Name: 유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 배우세요 유도 발현 시스템을 이용하여 세균 독성 요인이 세포 내 신호 전달 경로, 특히 세포사멸 과정에 미치는 영향을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 병원성 미생물의 숙주 조작 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)의 지원을 받았으며, A.L. 및 C.B.에 대한 Collaborative Research Initiative 796(SFB796)을 통해, 그리고 A.L.에 대한 ERA-NET PathoGenoMics 3차 호출을 통해 지원되었습니다.

관심의 단백질을 발현 안정적인 세포주 1 세대 <ol><li> 열 - 불 활성화 FCS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 용지를 준비 시판 Dulbecco&#39;s은 루타-I, 피루브산 4.5 g / L D- 글루코스로 보충 된 이글 중간 (DMEM)를 수정한다. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미디어 HEK293 세포를 배양. 모든 사흘 세포를 하위 육성. 용지를 제거하고 15 ml의 신선한 매체 세포를 재현 탁. 새로운 75cm 2 세포 배양 플라스크에 넣고 피펫 1ml를 14 ml의 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혈구를 이용하여 세포 수를 분석한다. </li><li> 웰 당 2 × 105 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 HEK293 세포는 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 형질 감염을 위해 형질 전환 시약의 제조업체에서 제공하는 프로토콜을 사용한다. 형질 전환 시약을 사용하여있는 pEGFP-C2 나있는 pEGFP-C2-CaeB와 세포를 형질. 사용 형질 reag을 따뜻하게 이전ENT과 RT에 필요한 매체. DNA로 형질 전환 시약 : 1 비율 3을 사용합니다. <ol><li> 구체적으로는, 피펫 직접 무 혈청 DMEM 배지 50 ㎕를 형질 감염 시약으로 1.5 μL. 복합체 형성의 경우, 트랜 스펙 션 시약 혼합물을 함유하는 DNA 인코딩 GFP 또는 GFP-CaeB 0.5 μg의 피펫 및 RT에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 적가 방식으로 반응 혼합물을 첨가하여 세포를 형질 감염 24 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 배양한다. </li></ol></li><li> 1 ㎎을 추가 / 5 % CO 2에서 37 ° C에서 GFP 양성 클론의 선택을 위해 네티 ㎖로. </li><li> 1 비율 : 6 일 후, 1 중간 HEK293 상층 액을 품고 96 웰 플레이트에 정렬 유동 세포 계측법에 의해 단일 ​​세포를 분리. 4,966 × g으로 15 분간 원심 분리 하였다 배양 합류 HEK293 세포로부터 HEK293 상등액을 생성한다. </li><li> 다음 날, 배지를 포함하는 1.5와 배지를 대체0; ㎎ / ㎖ 네티. 일주일에 한 번 미디어를 변경합니다. 세포가 컨 플루 언트 단일 층을 형성하는 경우, 24 웰 플레이트로 옮긴다. 1.5 mg의 / ml의 제 네티 함유 배지에서 5 : 1의 비율로 일주일에 두 번 세포를 서브 배양. 마지막으로, 면역 블롯 분석에 의해 GFP 양성 세포의 비율을 분석하고 유동 세포 계측법. </li></ol> 면역 블롯 분석에 의한 안정적인 세포주 2. 분석 <ol><li> 상층 액을 제거하고 따뜻한 PBS로 한 번 부착 된 세포를 씻으십시오. -20 ° C에서 5 ° C에서 95 분, 상점 배 램 믈리 시료 완충액, 열 100 ㎕에 세포를 재현 탁. </li><li> 12 % SDS-PAGE 겔에 샘플 당 약 4 × 10 4 세포를로드합니다. 또한, 분자량 마커로서 상업적 단백질 사다리 하중 6 μL. 1X 실행 램리 버퍼 45-60 분 동안 180 V의 정전압 하에서 겔 전기 시스템에서 젤을 실행. </li><li> PVDF 막 위에시킨다 단백질 (0의 기공 크기.트랜스 - 블롯의 SD 세미 드라이 전송 셀을 사용하여 60 분 동안 16 V의 정전압에서 45 μm의). </li><li> PBS 중 5 % 탈지 분유 10 ㎖ / 0.05 % 트윈 20 (MPT) RT에서 1 시간 동안 블럭 막. </li><li> MPT 4 ㎖에 방지 GFP 항체의 4 μl를 희석하고 4 ℃에서 막 O / N을 품어. </li><li> 10 ml의 PBS / 0.05 % 트윈 (Tween) 20 세에서 10 분 세척 단계를 수행한다. </li><li> MPT 4 ㎖의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 접합 이차 항체 0.8 μL와 함께 막을 인큐베이션. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, PBS로 세포막을 세 번 세척 / 0.05 % 트윈 20 (2.6에 기술 된 바와 같이) 및 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 개발을위한 표준 장비를 적용합니다. </li></ol> 3. 흐름 사이토를 사용하여 세포를 분석 할 수 있습니다. <ol><li> PBS로 세포를 재현 탁. 순방향 SC를 조정할 음성 대조군으로서 HEK293 세포를 사용atter (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC) 세포 규모되도록. 세포는 이중, 단위 및 세포 파편을 제외하여 살아있는 세포에 게이트를 그립니다. </li><li> 흠없는 세포가 훨씬 FL1 채널 (488 nm의 아르곤 레이저)에 대한 히스토그램의 왼쪽에 있도록 광전자 증 배관 (PMT)의 이득을 조정합니다. </li><li> HEK293-GFP 및 HEK293-GFP-CaeB 세포의 형광 강도를 분석하는 FL1 채널의 히스토그램을 열고 게이트 모집단 만 이벤트를 취득. </li><li> 상업적 FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol> 유도 성 발현 벡터 시스템과 안정적인 세포주 4. 형질 <ol><li> 종자 HEK293 세포를 안정적 / 웰의 1 × 105 세포의 밀도로 12 웰 플레이트에서 GFP 또는 GFP-CaeB 표현. </li><li> 19 시간 후 - 시드, 레귤레이터 플라스미드 및 응답 플라스미드 중 인코딩 Bax의 또는 활성화 된 카스파 제 3 세포를 공동 - 형질. <ol><li> 안정된 HEK293 세포를 공동 트랜pWHE125-P 레귤레이터 플라스미드 100 NG (그림 2)와 응답 플라스미드 pWHE655-hBax 또는 pWHE655-revCasp3 (그림 3)과 폴리에틸렌 이민 0.4 μL의 100 NG와. </li><li> 옵티-MEM 배지의 75 μL의 DNA와 폴리에틸렌 이민 형질 전환 시약을 각각 준비하고 실온에서 정확히 5 분 동안 품어. 복합체 형성의 경우, RT에서 15 분 동안 혼합물 모두를 함께 배양한다. </li></ol></li><li> 폴리에틸렌 이민 / DNA 용액 드롭 현명한 세포를 추가하고 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어. </li></ol> 세포 사멸 5. 유도 <ol><li> 트랜 스펙 션 후 5 시간은 배지 1 μg의 / ㎖의 독시사이클린을 첨가하여 프로 - 세포 사멸 단백질의 발현을 유도한다. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 18 시간 동안 세포를 인큐베이션. </li></ol> 면역 블롯 분석에 의한 숙주 세포 사멸 6. 분석 <ol><li> 시간 전에 세포 검사광학 현미경 arvesting하는 세포 사멸 유도를 확인합니다. 사멸 세포가 죽어가는 세포를 둘러싸는 세포 자멸 소체의 존재시켜 검출한다. </li><li> 상층 액을 제거하고 따뜻한 PBS로 한 번 부착 된 세포를 씻으십시오. -20 ° C에서 5 ° C에서 95 분, 상점 배 램 믈리 시료 완충액, 열 100 ㎕에 세포를 재현 탁. </li><li> 12 % SDS-PAGE 겔에 샘플 당 약 4 × 10 4 세포를로드합니다. 또한, 분자량 마커로서 상업적 단백질 사다리 하중 6 μL. 1X 실행 램리 버퍼 45-60 분 동안 180 V의 정전압 하에서 겔 전기 시스템에서 젤을 실행. </li><li> 트랜스 - 블롯 SD 세미 드라이 전송 셀을 사용하여 60 분 동안 16 V의 전압을 일정 PVDF 멤브레인 상에 도말 단백질 (0.45 ㎛, 기공 크기). </li><li> PBS 중 5 % 탈지 분유 10 ㎖ / 0.05 % 트윈 20 (MPT) RT에서 1 시간 동안 블럭 막. </li><li> 4 μ를 희석MPT 4 용액에 안티 - 절단 폴리 ADP 리보오스 중합 효소 (PARP) 항체의 L과 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 10 ml의 PBS / 0.05 % 트윈 (Tween) 20 세에서 10 분 세척 단계를 수행한다. </li><li> 4 ML의 MPT에 희석 0.8 μL 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 - 복합 이차 항체와 세포막을 품어. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, PBS로 세포막을 세 번 세척 / 0.05 % 트윈 20 (6.7에 기술 된 바와 같이) 및 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 개발을위한 표준 장비를 적용합니다. </li><li> 7 ml의 서쪽 오점 스트립 버퍼로 실온에서 30 분 배양에 구속 항체를 제거합니다. </li><li> PBS로 세 세척 / 0.05 % (6.7에서 설명) 트윈 (20) 후, 4 ℃에서 MPT O / N의 4 용액에 안티 굴지 항체의 4 μL와 세포막을 조사. </li><li> (6.7에서 설명) MPT 세 세척 단계 후, 호 0.8 μL와 세포막을 품어rseradish 퍼 옥시다아제 접합 이차 항체는 MPT 4 ㎖에 희석 하였다. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, 0.05 % / PBS로 막은 6.7에 기재된 트윈 20 (세 번 세척하고 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화 막 개발 표준 장비를 적용한다. 참고 : 모든 배양 단계가 지정된 시간과 온도에 대한 플레이트 진탕 기에서 수행되었다. </li></ol>

<ol><li>Galán, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li>
<li>Banga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+inhibits+macrophage+apoptosis+by+targeting+pro-death+members+of+the+Bcl2+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).</li>
<li>Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Legionella+pneumophila-translocated+substrate+that+is+required+for+growth+within+macrophages+and+protection+from+host+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).</li>
<li>Schmid, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translocated+bacterial+protein+protects+vascular+endothelial+cells+from+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis.</a> PLoS Pathog. 2 (11), e115(2006).</li>
<li>Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pathogen-induced+apoptosis+by+a+Coxiella+burnetiitype+IV+effector+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).</li>
<li>Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+bacterial+pathogens+and+mitochondrial+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).</li>
<li>Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coxiella+burnetii+type+IV+secretion+system+substrate+CaeB+inhibits+intrinsic+apoptosis+at+the+mitochondrial+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level.</a> Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).</li>
<li>Raymond, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+trafficking%2C+apoptosis%2C+and+innate+immunity+by+type+III+secretion+system+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors.</a> Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).</li>
<li>Eckart, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiapoptotic+activity+of+Coxiella+burnetii+effector+protein+AnkG+is+controlled+by+p32-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking.</a> Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).</li>
<li>Byrne, G. I., Ojcius, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+and+apoptosis%3A+life+and+death+decisions+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).</li>
<li>Delft, M. F., Huang, D. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+Bcl-2+family+of+proteins+interact+to+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis.</a> Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).</li>
<li>Willis, S. N., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+in+the+balance%3A+how+BH3-only+proteins+induce+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis.</a> Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).</li>
<li>Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+Bcl-2+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714(2013).</li>
<li>Cory, S., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl2+family%3A+regulators+of+the+cellular+life-or-death+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch.</a> Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).</li>
<li>Adams, J. M., Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosomes%3A+engines+for+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosomes: engines for caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).</li>
<li>Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xk-related+protein+8+and+CED-8+promote+phosphatidylserine+exposure+in+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells.</a> Science. 341 (6144), 403-406 (2013).</li>
<li>Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+throes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell death throes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).</li>
<li>Enari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-activated+DNase+that+degrades+DNA+during+apoptosis%2C+and+its+inhibitor+ICAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD.</a> Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).</li>
<li>Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mammalian+gene+regulation+concepts+on+functional+genomic+research%2C+metabolic+engineering%2C+and+advanced+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies.</a> Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).</li>
<li>Felsher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+oncogene-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Reversibility of oncogene-induced cancer.</a> Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).</li>
<li>Kozlova, E. N., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+differentiation+of+stem+cells+in+vivo+by+tetracycline-controlled+expression+of+key+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors.</a> Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).</li>
<li>Reijmers, L., Mayford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+active+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic control of active neural circuits.</a> Front Mol Neurosci. 2, 27(2009).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hillen, W., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+expression+of+Tn10+.encoded+tetracycline+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance.</a> Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).</li>
<li>Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-reversible+silencing+of+eukaryotic+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters.</a> Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mouse+strain%2C+position+of+integration+and+tetracycline+analogue+on+the+tetracycline+conditional+system+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice.</a> Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).</li>
<li>Rang, A., Will, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetracycline-responsive+promoter+contains+functional+interferon-inducible+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements.</a> Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).</li>
<li>Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tetracycline+controlled+activation%2Frepression+system+with+increased+potential+for+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells.</a> J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).</li>
<li>Knott, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+conditional+suicide+switch+using+doxycycline-dependent+expression+of+human+tBid%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid.</a> Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).</li>
<li>Danilchanka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outer+membrane+channel+protein+of+Mycobacterium+tuberculosis+with+exotoxin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).</li>
<li>Danke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjusting+transgene+expression+levels+in+lymphocytes+with+a+set+of+inducible+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters.</a> J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).</li>
<li>Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+rapid+and+slow+induction+of+apoptosis+obtained+by+inducible+expression+of+pro-apoptotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins.</a> Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+constitutively+active+recombinant+caspases-3+and+-6+by+rearrangement+of+their+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).</li>
<li>Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+two+gene+activities+by+tetracycline+via+a+bidirectional+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter.</a> Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).</li>
<li>Anastassiadis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+predictable+ligand+regulated+expression+strategy+for+stably+integrated+transgenes+in+mammalian+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture.</a> Gene. 298 (2), 159-172 (2002).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneity+and+long-term+stability+of+tetracycline-regulated+gene+expression+with+low+basal+activity+by+using+the+rtTA2S-M2+transactivator+and+insulator-flanked+reporter+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors.</a> Gene. 327 (1), 61-73 (2004).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Agha-Mohammadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+tetracycline-regulatable+promoter%3A+repositioned+tet+operator+elements+optimize+transactivator+synergy+while+shorter+minimal+promoter+offers+tight+basal+leakiness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness.</a> J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).</li>
<li>Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+transgene+expression+by+lentivirus+vectors+containing+second-generation+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters.</a> J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).</li>
<li>Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetracycline-dependent+expression+vector+with+low+basal+expression+and+potent+regulatory+properties+in+various+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines.</a> Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).</li>
<li>Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Tet-responsive+promoters+with+minimized+background+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression.</a> BMC Biotechnol. 10, 81(2010).</li>
<li>Heinz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+and+transposon-based+tet-regulated+all-in-one+vectors+with+reduced+background+expression+and+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).</li>
<li>Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+transcription+regulatory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems.</a> Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).</li>
<li>Ye, H., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+therapeutic+gene+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

많은 병원성 박테리아는 분비 또는 숙주 세포에 박테리아 효과기 단백질을 분비하기 위해 이동시키다 시스템 항구. 이러한 이펙터 단백질은 박테리아가 생존하고 각 세포의 틈새 내에 복제 할 수 있도록 숙주 세포에서 처리하고 경로를 조절하는 능력을 갖는다. 생화학 활동 및 효과기 단백질의 분자 메커니즘을 이해하면 병원성의 더 나은 이해를 향해 도움 질병을 퇴치하기위한 새로운 치료 도구 개발하는 데 도움이 될 수있다. 더욱이, 효과기 단백질 자주 숙주 세포 활동을 모방하여 그 기능을 발휘하는 것처럼, 이들은 또한 하나의 진핵 세포 생물학에 대한 자세한 내용을 사용할 수있다. 효과기 단백질 중 1) 기능의 중복, 효과기 단백질의 결합, 2) 시간 조절 및 3) effec : 그러나, 단일 이펙터 단백질의 생화학 적 활성을 연구하는 것은 여러 가지 이유로 복잡 할 입증그 기능을 방해, 다른 이펙터 단백질과 문맥에서 작업 토르 단백질. 따라서, 이펙터 단백질의 활성은 일반적으로 과발현 연구가 검토되고있다. 불행하게도, 이...

많은 그람 음성 박테리아 병원균의 독성은 진핵 숙주 세포를 납치 전문 분비 시스템에 따라 달라집니다. 박테리아 세포 생화학 다양한 활동을 조절하는 숙주 세포에 박테리아 병원성 단백질 (이펙터) 주입이 분비 시스템을 사용한다. 효과기 단백질의 연구는 호스트 / 병원균 상호 작용의 기본적인 양상에 또한 진핵 세포 (1)의 기초 생물학에 현저한 통찰력을 제공하고뿐만 아니라. 숙주 세포 사멸의 조절은 많은 세포 내 병원체에 대한 중요한 독성기구 것으로 도시되었으며, 세포 사멸을 조절 효과기 단백질의 수는 2-9 확인되었다. 그러나, 이들 활동의 정확한 분자 메커니즘은 많은 경우에 남아 도비. 아폽토시스 프로그램 된 세포 사멸의 형태는 감염 10의 면역 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 사멸에 이르는 두 가지 주요 경로는이확인되었다 : 원형질막 (외인성 사멸)에서 세포 사멸 수용체를 통하여 미토콘드리아 (극한 아폽토시스) 또는 신호 전달의 직접적인 타겟팅. 고유 또는 미토콘드리아 매개 세포 사멸 경로는 세포 내 신호에 의해 트리거 백스와 박,하는 Bcl-2 가족의 두 프로 - 세포 사멸 회원의 활성화를 포함한다. 이 패밀리는 세포 사멸을 조절 11-14 프로 및 안티 사멸 조절 단백질로 구성된다. 백스와 박가 세포질에 시토크롬 C 릴리스의 결과로, 미토콘드리아 외막의 후속 투과성으로 다음의 세포 사멸의 활성화는 올리고머로 연결됩니다. 시토크롬 C의 릴리스는 apoptosome을 15 카스파 제 9의 활성화를 통해 이펙터 카스파 3과 7의 활성화를 시작합니다. 이것은 다른 사람의 사이에서, 세포 표면 (16)에 포스파티딜 세린의 노출 결과, 선택된 기판의 단백질 분해로 연결하고 채널을 프래그먼트 전용 DNase의를 해제romatin (17, 18). 개별 이펙터 단백질 방해 사멸 캐스케이드 내에 유도 발현 시스템 (19)을 사용 위치를 판별하기 위해. 유전자의 조건식을위한 규제 시스템은 세포 내에서 단백질의 기능이나 조직, 기관 및 유기체 개발의 중요성뿐만 아니라, 개시, 진행 및 질병 20-23의 유지 보수시를 분석에 매우 중요한 도구왔다. 전형적으로, 이러한 시스템 테트 금회 24 유도 성 제어 시스템은 인공 전사 부 (도 1 참조)를 형성한다. 하나의 컴포넌트는 전사 활성화 또는 24, 26 사일런을 매개 포유류 단백질 도메인 박테리아 전사 리프레 TetR 25의 융합에 의해 형성 TTA (테트라 사이클린 - 의존성 전사 활성제)라고 인위적 조작 된 전사 인자이다. 2 성분은 하이브리드프로모터, 적어도 TATA 박스 및 전사 개시 부위를 포함하는, 진핵 최소 프로모터로 이루어진, TRE (테트라 사이클린 - 반응 요소)라고 TetR, TETO 24,25 대한 동족 DNA 결합 부위의 다중 반복에 접합. 제 3 성분은 TetR, 테트라 사이클린 또는 독시사이클린 또는 anhydrotetracycline 25 그의 유도체, 하나의 천연 리간드이다. 문화 매체에 리간드 또한시, TetR는 TETO에 대한 친 화성을 ​​잃고 트레에서 해리. 결과적으로, 표적 유전자의 전사가 폐지된다. 형질 전환 유전자 발현, 즉, 단단히 모두 세포 배양 시간 및 용량 - 의존적으로 동물 20,23,24 제어 될 수있다. TTA으로, 도입 유전자의 발현은 항생 물질의 존재를 제외하고는 구조적으로 발생한다. 테트라 사이클린 제 트랜스 expressio 전에, 시스템으로부터 제거되어야하기 때문에 이는 세포 독성 또는 발암 단백질의 연구에서 불리 할 수​​있다N이 발생하고 세포에 표적 단백질의 효과를 모니터링 할 수있다. 이것은 많은 시간이 소요될 수 특히 형질 전환 동물 (27)에, 항상 완전하지 않습니다 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 독시사이클린의 존재에 응답하여 역으로 TetR 변이주 새로운 전사 인자를 생성하는 데 사용 된, rtTA 28 (TTA 역방향). 그것은 단지 TRE에 결합하고, 부수적으로, 독시사이클린의 존재 하에서 전사를 활성화시킨다. 시스템, 즉 잔류 leakiness., TRE - 결합 전사 인자의 부재하에 트랜스 유전자 발현, 게놈 통합 사이트 위치 효과로부터의 (ⅰ)을 발생, (ⅱ) TRE 자체 (29), 또는 (ⅲ) 비부터 특이 TTA / rtTA 28의 결합, 추가 전사 사일런서를 도입하여 해결하고, 시스템 (테트라 사이클린 - 의존성 전사 소음기) (30)를 TTS 불린다. 그것은 rtTA (도 1 참조)과 함께 이중 조절기 네트워크를 형성한다.독시 싸이클린이없는 경우, TTS는 트레에 결합 적극적으로 남아있는 전사를 종료합니다. 독시사이클린의 존재 하에서 TTS는 TRE로부터 해리 rtTA 동시에 표적 유전자의 발현을 유도 결합한다. 엄격이 추가 레이어는 활성이 높은 세포 독성 단백질 31-34을 표현하는 것이 필요하다. 이 엄격하게 제어 듀얼 레귤레이터 시스템을 사용하여 세포 사멸 캐스케이드 주어진 이펙터 단백질이 아폽토시스 유도를 방해 할 수 있는지 여부를 분석 할 수 있도록 정의 단계에서 시작될 수있다. 이 방법은 세균 효과기 단백질의 세포 자멸 억제 활성을 연구하기 위해 사용될뿐만 아니라, 프로 - 세포 사멸 또는 독성 단백질의 발현을위한 유도 성 또는 다른 신호 전달 경로와 간섭을 해부 용 수 없다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>생명 과학 기술</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>펜/연쇄상 구균</td><td>생명 과학 기술</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>생명 공학</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polyscienes</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>는</td> GFP에 반대하는 IPVH00010 <td></td></tr><tr><td>있습니다&nbsp;</td><td>life technologies</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>anti-cleaved PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>anti-actin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Restore Plus 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

여기에 제시된 기술은 신호 전달 경로의 구성 요소와 상호 작용하는 하나의 표적 단백질, 또는 대안 적 소분자 단계를 분석 할 수있다. 방법을 기반으로 한 손으로, 특정 단백질의 발현 유도에 선택된 시그널링 캐스케이드에서 정의 된 소정의 단계에서의 시그널링 이벤트를 개시한다. 발현 된 목적 단백질의 활성이 얻어지는 신호 전달 경로의 판독에 따라, 상류 측에 위치 또는 개시 시그널링 이벤트의 하류 경우 병용 식 반면에, 관심의 유전자의 후 조사자 평가할 수있다. 여기, 세포 사멸 폭포는 프로토콜의 기능을 보여주기 위해 정의 된 신호 전달 경로로 선정되었다. 이러한 Coxiella burnetii 등의 병원균, 박테리아 세포에서의 생존을 보장하기 위해 숙주 세포에서 숙주 세포 사멸 유도 방해 효과기 단백질을 이동시키다 촉진 그들의유기체의 보급. C. burnetii 효과기 단백질 CaeB 효과적으로 UV 광 또는 스타 우로 스포린과 함께 아폽토시스의 유도 후 숙주 세포 사멸을 억제한다. 단계 CaeB는 세포 사멸 신호의 전파를 방해하는 좁히려, 잘 특성화 프로 - 세포 사멸 활성을 선택 단백질은 독시사이클린 유도 방식으로 일시적으로 발현되었다. CaeB이 단백질의 상류 역할을하는 경우, 세포 사멸은 방해받지 않고 진행됩니다. CaeB 하류 작용하면, 세포 사멸을 억제한다. 선택된 테스트 단백질 주요 집행자 프로테아제 인 미토콘드리아의 레벨, 및 카스파 제 3, Bax의 작용에이었다. CaeB는 Bax의 발현에 의해 유도되는 세포 사멸을 방해,하지만 카스파 제 3 식으로. CaeB, 따라서,이 두 단백질 사이의 사멸 캐스케이드와 상호 작용한다.

먼저, GFP 융합 단백질로서 안정적으로 관심 (CaeB)의 단백질을 발현하는 HEK293 세포주를 확립 하였다. 대조군으로서, 안정적 GFP를 발현 HEK293 세포주는 또한 생성 하였다. 및 GFP-CaeB GFP의 발현은 면역 블롯 분석에 의해 확인되었다. 대표적인 면역 (그림 4A)는 GFP와 GFP - CaeB의 안정적이고 명확하게 검출 식을 보여줍니다. 모든 세포가 GFP 또는 GFP - CaeB을 표현 여부 그러나이 분석은 확인할 수 없습니다. 따라서, 안정하게 형질 감염된 HEK293 세포주는 유동 세포 계측법으로 분석 하였다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 양쪽 세포주에서 세포의 90 % 이상은 GFP를 발현. 따라서, 이들 안정적인 세포주는 또한 CaeB의 기능을 분석하는데 사용될 수있다. 다음 단계에서, CaeB의 세포 자멸 억제 활성은 PARP 절단에 대한 항체를 사용하여 면역 블롯 분석으로 측정 하였다. 핵 PARP의 단백질 분해 절단은 DN...

여기에 설명된 방법은 anti-apoptotic bacterial effector 단백질의 활성을 해부하기 위해 정의된 단계에서 apoptotic signaling cascade를 유도하는 데 사용됩니다. 이 방법은 또한 pro-apoptotic 또는 독성 단백질의 유도성 발현 또는 다른 신호 경로와의 간섭을 해부하는 데 사용할 수 있습니다.

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

다음 실험의 전반적인 목표는 박테리아 병원성 인자가 세포 내 신호 전달을 어떻게 방해하는지 연구하는 것입니다. 이는 관심 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 구축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 벌크 세포 수준에서 해당 단백질의 활성을 연구하기 위해 유도성 발현 벡터 시스템을 제작하며, 이를 통해 숙주 세포 신호 전달 폭포(signaling cascade)의 특정 단계를 활성화할 수 있습니다. 다음으로, 관심 단백질이 숙주 세포 신호 전달 폭포의 활성화를 방해할 수 있는지 분석하여 해당 단백질의 작용 지점을 좁혀 나갑니다. 웨스턴 블로팅 분석 결과, cozy yellow Burnett 병원성 인자 KA B가 Bax 하위 및 caspase-3 활성화 상위의 세포사멸 폭포(apoptotic cascade)를 방해하는 것으로 나타났습니다.이 방법은 특정 세균 이펙터 단백질이 신호 전달 폭포(signal transduction cascade)의 어느 핵심 단계에서 간섭하는지를 식별하는 것과 같이, 감염 생물학 분야의 주요 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 병원성 미생물이 숙주를 어떻게 조작하는지뿐만 아니라, 이러한 기본적인 세포 과정이 어떻게 작동하는지를 더 잘 이해하는 데 도움을 줄 것입니다. 이 방법은 세포 사멸(apoptotic cell death)의 발생을 막으려는 세균의 전략에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 네크로프토시스(necroptosis)나 파이롭토시스(pyroptosis)와 같은 세포 사멸 분야의 다른 신호 전달 시스템이나 세포 증식, 유전자 조절 또는 면역 체계의 반응에 관여하는 신호 전달 네트워크에도 적용될 수 있습니다.이 실험 절차는 Mann 연구실의 대학원생인 Stephanie Besler가 시연하겠습니다. 먼저 GFP 또는 GFP-say B를 안정적으로 발현하는 HEK 293 세포를 12-well 플레이트에 웰당 100,000 cells의 밀도로 분주하여 배양을 시작합니다.다음으로, DNA와 폴리에틸렌 평균 형질전환 시약을 각각 75 µL의 opt 배지에 준비하고, 복합체 형성을 위해 상온에서 5분 동안 배양합니다. 두 혼합물을 함께 섞어 상온에서 15분 동안 배양합니다. 그 후, 폴리에틸렌 DNA 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다.형질전환 5시간 후, 배양 배지에 1 µg/mL의 doxycycline을 첨가하여 pro-apoptotic 단백질의 발현을 유도합니다. 그 다음, 광학 현미경 하에서 37 °C, 5% CO2 조건으로 세포를 18시간 동안 배양합니다. 수확 전 세포 사멸 유도 여부를 확인합니다.세포 사멸 소체(apoptotic bodies)의 존재로 확인 가능한 유도된 세포 자살 세포를 검사합니다. 다음으로, 상층액을 제거하고 부착된 세포를 세척합니다. 따뜻한 PBS로 한 번 세척한 후, 100 µL의 2배 농도 Laemmli 샘플 버퍼에 세포를 재현탁합니다.그 후 95 °C에서 5분 동안 가열하고, 나중에 사용하기 위해 -20 °C에서 보관하십시오. 그런 다음 분자량 마커로 상용 단백질 래더 6 µL를 로딩하십시오. 이어서 샘플당 약 40,000개의 세포를 12% SDS-PAGE 젤에 로딩하십시오.1x 랄리(laly) 러닝 버퍼를 사용하여 180V의 정전압에서 45~60분 동안 겔 전기영동 시스템으로 겔을 전개합니다. 이후 PVDF 멤브레인에 16V의 정전압으로 60분 동안 단백질을 전사(blot)합니다. 이때 Trans-Blot SD 세미-드라이 전사 셀을 사용하며, 그 다음 10mL의 MPT 용액에 담가 실온에서 1시간 동안 멤브레인을 블로킹합니다.7 µL의 anti cleaved PARP 항체를 7 mL의 MPT에 희석합니다. PVDF 막을 항체 용액과 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 항체 용액을 제거하고 PBS 0.05% Tween 20으로 10분씩 3회 세척합니다. 배양 후, 7 mL의 MPT에 희석한 1.4 µL의 horse radish peroxidase 접합 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 막을 배양합니다.PBS 0.05%Tween 20으로 멤브레인을 3회 세척하고, 제조사의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 서양Horseradish peroxidase(HRP) 활성을 검출합니다. 그런 다음 단백질 밴드를 시각화하기 위해 표준 필름 현상 장비를 사용합니다. 이어서 PBS 0.05%Tween 20으로 3회 세척한 후, 멤브레인을 7 mL의 western blot stripping buffer와 함께 상온에서 30분 동안 배양하여 결합된 항체를 제거합니다. 마지막으로 4°C에서 하룻밤 동안 4 mL의 MPT에 희석한 4 µL의 anti actin 항체로 멤브레인을 프로빙합니다.다음 날, 막을 약 10 밀리리터의 PBS 0.05%Tween 20로 10분씩 세 차례 세척한 후, MPT 7 밀리리터에 희석한 1.4 마이크로리터의 horse radish peroxidase 접합 2차 항체와 함께 막을 배양합니다. 상온에서 1시간 동안 배양한 후, PBS 0.05%Tween 20로 막을 세 번 세척합니다. 상용 키트로 horse radish peroxidase 활성을 검출하고, 표준 필름 현상 장비를 사용하여 단백질 밴드를 시각화합니다. 본 실험에서는 HEK 2 93 GFP 및 HEK 2 93 GFP sabe 세포의 전세포 용해물을 GFP에 대해 면역 블로팅하여 안정적인 발현을 확인하였습니다.HEK 293 GFP 및 HEK 293 GFP sabe 세포의 대표적인 유세포 분석 결과는 GFP 발현 강도를 보여줍니다. 내인성 세포사멸을 유도하기 위해 HEK 293 GFP 및 HEK 293 GFP sabe 세포를 4 µM의 sporin으로 6시간 동안 처리하였습니다. 세포사멸은 cleaved PARP 면역 블롯 분석을 통해 확인하였으며, HEK 293 GFP 세포와 비교하여 HEK 293 GFP sabe 세포에서 PARP 절단이 감소하는 것을 확인하였습니다.CB는 bax로 유도된 세포 사멸(apoptosis)은 억제하지만, caspase three로 유도된 세포 사멸은 억제하지 않습니다. 이 실험 절차를 수행할 때, 상호작용 단계를 식별하는 데 도움이 되도록 신호 전달 경로의 가능한 많은 구성 요소를 조사하는 것이 중요합니다. 또한, 선택한 이펙터 단백질이 경로 자체를 방해하는지, 아니면 이 절차 이후의 활성화 단계를 방해하는지 판단하기 위해 기저 상태와 활성화 상태 모두에서 활성화되는 단백질을 테스트하는 것이 좋습니다.이러한 미생물 이펙터가 정상적인 숙주 세포 생리를 조작하기 위해 사용하는 정확한 분자 기전은 무엇인지, 그리고 이것이 병원균의 생존과 확산에 어떻게 도움이 되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 넉다운(knockdown), 넉아웃(knockout), 효모 이중 하이브리드-풀다운(yeast two hybrid pull down), 번역 후 변형 또는 단백질 분해 안정성 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Berens, C. 외. 유도성 발현 시스템을 적용하여 박테리아 병원성 인자가 세포 내 신호 전달에 미치는 간섭을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 박테리아 효과 단백질 CaeB가 숙주 세포자사멸 연쇄 반응을 방해하는 위치를 식별하기 위해 유도 발현 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 CaeB 발현 세포를 테트라사이클린 반응 시스템으로 형질전환하여 프로세포자사멸 유전자 발현을 유도하는 과정을 개괄하며, 이를 통해 연쇄 반응 내 교란 지점을 식별합니다.

박테리아 효과 단백질을 발현하는 세포로의 유도성 유전자 발현 시스템과의 형질전환

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

이 동영상은 관심 유전자와 조절 플라스미드를 포함하는 플라스미드로 transfection하여 배양된 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법을 설명합니다. 이 플라스미드의 발현은 테트라사이클린 또는 그 합성 유사체에 의해 제어될 수 있으므로 이 시스템은 조절 가능한 유전자 발현을 연구하는 데 유용한 모델입니다.

유도성 Tet-Off 조절 시스템: Tetracycline-Off 시스템을 사용하여 배양된 세포의 유전자 발현을 조절하는 In vitro 방법

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

이 기사는 관심 단백질과 E. coli의 다른 인자 간의 상호 작용을 모니터링하기 위해 부위 특이적 광교차결합과 함께 펄스 추적 무선 라벨링을 사용하는 방법을 설명합니다. 기존의 화학적 가교 방법과 달리 이 접근 방식은 살아있는 세포에서 정렬된 조립 경로의 고해상도 "스냅샷"을 생성합니다.

부위별 교차결합을 사용하여 분비된 박테리아 독성 인자의 조립 모니터링

Electroporation은 정제된 박테리아 독성 효과기 단백질을 살아있는 진핵 세포에 직접 삽입하는 데 사용되었습니다. 단백질 국소화는 컨포칼 면역형광 현미경으로 모니터링했습니다. 이 방법을 사용하면 활성 외인성 단백질을 사용하여 이동, 기능 및 단백질-단백질 상호 작용에 대한 연구를 수행할 수 있으므로 진핵 세포에서 이종 발현의 필요성을 피할 수 있습니다.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

세균성 병원균과 호스트 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 생물학적 연구의 중요한 영역입니다. 여기서는 BLAM 기판을 사용하여 siRNA의 유전자 사일런 동안 Coxiella burnetii에 의해 이펙터 전위를 측정하기 위해 필요한 기술들을 설명한다.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

여기에 설명 된 세포 수준에서 동물의 조직에서 세균 유전자 발현을 분석 하기 위한 방법이입니다. 이 메서드는 감염 동안 조직 환경에 대 한 응답에서 세균성 인구 내에서 발생 하는 phenotypic 다양성을 공부에 대 한 리소스를 제공 합니다.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

배우세요 유도 발현 시스템을 이용하여 세균 독성 요인이 세포 내 신호 전달 경로, 특히 세포사멸 과정에 미치는 영향을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 병원성 미생물의 숙주 조작 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

더 많은 동영상 탐색