유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

다음 실험의 전반적인 목표는 박테리아 병원성 인자가 세포 내 신호 전달을 어떻게 방해하는지 연구하는 것입니다. 이는 관심 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 구축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 벌크 세포 수준에서 해당 단백질의 활성을 연구하기 위해 유도성 발현 벡터 시스템을 제작하며, 이를 통해 숙주 세포 신호 전달 폭포(signaling cascade)의 특정 단계를 활성화할 수 있습니다. 다음으로, 관심 단백질이 숙주 세포 신호 전달 폭포의 활성화를 방해할 수 있는지 분석하여 해당 단백질의 작용 지점을 좁혀 나갑니다. 웨스턴 블로팅 분석 결과, cozy yellow Burnett 병원성 인자 KA B가 Bax 하위 및 caspase-3 활성화 상위의 세포사멸 폭포(apoptotic cascade)를 방해하는 것으로 나타났습니다.

이 방법은 특정 세균 이펙터 단백질이 신호 전달 폭포(signal transduction cascade)의 어느 핵심 단계에서 간섭하는지를 식별하는 것과 같이, 감염 생물학 분야의 주요 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 병원성 미생물이 숙주를 어떻게 조작하는지뿐만 아니라, 이러한 기본적인 세포 과정이 어떻게 작동하는지를 더 잘 이해하는 데 도움을 줄 것입니다. 이 방법은 세포 사멸(apoptotic cell death)의 발생을 막으려는 세균의 전략에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 네크로프토시스(necroptosis)나 파이롭토시스(pyroptosis)와 같은 세포 사멸 분야의 다른 신호 전달 시스템이나 세포 증식, 유전자 조절 또는 면역 체계의 반응에 관여하는 신호 전달 네트워크에도 적용될 수 있습니다.

이 실험 절차는 Mann 연구실의 대학원생인 Stephanie Besler가 시연하겠습니다. 먼저 GFP 또는 GFP-say B를 안정적으로 발현하는 HEK 293 세포를 12-well 플레이트에 웰당 100,000 cells의 밀도로 분주하여 배양을 시작합니다.

다음으로, DNA와 폴리에틸렌 평균 형질전환 시약을 각각 75 µL의 opt 배지에 준비하고, 복합체 형성을 위해 상온에서 5분 동안 배양합니다. 두 혼합물을 함께 섞어 상온에서 15분 동안 배양합니다. 그 후, 폴리에틸렌 DNA 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.

형질전환 5시간 후, 배양 배지에 1 µg/mL의 doxycycline을 첨가하여 pro-apoptotic 단백질의 발현을 유도합니다. 그 다음, 광학 현미경 하에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 세포를 18시간 동안 배양합니다. 수확 전 세포 사멸 유도 여부를 확인합니다.

세포 사멸 소체(apoptotic bodies)의 존재로 확인 가능한 유도된 세포 자살 세포를 검사합니다. 다음으로, 상층액을 제거하고 부착된 세포를 세척합니다. 따뜻한 PBS로 한 번 세척한 후, 100 µL의 2배 농도 Laemmli 샘플 버퍼에 세포를 재현탁합니다.

그 후 95 °C에서 5분 동안 가열하고, 나중에 사용하기 위해 -20 °C에서 보관하십시오. 그런 다음 분자량 마커로 상용 단백질 래더 6 µL를 로딩하십시오. 이어서 샘플당 약 40,000개의 세포를 12% SDS-PAGE 젤에 로딩하십시오.

1x 랄리(laly) 러닝 버퍼를 사용하여 180V의 정전압에서 45~60분 동안 겔 전기영동 시스템으로 겔을 전개합니다. 이후 PVDF 멤브레인에 16V의 정전압으로 60분 동안 단백질을 전사(blot)합니다. 이때 Trans-Blot SD 세미-드라이 전사 셀을 사용하며, 그 다음 10mL의 MPT 용액에 담가 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 블로킹합니다.

7 µL의 anti cleaved PARP 항체를 7 mL의 MPT에 희석합니다. PVDF 막을 항체 용액과 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 항체 용액을 제거하고 PBS 0.05% Tween 20으로 10분씩 3회 세척합니다. 배양 후, 7 mL의 MPT에 희석한 1.4 µL의 horse radish peroxidase 접합 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 막을 배양합니다.

PBS 0.05%Tween 20으로 멤브레인을 3회 세척하고, 제조사의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 서양Horseradish peroxidase(HRP) 활성을 검출합니다. 그런 다음 단백질 밴드를 시각화하기 위해 표준 필름 현상 장비를 사용합니다. 이어서 PBS 0.05%Tween 20으로 3회 세척한 후, 멤브레인을 7 mL의 western blot stripping buffer와 함께 상온에서 30분 동안 배양하여 결합된 항체를 제거합니다. 마지막으로 4°C에서 하룻밤 동안 4 mL의 MPT에 희석한 4 µL의 anti actin 항체로 멤브레인을 프로빙합니다.

다음 날, 막을 약 10 밀리리터의 PBS 0.05%Tween 20로 10분씩 세 차례 세척한 후, MPT 7 밀리리터에 희석한 1.4 마이크로리터의 horse radish peroxidase 접합 2차 항체와 함께 막을 배양합니다. 상온에서 1시간 동안 배양한 후, PBS 0.05%Tween 20로 막을 세 번 세척합니다. 상용 키트로 horse radish peroxidase 활성을 검출하고, 표준 필름 현상 장비를 사용하여 단백질 밴드를 시각화합니다. 본 실험에서는 HEK 2 93 GFP 및 HEK 2 93 GFP sabe 세포의 전세포 용해물을 GFP에 대해 면역 블로팅하여 안정적인 발현을 확인하였습니다.

HEK 293 GFP 및 HEK 293 GFP sabe 세포의 대표적인 유세포 분석 결과는 GFP 발현 강도를 보여줍니다. 내인성 세포사멸을 유도하기 위해 HEK 293 GFP 및 HEK 293 GFP sabe 세포를 4 µM의 sporin으로 6시간 동안 처리하였습니다. 세포사멸은 cleaved PARP 면역 블롯 분석을 통해 확인하였으며, HEK 293 GFP 세포와 비교하여 HEK 293 GFP sabe 세포에서 PARP 절단이 감소하는 것을 확인하였습니다.

CB는 bax로 유도된 세포 사멸(apoptosis)은 억제하지만, caspase three로 유도된 세포 사멸은 억제하지 않습니다. 이 실험 절차를 수행할 때, 상호작용 단계를 식별하는 데 도움이 되도록 신호 전달 경로의 가능한 많은 구성 요소를 조사하는 것이 중요합니다. 또한, 선택한 이펙터 단백질이 경로 자체를 방해하는지, 아니면 이 절차 이후의 활성화 단계를 방해하는지 판단하기 위해 기저 상태와 활성화 상태 모두에서 활성화되는 단백질을 테스트하는 것이 좋습니다.

이러한 미생물 이펙터가 정상적인 숙주 세포 생리를 조작하기 위해 사용하는 정확한 분자 기전은 무엇인지, 그리고 이것이 병원균의 생존과 확산에 어떻게 도움이 되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 넉다운(knockdown), 넉아웃(knockout), 효모 이중 하이브리드-풀다운(yeast two hybrid pull down), 번역 후 변형 또는 단백질 분해 안정성 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.