녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

이 방법은 세포 생물학과 같은 예쁜꼬마선충 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 핵 염색, GFP 및 세포 내 국소화 변화 신호를 동시에 빠르고 효율적으로 얻을 수 있다는 것입니다. 시작하려면 표적 유전자의 번역 구조와 일치하는 염색체 외 배열을 생성합니다.

또는 예쁜꼬마선충 연구를 위한 공개 자원인 Caenorhabditis Genetic Center에서 이러한 계통을 얻을 수 있습니다. 또는 이전에 발표된 연구 실험실에서. 웜을 감마선에 노출시켜 염색체외세포를 유전체에 통합한 후, 각 동물이 GFP 또는 롤러와 같은 마커 단백질을 발현할 수 있도록 안정적으로 발현된 라인을 선택합니다.

방사선 동안 생성된 돌연변이를 제거하려면 선을 최소 두 번 벗어나십시오. 그 결과로 생성된 형질전환 라인을 사용하여 스트레스 하에서 단백질 발현 패턴 변화를 검출할 수 있습니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 NGM 웜 플레이트를 준비한 후 OP50 클론을 줄무늬로 만들고 액체 LB 육수에 박테리아를 밤새 배양합니다.

NGM 플레이트에 액체 OP50 배양액을 파종하고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하여 박테리아 잔디밭을 벌레의 먹이 공급원으로 재배합니다. 사용하기 전에 접시를 실온에서 최소 30분 동안 식히십시오. 열 스트레스 분석 이전에 최소 2세대 동안 기아 없이 섭씨 20도에서 형질전환 라인을 성장시킵니다.

8-10 명의 젊고 육중한 성인을 새로운 지렁이 플레이트로 선택하십시오. 그런 다음 약 3-5 시간 동안 알을 낳고 접시에서 모든 성인을 꺼냅니다. 벌레를 동기화하려면 알을 부화시키고 네 번째 유충 또는 L4 단계까지 약 48시간 동안 유충을 성장시킵니다.

그것은 반달 구조인 외음부로 식별할 수 있습니다. 그런 다음 섭씨 35도에서 2-5시간 동안 L4 유충과 함께 플레이트를 배양하여 벌레에 열 스트레스를 가합니다. 온도를 정확하게 측정하기 위해 인큐베이터에 온도계를 포함하십시오.

10 마이크로 리터의 M9를 유리 슬라이드 중앙에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 열 충격을 받은 웜을 선택하여 버퍼 드롭으로 옮깁니다. 또는 M9를 사용하여 접시에서 벌레를 씻어냅니다.

그런 다음 실온에서 1분 동안 중력의 1000배로 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 유리 슬라이드에 벌레를 추가합니다. 해부 현미경으로 연조직을 사용하여 과도한 액체를 배출합니다.

그런 다음 현미경으로 관찰한 상태에서 10마이크로리터의 95% 알코올을 벌레에 넣고 계속 관찰합니다. 에탄올이 마르면 즉시 에탄올을 두 번 더 첨가하십시오. 그것은 해부 현미경으로 동물에서 에탄올이 증발하는 과정에 매우 중요합니다.

에탄올이 동물에서 떨어지면 즉시 다음 단계로 진행하십시오. 웜에 10마이크로리터의 DAPI를 추가합니다. 즉시 커버 슬립을 적용하고 투명 매니큐어 젤로 슬라이드를 밀봉하십시오.

매니큐어를 약 10분 동안 굳힌 후 형광 현미경으로 동물을 관찰합니다. 동물을 아세톤으로 고정하려면 M9를 사용하여 열 충격 플레이트를 씻어내고 실온에서 1분 동안 중력의 1000배로 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 증류수 1ml를 사용하여 펠릿을 세척합니다.

상등액을 제거한 후 400마이크로리터의 30%아세톤을 첨가하고 샘플을 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 1분 동안 1000배 중력으로 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버린 후 500 마이크로 리터의 증류수를 사용하여 동물을 두 번 씻습니다.

펠릿에 200마이크로리터의 DAPI를 추가하거나 튜브에 대한 총 웜 부피의 4배를 추가하고 샘플을 15분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 500마이크로리터의 증류수를 사용하여 펠릿을 두 번 세척한 후 이전과 같이 장착하고 이미징합니다.

이미징을 수행하려면 UV 광원과 형광 현미경을 켜십시오. 그런 다음 현미경에 연결된 컴퓨터를 켭니다. 슬라이드를 형광 현미경에 로드합니다.

10X 대물 렌즈를 사용하여 벌레를 찾습니다. 그런 다음 배율을 400X로 높이고 표본에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 현미경과 함께 제공된 소프트웨어를 엽니다.

Acquisition을 클릭한 다음 Camera를 클릭하고 현미경에 연결된 카메라를 선택합니다. 동일한 Acquisition(획득)에서 Multidimensional Acquisition(다차원 획득)을 클릭합니다. 그러면 새로운 Multidimensional Acquisition 탐색 창이 열립니다.

다중 채널 버튼을 클릭하면 사용 가능한 모든 채널이 나타납니다. 파란색, 녹색 및 DIC를 선택하여 표본을 관찰합니다. Multidimensional Acquisition 탐색 창에서 파란색 DAPI, 녹색 GFP 및 회색 DIC 채널을 켜진 상태로 두고 빨간색 로다민 및 흰색 명시야와 같은 다른 채널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 닫습니다.

각 채널의 노출 시간을 측정하려면 파란색 DAPI 채널을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 선택하고 측정"을 클릭하여 자동 노출 시간으로 라이브 이미지를 촬영합니다. 라이브 이미지 창의 왼쪽에서 원하는 경우 노출 시간을 수동으로 조정한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 비슷한 방식으로 GFP 및 DIC 채널의 노출 시간을 설정합니다. Multidimensional Acquisition 탐색 창에서 "시작"을 클릭하여 설정된 노출 시간에 따라 세 개의 서로 다른 채널 아래에서 세 개의 이미지를 순서대로 자동으로 수집합니다.

파일을 저장하려면 주 메뉴에서 파일, 다른 이름으로 저장을 클릭합니다.파일 이름과 폴더를 입력합니다. 나중에 참조할 수 있도록 자세한 이미징 정보를 보존할 수 있도록 파일을 기본 파일 형식으로 저장합니다. 파일을 다른 형식으로 내보내려면 File(파일)에서 Export(내보내기)를 클릭합니다.

파일 이름과 폴더를 설정합니다. 검사 프로젝트 폴더 만들기"데이터를 더 잘 구성하려면 드롭다운 메뉴에서 원하는 파일 형식을 선택한 후 시작"을 클릭하여 내보냅니다.

예쁜꼬마선충에는 exl-1과 exc-4의 두 가지 염화물 세포 내 채널 단백질 상동체가 있습니다. 최근 연구에 따르면 exl-1은 동물의 스트레스 관리를 조절합니다. 여기서, translational exl-1 GFP 구조체를 동물 게놈에 통합하고, 녹색 형광 exl-1을 안정적으로 발현하는 형질전환 라인을 생성했습니다.

열 스트레스 하에서 exl-1 GFP는 강한 GFP 신호가 핵과 겹치면서 장 영역의 핵에 축적됩니다. exl-1의 세포 내 국소화를 확인하기 위해 에탄올과 아세톤 고정 동물 모두에서 DAPI 염색을 수행했습니다. 두 방법 모두 동물의 몸에서 명확한 핵을 보여주며, 겹치는 GFP 및 DAPI 신호는 exl-1 GFP가 실제로 장 영역의 핵에 축적되었음을 확인합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 예쁜꼬마선충에서 스트레스 하에서 GFP 신호와 단백질 핵 전좌를 보존하기 위해 빠른 고정을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.