스트레스 유도 박테리아에서 분리된 (p)ppGpp 뉴클레오티드의 박층 크로마토그래피 기반 분리

스트레스 유도 전후에 박테리아 배양에서 얻은 방사성 표지 뉴클레오티드 추출물로 시작합니다.

스트레스 하에서 박테리아 효소는 구아노신 삼인산과 구아노신 이인산을 스트레스 유도 뉴클레오티드 구아노신 오인산과 구아노신 사인산으로 전환합니다.

고정상으로 양이온성 폴리머로 사전 코팅된 박층 크로마토그래피 플레이트에 추출물을 배치합니다.

이동상으로 완충액이 포함된 챔버에 플레이트를 놓고 액체가 지점 아래에 유지되어 조기 확산을 방지합니다.

완충액이 모세관 작용에 의해 상승하도록 하여 음전하를 띤 뉴클레오티드를 전하와 크기에 따라 별개의 밴드로 분리합니다.

현상 후 플레이트를 제거하고 자연 건조한 다음 상단을 다듬어 유리 동위원소를 제거하고 배경 신호를 줄입니다.

방사성 신호를 감지하기 위해 플레이트를 방사선에 민감한 스크린에 노출시킵니다.

스트레스 유도 후 구아노신 테트라포스페이트 및 구아노신 펜타포스페이트의 증가된 수준은 구아노신 뉴클레오티드 풀의 동적 변화를 나타냅니다.

먼저 20 x 20cm PEI 셀룰로오스 TLC 플레이트를 설정합니다.

가위를 사용하여 상단 5cm를 제거하고 부드러운 연필을 사용하여 가장자리에서 1cm 떨어진 원점을 표시합니다. 각 샘플의 5마이크로리터 물방울을 PEI 표면에 도포합니다.

스팟이 건조되기 전에 원점 샘플 스폿에 닿지 않을 만큼 얕은 1.5몰 인산일칼륨 층이 포함된 탱크로 플레이트를 옮깁니다. 탱크를 밀폐 밀봉으로 덮고 액체가 15cm 트리밍 시트 상단으로 올라갈 수 있도록 합니다. 그런 다음 완전히 현상된 크로마토그램을 제거하고 실온에서 자연 건조합니다.

유리 P32가 포함된 크로마토그램의 상단 부분을 절단하여 방사성 폐기물로 폐기합니다. 형광체 스크린을 사용하여 밤새 오디오 방사선 촬영 필름을 노출시킵니다. 다음날 필름을 현상하고 형광체의 녹색 신호를 포착하고 정량화합니다.

그런 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 방사성 반점을 정량화합니다.