초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비

이 절차의 전반적인 목표는 박테리아 세포벽을 분리하고 소화하여 서로 다른 뉴로펩티드의 정체성과 상대적 분획을 결정하는 것입니다. UPLC 분석을 사용하여 황산에콜나트륨에서 끓여서 박테리아 샘플을 먼저 용해시킴으로써 이를 수행합니다. SDS를 세척한 후 두 번째 단계는 프로나제 E로 샘플을 분해하여 그람 음성 박테리아의 외막을 정화하는 것입니다.

다음으로, 샘플을 mease로 절단하여 peptidoglycan을 개별 신경 펩티드로 용해시킵니다. 마지막 단계는 뉴로펩티드를 줄이고 pH를 뉴로펩타이드 등전점으로 조정하는 것입니다. 궁극적으로 UPLC는 크기와 소수성에 따라 뉴로펩타이드를 분리하는 데 사용되어 가교 정도 및 평균 글라이칸 가닥 길이와 같은 중요한 세포벽 특성의 정량화를 용이하게 합니다.

이 방법은 형태 형성, 세포벽 구조, 면역 체계 활성화 및 발병 기전 간의 관계와 같은 미생물학 분야의 주요 질문에 대한 답을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 그람 음성 펩티딜 글리칸을 정제하기 위해 개발되었지만, 몇 가지 효소와 화학적 처리를 추가하여 그람 양성 박테리아에도 적용할 수 있습니다. 박테리아 배양물을 다시 성장시키기 위해 하룻밤 사이에 배양물을 1에서 100까지 250밀리리터의 신선한 배지로 희석하고 희석된 배양물이 성장하는 동안 600나노미터에서 원하는 광학 밀도로 성장합니다. 1리터 비커의 핫플레이트에 끓는 물 수조를 설정합니다.

물이 끓기 시작하면 6 밀리리터의 6 % 딜 황산나트륨 또는 SDS를 50 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브에 분취합니다. 각 튜브에 하나의 작은 교반 막대를 추가하고 튜브 뚜껑을 손가락으로 단단히 조입니다. 튜브를 끓는 물 수조에 넣고 핫 플레이트에서 500RPM으로 저어줍니다.

250 밀리리터 배양물을 실온에서 10 분 동안 5, 000 회 G로 회전시켜 수확합니다. 펠릿을 3ml의 배지 또는 1개의 x 인산염 완충 식염수에 재현탁합니다. 튜브가 끓는 수조에 잠겨 있는 동안 세포를 이빨이 되도록 6% 끓는 SDS가 있는 50ml 튜브에 세포 현탁액을 천천히 피펫팅하고 뚜껑을 다시 닫아 손가락으로 단단히 조입니다.

끓는 수조를 덮고 세포를 3시간 동안 끓여서 주기적으로 수위를 확인하고 필요할 때 수조를 다시 채웁니다. 3시간 후 핫플레이트의 불을 끄고 500RPM으로 밤새 계속 저어줍니다. SDS가 하룻밤 동안 50밀리리터 튜브에 침전된 경우 수조를 1-2시간 더 끓이도록 설정합니다.

다음은 하룻밤 동안 lysing 후 정상적인 문화가 어떻게 보여야 하는지를 보여줍니다. SDS에서는 강수량과 상관 관계가 있는 불투명도와 반대되는 투명도에 유의하십시오. 엎드린 E 완충액을 준비하고 엎드린 E 버퍼를 섭씨 60도의 열 블록에서 최소 30분 동안 활성화합니다.

400, 000 times G로 설정된 초원심분리기를 사용하여 실온에서 20분 동안 샘플을 회전시켜 큰 펩톨 글라이칸 또는 PG 매크로 분자를 펠릿화하여 다른 세포 구성 요소에서 정제합니다. 상등액을 조심스럽게 제거한 다음 각 펠릿을 실온에 다시 현탁시킵니다. 초순수 복원 현탁액은 사용된 초원심분리기 튜브의 부피에 따라 다릅니다.

튜브를 절반 이상 채우는 부피를 사용하되 튜브의 최대 부피를 초과하지 않는 부피를 사용하십시오. Resus 현탁액 중 물이 기포를 형성하지 않을 때까지 원심분리와 세척을 반복하면 이 시점에서 SDS가 완전히 제거되었음을 나타냅니다. Resus는 900마이크로리터의 트리스 HCL 버퍼에 샘플을 현탁시키고 상단에 구멍이 뚫린 2개의 밀리리터 튜브로 옮깁니다.

작은 바늘을 사용하여 각 샘플에 100마이크로리터의 활성 프로나제 E를 첨가한 후 섭씨 60도에서 2시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 200마이크로리터의 6%SDS를 첨가하여 엎드린 소화 불량을 멈추고 샘플을 섭씨 100도의 열 블록에서 30분 동안 끓입니다. 이전과 같이, 400, 000 번 G로 설정된 초원심분리기를 사용하여 실온에서 20분 동안 샘플을 회전시키고 마지막 원심분리 세척 단계에서 SDS가 완전히 제거될 때까지 실온의 초순수로 세척한 후 50밀리몰 인산나트륨 완충액 200마이크로리터에서 샘플을 현탁합니다.

이 부피는 샘플의 펩토 글라이칸 양에 따라 조정할 수 있으며 종에 따라 다를 수 있습니다. 샘플에 펩 글라이칸이 더 많이 포함되어 있으면 현탁액 부피를 늘리십시오. 샘플에 펩타이드 글라이칸이 거의 없는 경우.

resus 현탁액 부피를 최소 50마이크로리터로 줄입니다. 샘플을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 밀리리터 마이즈당 1밀리그램을 첨가하여 최종 농도가 밀리리터당 40마이크로그램이 됩니다. 6-8시간 동안 또는 섭씨 37도의 열 블록에서 하룻밤 동안 배양합니다.

UPLC용 샘플을 준비하려면 열 블록을 섭씨 100도까지 켭니다. 16, 000 시간에 10 분 동안 mease 소화 분리기 표본을 멈추기 위하여 5 분 동안 SDS 없이 표본을 종용하십시오. G 실온에서.

뉴로펩티드는 현재 상층액에 있습니다. 상층액을 13 x 100mm 유리관으로 옮깁니다. 가능한 한 많은 상층액을 회수하고 입천장을 방해하지 않고 입천장에 매우 가까이 다가가십시오.

최종 농도인 100 millimolar borate buffer bore eight buffer는 환원제와 호환되도록 샘플에 500 millimolar borate buffer를 추가하여 pH를 조정합니다. 소듐보로하이드라이드: 각 샘플을 줄이기 위해 여러 알의 소듐보로하이드라이드를 추가하고 실온에서 최소 30분 동안 반응을 진행하도록 합니다. 다음으로, 20 마이크로 리터 단위를 사용하여 오르토 인산이 함유 된 pH 지시 용지로 측정 한 바와 같이 샘플을 pH 6으로 조정하고, 샘플은 오르토 인산의 첨가에 반응하여 거품이 발생해야합니다.

샘플은 일반적으로 pH 6에 도달하면 기포를 멈춥니다. 그런 다음 2마이크로리터 단위를 사용하여 오르토 인산으로 샘플을 pH 3에서 4 사이로 계속 조정합니다. 0.22 미크론 주사기를 통해 샘플을 필터링합니다.

A-U-P-L-C 바이알에 직접 여과합니다. UPLC 바이알로 옮겨진 후 샘플에서 침전물이 재형성된 경우 화염을 여러 번 통과하여 바이알을 가열합니다. UPLC 바이알을 자동 샘플러에 넣고 각 샘플 10마이크로리터를 A-U-P-L-C 기기에 주입합니다.

C 18 역상 UPLC 컬럼과 모니터링하도록 설정된 흡광도 검출기가 장착되어 있습니다. 202 - 208 나노미터 샘플이 순차적으로 주입됩니다. 흐름을 분당 0.25밀리리터로 설정하고 25분 동안 선형 그래디언트를 사용하여 30분 이내에 100% 용매 B 및 뉴로펩타이드의 순차 E를 달성합니다.

UPLC 후 뉴로펩타이드를 특성화하기 위해 질량분석법을 사용하는 경우, 분획 분취기에서 관심 피크의 분획을 수집하고, 분획을 1.5ml 튜브로 옮긴 다음 원심 증발기를 사용하여 분획을 건조하는 경우, MS 분석 전에 분획을 탈염해야 합니다. 이 일반적인 UPLC 결과에서. 202 - 208 나노미터에서 UV 흡광도를 통한 검출은 시간의 함수로 특정 뉴로펩티드 체류 시간을 설정합니다.

대부분의 뉴로펩타이드 종 간의 명확한 분리능과 스펙트럼 전반에 걸친 강력한 신호 강도가 관찰되며, 이를 통해 평균 글라이칸 가닥 길이의 가교 정도와 뉴로펩티드의 정체 및 농도를 분석할 수 있습니다. 뉴로펩티드의 C 침전을 반영하는 크로마토그램의 예가 여기에 나와 있습니다. 피크가 언급되지 않아 PG 구성에 대한 데이터가 없습니다.

UPLC 분석에서 식별할 수 있는 피크가 없는 것은 샘플을 과농축하거나 pH를 뉴로펩티드의 등전점보다 훨씬 낮게 조정한 결과로 발생할 수 있습니다. 일단 마스터하면 이 기술은 3일 안에 완료할 수 있지만 바쁜 기술이지만 이 절차에 따라 적절하게 수행했습니다. 질량 분석법과 같은 다른 방법은 개발 후 질량을 기반으로 뉴로펩티드 종을 긍정적으로 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

이 기술은 미생물학 분야의 연구자들이 주요 세포벽 효소의 생화학적 기능과 다양한 종 및 돌연변이에서 화학적 억제제의 작용 방식을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.