는 수상을 미네랄 오일 유기상에 분산시켜 에멀젼을 생성하는 것입니다.두 번째 단계는 아세트산과 같이 수성상으로 빠르게 분배되는 유용성 산을 첨가하여 에멀젼을 산성화하는 것입니다. pH가 낮아지면 탄산칼슘이 용해되고, 알긴산 액적 내부에서 겔화가 일어나 비드가 형성됩니다. 마지막 단계는 수용액을 첨가하여 에멀젼에서 비드를 회수하고, 원심분리로 상을 분리한 후 비드를 세척 및 여과하는 과정으로 구성됩니다.고정화된 세포는 이후 인 비트로(in vitro)에서 배양하거나 이식에 사용할 수 있습니다. 본 연구에서 설명한 방법은 노즐 기반의 세포 캡슐화 장치를 사용하여 알긴산 비드를 생성하는 방법의 대안입니다. 이는 1992년 Poncelet 등에 의해 처음 보고된 효소 및 미생물 세포 고정화 방법에서 유래되었습니다.우리가 가장 관심을 갖는 응용 분야는 이식된 세포를 면역 격리하여 거부 반응 억제제의 필요성을 줄이거나 심지어 없애기 위한 수단으로서의 알긴산 캡슐화입니다. 노즐 기반 장치와 비교했을 때 유제 기반 공정의 주요 장점은 확장성과 견고함입니다. 액적들이 거의 동시에 생성되므로, 매우 희석된 알긴산 용액이나 매우 농축된 알긴산 용액 모두를 사용하여 매우 짧은 시간 내에 매우 많은 양의 비드를 생산할 수 있습니다.또한 이 공정은 매우 견고하여 실패 가능성이 낮으며, 노즐을 막을 수 있는 입자가 존재하는 경우에도 안정적입니다. 마지막으로, 공정 장비가 상당히 단순하여 대부분의 실험실에서 접근 가능하며 비용이 매우 저렴합니다. 핵심 공정 단계는 알지네이트 액적을 형성하는 유화 단계와 내부 칼슘원을 방출시키는 산성화 단계입니다. 액적의 크기는 주로 임펠러 설계, 교반 속도 및 교반 시간에 의해 영향을 받습니다.비드의 기계적 특성과 세포 생존율은 산성화의 정도와 지속 시간에 의해 영향을 받습니다. 본 영상에서는 이식용 5% alginate 비드 내에 세포를 캡슐화하는 방법을 시연합니다. 이러한 파라미터들은 다른 잠재적 응용 분야에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.LVM 및 MVG 알긴산이 절반씩 혼합된 5% 알긴산 비드를 제조하려면, LVM 알긴산 분말 583 milligram과 MVG 알긴산 분말 583 milligram을 정량합니다. 마그네틱 교반기 위에 프로세스 버퍼 20 milliliter를 넣습니다. 이식 응용 분야의 경우, pH 7.4에서 170 millimolar 염화나트륨을 포함하는 10 millimolar HEPES 버퍼를 사용합니다.알긴산 분말을 용액에 점진적으로 첨가합니다. 저속으로 밤새 교반합니다. 필요한 경우, 플라스크를 교반기에 고정하십시오.다음 날, 알지네이트가 완전히 용해되지 않았다면 jar를 회전 혼합기에 고정하고 37 °C에서 밤새 혼합을 계속합니다. 알지네이트가 완전히 용해되면, 30분 동안 오토클레이브로 멸균합니다. 오토클레이브를 열기 전 온도가 50 °C 이하로 떨어질 때까지 기다립니다.1g의 탄산칼슘을 20mL의 공정 버퍼에 첨가하여 탄산칼슘 현탁액을 준비합니다. 탄산칼슘 현탁액과 유화 공정에 사용되는 교반 용기를 오토클레이브로 멸균합니다. 사용 전, 용기 내의 응결된 수분 흔적을 모두 제거하십시오.유화 과정 직전에, 50 mL 원추형 튜브에 담긴 11 mL 미네랄 오일에 44 µL 빙초산을 녹입니다. 흔히 발생하는 실수는 초산이 완전히 용해되지 않는 것이므로, 10 µL 미만의 양을 피펫팅하는 것을 피하고 반복적인 볼텍싱을 통해 산이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 세포 캡슐화 단계로 진행하기 전, 모든 용액이 상온에 도달하도록 둡니다.스피너 플라스크에 미네랄 오일 10 milliliter를 넣고, 250 RPM으로 교반을 시작합니다. beta-tc3 세포와 같은 부착성 세포를 사용하는 경우, 세포를 트립신 처리합니다. 완전 배지를 첨가하여 반응을 종료하고, 세포 수 측정을 위한 샘플을 채취합니다.수동으로 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 결정합니다. 세포를 300 g에서 7분 동안 원심 분리한 다음, 세포 펠렛을 완전 배지에 다시 현탁합니다. 원심 분리 단계를 반복한 후, 비드에서의 최종 희망 농도의 10배 및 1/2배가 되도록 적절한 부피의 완전 배지에 세포를 다시 현탁합니다.9.9 milliliter의 알긴산 용액을 바닥이 평평한 튜브에 옮긴 후, 세포 스톡 1.1 milliliter와 탄산칼슘 현탁액 550 microliter를 추가합니다. 가벼운 볼텍싱을 통해 알긴산, 탄산칼슘 및 세포 현탁액을 혼합합니다. 즉시 이 혼합물 10.5 milliliter를 시린지를 사용하여 교반 중인 오일에 옮깁니다.교반 속도를 높인 다음 타이머를 시작합니다. 교반 속도를 결정하기 위해서는 먼저 비드 크기와 교반 속도의 관계를 나타내는 표준 곡선을 생성해야 합니다. 12분 후에 오일 및 아세트산 용액 10 milliliter를 첨가하여 에멀젼을 산성화하고, 탄산염으로부터 칼슘을 방출시켜 겔화된 비드를 얻습니다.이 내부 겔화 단계에 8분을 할당하십시오. 페놀 레드 pH 지시약이 포함된 유화 액적의 색상 변화를 확인하십시오. 교반 속도를 400 RPM으로 낮추고, 10% 배지가 혼합된 공정 완충액 40 milliliters를 첨가하여 산을 중화시키면 상전이가 일어납니다.1분 후에 교반을 중단하고 혼합물을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 스피너 플라스크를 배지 20 milliliter로 추가로 헹구어 튜브에 넣습니다. 오일 상을 흡입하기 전에 수성 용액을 가능한 한 많이 흡입하여 제거합니다.비드 침전과 상 분리를 촉진하기 위해 튜브를 630 g에서 3분 동안 원심분리합니다. 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 오일과 과잉 공정 버퍼를 제거합니다. 세척 단계 사이마다 630 g 원심분리를 수행하며, 배지로 비드를 최소 한 번 세척합니다.비드 현탁액을 40-micron 나일론 세포 스트레이너로 여과하고, 스트레이너 하단에서 과잉 액체를 흡입하여 제거합니다. 스패튤라를 사용하여 비드를 일정량의 배지로 옮깁니다. 비드 부피를 측정한 후, 배지를 추가하여 원하는 비드 농도를 맞춥니다.전형적인 농도는 총 부피 5 mL당 비드 1 mL입니다. 이 시점부터는 비드가 손상되는 것을 방지하기 위해 항상 광구 파이펫(large-bore pipette)을 사용하여 비드를 취급하십시오. 이제 캡슐화된 세포를 T 플라스크로 옮겨 인비트로(in vitro) 배양 또는 이식에 사용할 수 있습니다.에멀젼 과정이 끝나면 세포가 고정된 알지네이트 비드가 생성됩니다. 과정 완료 후, 비드 크기 분포와 세포 생존율을 정기적으로 평가해야 합니다. 비드 크기 분포를 측정하기 위해 비드를 toluidine blue로 염색한 후 이미지 분석을 수행할 수 있습니다.이 공정에서는 넓은 비드 크기 분포가 나타날 것으로 예상됩니다. 세포 생존율을 평가하기 위해 calcein-AM 및 ethidium homodimer와 같은 생사 염색 시약으로 비드를 배양할 수 있습니다. 이 비디오에 설명된 공정을 사용하여 측정한 결과, beta-tc3 세포의 생존율은 76%였습니다.이 영상을 시청하고 나면 간단한 교반 시스템을 사용하여 알긴산 비드 내에 포유류 세포를 고정화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 영상에서 보여주는 기본 프로토콜은 광범위한 종류의 알긴산 및 칼슘원(calcitrations)을 사용하여 다양한 세포 유형을 고정화하는 데 적합합니다. 새로운 로트의 알긴산 또는 오일을 사용할 때마다 평균 비드 크기와 교반 속도의 관계를 나타내는 표준 곡선을 작성하는 것을 권장합니다.저희가 설명해 드린 유화 과정은 노즐 기반의 세포 캡슐화 장치를 대체할 수 있는 유망한 대안입니다. 이는 포유류 세포를 알긴산 비드 내에 고정화하는 견고하고 간단한 방법입니다. 저희와 전 세계의 다른 연구자들이 노즐 세포 치료법을 개발함에 따라, 수만 명의 당뇨병 환자들을 위해 이러한 규모의 방법론이 필요하게 될 것입니다.본 연구진은 5% alginate 비드 내의 베타 세포주 이식에 관한 유망한 결과를 발표하였으며, 이식 거부 반응을 억제하는 이 개선된 장벽의 체내 성능을 지속적으로 탐색하고 있습니다.

mammalian-cell-encapsulation-alginate-beads-using-simple-stirred

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

다음 섹션에서 우리는 생명 의학 애플 리케이션에서 사용할 수 알지네이트요 microspheres의 준비 절차를 설명합니다. 우리는 특히 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로서 세포 및 단백질 캡슐의 이중 목적 multilayered 알지네이트요 microspheres를 만들기위한 기술을 설명합니다.

바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 알긴산 Microspheres의 생성

이 동영상은 신경독성 아밀로이드-베타 분비 세포를 캡슐화하는 고분자 마이크로비드를 제조하는 방법을 보여줍니다. 세포-폴리머 현탁액은 마이크로비드 제조 장치를 통해 처리되며, 칼슘 가교를 통해 폴리머 겔화가 이루어지며 세포 주위에 구형 마이크로비드를 형성합니다. 이 폴리머는 세포 증식을 가능하게 하는 동시에 통제된 장기 아밀로이드-베타 방출을 가능하게 하여 알츠하이머병에 축적되는 것을 시뮬레이션합니다.

알츠하이머병 모델링을 위한 아밀로이드-베타 방출 고분자 마이크로비즈 제작

여기에서는 복강 내 지방 조직에서 열 생산을 위해 지질을 소비하고 비만 마우스의 에너지 소산을 증가시키는 이화 세포의 캡슐화 프로토콜을 제시합니다.

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

우리는 동축 노즐을 사용하여 만능 줄기 세포(PS 세포)를 알기네이트 하이드로겔 캡슐에 캡슐화하는 방법을 확립했습니다.  이는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다.  이 기술은 PS 세포의 대량 생산과 줄기 세포 틈새 시장에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

이질적인 세포 집단을 가진 하중지지 조직의 엔지니어링 및 분석은 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 하나의 구조 내에서 다양한 세포 집단의 공동 배양을 위한 플랫폼으로서 이중층 알기네이트 하이드로겔 디스크를 만드는 방법을 설명합니다.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

이 프로토콜은 세포를 고정화시키는 알긴산의 신속한 물리적 겔화에 의한 세포 캡슐화 방법을 예시한다. 얻어진 마이크로비드는 시간이 지남에 따라 아밀로이드-β의 제어되고 지속적인 분비를 허용하고 시험관 내 및 생체 내 모델에서 분비 된 아밀로이드-β의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

알츠하이머 병 모델링에 사용하기 위한 아밀로이드-β-분비 알긴산 마이크로비드 의 제조

여기에 제시된 것은 설치류 눈에 생물학적 제제의 장기 전달을 위한 불멸화된 세포의 미세 캡슐화에서 중합체로서 알긴산을 사용하기 위한 프로토콜이다.

마우스 아이에 생물학적 제제의 전달을 위한 캡슐화된 세포 기술

여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

배우세요 간단한 교반 용기를 사용하여 포유류 세포를 알긴산 염 비즈에 캡슐화하는 방법을. 이 기법은 세포 치료 및 조직 공학 연구에 활용될 수 있습니다.

간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

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