GFP 태그 SKN-1을 이용한 C. elegans 의 병원체 유발 산화 스트레스 시각화

먼저 장 세포질에 국소된 전사 인자인 녹색 형광 단백질 표지 SKN-1을 발현하는 C. elegans 벌레 두 판으로 시작합니다. 이 벌레들은 또한 자가형광을 보이는 장내 리포푸신 과립을 포함하고 있습니다.

한 플레이트는 비병원성 박테리아를 대조군으로, 다른 한 판에는 병원성 박테리아를 시험 그룹으로 시딩합니다.

시험군에서는 병원체가 생성하는 과산화수소가 산화 스트레스를 유발하여 SKN-1이 장핵으로 전위되도록 유도합니다.

대조군에서는 SKN-1의 대부분이 세포질에 확산되어 있습니다.

각 판을 완충제로 세척하고 벌레를 튜브에 옮기세요.

원심분리기를 사용해 웜을 분리하고 완충제를 제거하세요.

마취를 위해 아지화나트륨이 포함된 배지를 추가하세요.

지렁이를 아가로스 패드에 부착하고, 덮개를 깔아 형광 현미경으로 관찰하세요. 자가형광을 사용해 핵 경계를 시각화하세요.

검사 중 강한 핵 SKN-1 신호는 대조군의 확산 세포질 신호와 비교하여 핵 재국소화를 나타내며 병원체 유발 산화 스트레스를 확인한다.

피펫을 사용해 THY 연쇄상구균 씨앗 및 NGM 대장균 씨앗 플레이트에 약 100마리의 L4 유충을 추가하세요. 박테리아 균주당 세 개의 플레이트를 사용하세요.

플레이트를 25도 섭씨에서 2시간에서 3시간 정도 부양하세요. 그 후 인큐베이터에서 플레이트를 분리하세요. M9W로 세척하고 벌레를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 담아 모으세요.

원심 단계에서 했던 것처럼 벌레를 세 번 세척하세요. 흡입 압력으로 M9W 대부분을 제거하세요. 그리고 마취용 지충 펠릿에 2밀리몰라 아지드 나트륨 또는 테트라미솔 하이드로클로라이드 500 마이크로리터의 M9W를 추가하세요.

튜브를 웜 펠릿과 함께 실온에서 15분간 부양하세요. 그 다음, 15마이크로리터의 웜 현탁액을 준비된 진천당 패드 위에 떨어뜨립니다. 형광 현미경 아래에서 FITC와 DAPI 필터를 사용하여 SKN-1의 위치를 시각화합니다.

이미지 웜은 10배, 20배 배율로 나타납니다. 벌레의 세 가지 국소화 수준을 기준으로 점수를 매기세요; 낮은 위치(핵 위치가 관찰되지 않음), 중간 정도 위치(SKN-1 BCGFP가 벌레의 앞쪽 또는 후방), 높은 위치(모든 장 세포에서 핵 위치가 관찰되는 경우)입니다.