유전자 변형 박테리아 세포에서 표적 효소 발현 검출

유전자 변형 박테리아 세포가 담긴 튜브부터 시작하세요. 각 박테리아는 다양한 효소를 암호화하는 고복제 포스미드를 가지고 있습니다.

다양한 세포 내 효소 발현을 촉진하기 위해 흔들면서 관을 배양하세요.

시험관에 표적 효소에 특이적인 기질을 추가하고, 대조관에는 같은 양의 완충제를 추가합니다.

흔들면서 부양하세요. 기질은 세포 안으로 들어가 표적 효소가 이를 절단하여 형광 산물을 생성합니다.

제어 튜브를 사전 보정된 유세포계에 넣으세요.

각 셀이 레이저 빔을 통과할 때 빛이 산란됩니다. 단일 셀을 식별하기 위해 산란 그래프를 생성하는데, 이 셀은 덩어리보다 빛을 덜 산란합니다.

세포 덩어리를 제외하고, 단일 세포의 형광 신호를 그래프로 표시하여 기준선 형광을 확립합니다.

기질 처리된 튜브를 유세포계에 넣어 형광 신호를 측정합니다.

기질 처리 세포에서 대조 세포보다 형광 신호가 증가하면 표적 효소 발현이 확인됩니다.

관심 있는 메타겐옴 효소를 선별하기 위해, 분리된 세포를 섭씨 37도, RPM 200에서 OD₆₀₀ 이 0.5에 도달할 때까지 배양합니다. 그 다음 세포 내 포스미드 복사 수를 증폭시키기 위해 1마이크로리터의 복제 유도 용액을 추가합니다.

3시간 후 37도 섭씨, 250RPM에서 0.5밀리리터의 세포를 적절한 기질과 결합하여 14밀리리터 둥근 바닥 튜브에서 최종 농도는 100마이크로몰 수준으로 만듭니다. 그 후 대조군과 실험 샘플을 섭씨 37도, RPM 200rpm에서 추가로 3시간 더 배양합니다.

샘플이 흔들리는 동안, 앞서 보여준 대로 FACS 기계 파라미터를 설정하세요. 그 다음 각 샘플에서 5마이크로리터의 세포를 1밀리리터 PBS가 들어 있는 5밀리리터 둥근 바닥 튜브에 추가합니다. 다음으로 샘플 셀을 로드하고 이벤트 속도를 초당 1000에서 3000회로 설정하세요.

로그 스케일의 전방 산란 영역과 로그 스케일의 측면 산란 영역 산란 플롯을 생성하고, R1 산란 게이트를 싱글렛 이벤트 박테리아 세포를 포함하도록 조정합니다. 그 다음 로그 스케일의 전방 산란과 로그 스케일의 FITC 영역 산란 플롯을 만들고, 음수 셀의 0.1% 미만만 검출되도록 R2 정렬 게이트를 설정합니다. 이제 샘플 튜브를 적재하고 필요에 따라 이벤트 속도를 초당 1000에서 3000회로 재조정하세요.