유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 박테리아 독성 인자와 세포 내 신호 전달의 간섭을 연구하는 것입니다. 이는 안정적인 세포주를 확립하고 관심 단백질을 발현함으로써 달성됩니다 두 번째 단계로 벌크 세포 수준에서 단백질의 활성을 연구하기 위해 유도 발현 벡터 시스템이 생성되어 정의된 단계에서 숙주 세포 신호 캐스케이드를 활성화할 수 있습니다. 다음으로, 관심 단백질의 활성 지점을 좁히기 위해 관심 단백질이 숙주 세포 신호 캐스케이드의 활성화를 방해할 수 있는지 여부를 분석하며, 결과는 아늑한 노란색 Burnett 독성 인자 KA B가 웨스턴 블로팅 분석을 기반으로 백의 하류 및 캐스케이드 3 활성화의 상류에서 apoptotic cascade를 방해하는 것을 보여줍니다.

이 방법은 주어진 박테리아 효과기 단백질이 간섭하는 신호 전달 캐스케이드의 핵심 단계를 식별하는 것과 같은 감염 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 병원성 미생물이 숙주를 조작하는 방법뿐만 아니라 이러한 기본 세포 과정이 어떻게 기능하는지 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 세포사멸(apoptotic cell death)이 발생하는 것을 방지하기 위한 박테리아 전략에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, ons나 pyro ptosis와 같은 세포 사멸 분야의 다른 신호 전달 시스템이나 세포 증식, 유전자 조절 또는 면역 체계의 반응에 관여하는 신호 네트워크에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Mann 연구실의 대학원생인 Stephanie Besler입니다. GFP 또는 GFP를 안정적으로 발현하는 HEK 2 93 세포(예: A 12에서 B)를 파종하여 이 절차를 시작합니다. 100의 조밀도에 우물 판, 우물 당 000의 세포.

다음으로, DNA와 폴리에틸렌 평균 형질주입 시약을 75마이크로리터의 옵트 배지에 별도로 준비하고 복합체 형성을 위해 실온에서 5분 동안 배양합니다. 두 혼합물을 실온에서 15분 동안 함께 배양합니다. 그 후, 폴리에틸렌 DNA 용액을 세포에 적가하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 배양합니다.

transfection 5시간 후 배양 배지에 doxycycline 1ml당 1마이크로그램을 첨가하여 pro apoptotic 단백질의 발현을 유도합니다. 그런 다음 광학 현미경으로 섭씨 37도에서 18시간 동안 5%이산화탄소로 세포를 배양합니다. 수확하기 전에 세포의 세포 사멸 유도 여부를 검사합니다.

apoptotic body의 존재로 검출할 수 있는 유도된 apoptotic cell을 검사합니다. 다음으로 상층액을 제거하고 부착 된 세포를 씻습니다. 따뜻한 PBS로 세포를 100마이크로리터의 2 x lamby 샘플 버퍼에 재현탁합니다.

그런 다음 섭씨 95도에서 5분 동안 가열하고 나중에 사용할 수 있도록 나중에 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 그 후, 6마이크로리터의 상업용 단백질 래더를 분자량 마커로 로드합니다. 그런 다음 12%SDS 페이지 젤에 샘플당 약 40, 000개의 세포를 로드합니다.

겔 전기영동 시스템에서 180볼트의 정전압에서 45-60분 동안 하나의 x laly 러닝 버퍼를 사용하여 겔을 실행합니다. 그 후, 단백질을 PVDF 멤브레인에 BLO하여 16 볼트의 일정한 전압에서 60 분 동안 가열합니다. 트랜스 블롯 SD 반건조 전달 셀을 사용하여 실온에서 1시간 동안 10mL의 MPT로 멤브레인을 차단합니다.

7 ml의 MPT에 7 마이크로 리터의 anti cleaved PARP 항체를 희석합니다. PVDF 멤브레인을 항체 용액과 함께 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 항체 용액을 제거하고 PBS 0.05%Tween 20으로 10분 세척 3회를 수행하고, 배양 후 실온에서 1시간 동안 MPT 7ml에 희석한 1.4마이크로리터의 무 과산화효소 접합 2차 항체로 멤브레인을 배양합니다.

PBS 0.05%Tween 20으로 멤브레인을 세 번 세척하고 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 키트로 양고추냉이 과산화효소 활성을 감지합니다. 그리고 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 현상을 위한 표준 장비를 적용합니다. 그런 다음 PBS 0.05%Tween 20으로 3회 세척한 후 실온에서 30분 동안 7ml의 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼로 멤브레인을 배양하여 결합된 항체를 제거하고 섭씨 4도에서 밤새 4ml의 MPT에 4마이크로리터의 안티 액틴 항체로 멤브레인을 조사합니다.

다음날, 약 10 밀리리터의 PBS 0.05 % Tween 20으로 멤브레인에서 10 분 세척 단계를 3 회 수행 한 다음 실온에서 1 시간 배양 후 7 밀리리터의 MPT에 희석 된 1.4 마이크로 리터의 무 과산화 효소 접합 2 차 항체로 멤브레인을 배양합니다. PBS 0.05%Tween 20으로 멤브레인을 세 번 세척하고, 상용 키트로 무 과산화효소 활성을 감지하고, 필름 현상을 위한 표준 장비를 적용하여 단백질 금지를 시각화합니다. 이 실험에서는 HEK 2 93 GFP 및 HEK 2 93 GFP sabe 세포의 전체 세포 용해물을 GFP가 안정적인 발현을 보이도록 면역 혈액 처리했습니다.

HEK 2 93 GFP 및 HEK 2 93 GFP sabe 세포의 대표적인 유세포 분석 분석은 GFP 발현의 강도를 보여줍니다. HEK 2 93 GFP 및 HEK 2 93 GFP sabe 세포를 4개의 마이크로몰 스포린으로 6시간 동안 처리하여 내인성 세포사멸을 유도했습니다. 세포사멸은 절단된 PARP 면역 블롯 분석으로 분석되었으며, PARP 절단은 HK 2 93 GFP 세포에 비해 HK 2 9 3 GFP SA B 세포에서 감소하는 것으로 나타났습니다.

CB는 bax 유도 세포사멸로부터 보호하지만 caspase 3 유도 세포사멸로부터는 보호하지 않습니다. 이 절차를 구현하는 동안 상호 작용 단계를 식별하는 데 도움이 되도록 신호 경로의 구성 요소를 가능한 한 많이 조사하는 것이 중요합니다. 또한 선택한 효과기 단백질이 경로 자체를 방해하는지 또는 이 절차에 따른 활성화 단계를 방해하는지 확인하기 위해 바닥 상태와 활성화 상태 모두에서 활성화된 단백질을 테스트하는 것도 좋습니다.

knockdown, knockout, yeast two, hybrid, pull down, post-translational modification 또는 단백질 분해 안정성 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 이러한 미생물 효과기가 정상 숙주 세포 생리학을 조작하는 데 사용하는 정확한 분자 메커니즘은 무엇입니까? 그리고 이것이 병원체의 생존과 전파에 어떤 도움이 될까요?