Name: 녹색 형광 단백질 태그와 4, 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 열 스트레스 조건 하에서 GFP 융합 단백질을 이용한 단백질 핵 이동 추적 방법을. DAPI 염색으로 핵과 아형질 위치를 동시에 관찰하여 세포 생물학 연구에 활용하세요.

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이 연구에 사용 된 선 충 C. 긴장 건강-사무실의 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 국가 학회에 의해 지원 되는 꼬마 유전학 센터에서 얻은 했다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다: 1R03AG048578-01 6 월 회담, 6 월 회담, 및 PSC CUNY CCRG 1501-CUNY 66184 00 44와 67248-00 45 6 월 회담을. 우리는 그녀의 실험실 공간을 공유 하는 친절 하 게 대 한 캐시 야만인-던 감사 합니다. 모든 형광 이미지는 퀸 즈 대학 핵심 시설에서 수집 되었다. 원고에 대 한 그의 의견에 감사 윌리엄 J. 쌀 하 고.

1입니다. 솔루션
<ol><li>
NGM 플레이트
	<ol>
<li>2l 삼각 플라스 크에 NaCl의 3 세대, 한 천의 17 g, 펩의 2.5 g와 dH2오 커버 알루미늄 호 일로 플라스 크의 입의 975 mL를 추가 합니다. 압력솥 50 분에 대 한 플라스 크 20-30 분 동안 그것을 멋진.</li>
		<li>멸 균된 솔루션 추가: 1 mL의 1 M CaCl2, 에탄올에 5 mg/mL 콜레스테롤의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO4, 및 1 M KPO4 (pH 6.0) 버퍼의 25 mL. 그들을 잘 혼합 솔루션을 소용돌이 친다.</li>
		<li>액체 디스펜서를 사용 하 여, 60 mm 페 트리 접시에 NGM 솔루션 분배. 한 천의 격판덮개 2/3 전체 채우기. 나중에 사용할 4 ° C에서 밀폐 용기에 그들을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 M KPO4 버퍼 (pH 6.0)
	<ol>
<li>KH2포4 10.83 g와 dH2O, K2HPO4 의 3.56 g 녹 이십시오 다음 100 ml 전체 볼륨을 조정 합니다. 압력솥 15 분에 대 한 솔루션입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>KH2포4, 나2HPO 6 g의 3 세대 분해4및 5 g dH2O, NaCl의 1 mL의 1 M MgSO4, 추가 하 고 1 L. 총 볼륨 조정</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10 µ g/mL DAPI
	<ol>
<li>DAPI dH2오의 999 µ L에 10 mg/mL의 1 µ L을 추가</li>
	</ol>
</li>
	<li>
95% 알콜 (v/v)
	<ol>
<li>100% 알코올의 95 mL를 측정 하 고 증류수 100ml에 볼륨 조절 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
30% 아세톤 (v/v)
	<ol>
<li>DH2O 30 mL의 아세톤을 추가 하 고 100 ml 전체 볼륨을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 열 스트레스
<ol><li>Extrachromosomal 배열 라인과 대상 유전자9,10의 변환 구문 생성 합니다. 또는,에서 꼬마 유전학 센터 (CGC), C. 선 충 연구를 위한 공공 자원 인 또는 이전에 게시 연구 실험실에서 같은 라인을 얻을.</li>
	<li>Extrachromosomal 라인을 3800 Rad γ 방사선9벌레를 노출 하 여 게놈에 통합할. 그런 다음 선택 안정적으로 표현한 라인 롤러 등 GFP 마커 단백질을 표현 하는 동물.</li>
	<li>방사선 중에 생성 된 돌연변이 제거 하려면 outcross 라인 적어도 2 x. 이 유전자 변형 라인을 사용 하 여 스트레스 단백질 식 패턴 변화 감지.</li>
	<li>1.1 단계에서 설명한 대로 NGM 웜 접시를 준비 합니다. OP50 복제를 행진 하 고 하룻밤 액체 LB 국물에 박테리아 문화. 벌레를 위한 음식 근원으로 박테리아 잔디를 성장 씨앗 NGM 접시 액체 OP50와 문화 고 37 ° C 배양 기에서 번호판을 품 어 하룻밤. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 식혀.</li>
	<li>열 스트레스 분석 결과 이전에 적어도 2 세대에 대 한 기아 없이 20 ° C에서 유전자 변형 라인을 성장.</li>
	<li>새로운 벌레 플레이트, 그리고 하자 그들에 대 한 3-5 h에 대 한 알을 8-10 젊은 벗 성인 (자 궁 가득 계란)을 선택 하 고 모든 성인 판에서 제거.</li>
	<li>벌레를 동기화 하려면 계란 해치 고 약 48 h에 대 한 애벌레 애벌레 (L4)의 4 단계로 성장 하자. 그들의 외 음부 구조 (반달 구조) L4 단계 (그림 1, 화살표)11를 식별 하기 위해 검사 합니다.</li>
	<li>열 스트레스를 달성 하기 위해 2-5 h 35 ° C 배양 기에서 L4 애벌레와 벌레 접시를 놓습니다. 정확 하 게 온도 측정 하는 인큐베이터에 온도계를 넣습니다.</li>
</ol>3. DAPI 얼룩
<ol><li>
에탄올 고정
	<ol>
<li>유리 슬라이드 중앙에 M9 버퍼의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>단계 2.8에서에서 열 충격 벌레를 선택 하 고 유리 슬라이드에 M9 버퍼에 넣어.<ol>
<li>또는, M9와 접시를 씻어, 실내 온도에서 1 분 동안 1000 x g 에서 원심 고는 상쾌한 삭제 합니다. 유리 슬라이드에 벌레를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>부드러운 휴지를 사용 하 여 모든 초과 액체를 배출 하. 조심 해 현미경이 단계.</li>
		<li>벌레에 95% 알코올의 10 µ L을 추가 하 고 그들이 건조 한 공기. 해 현미경 과정을 시청 하 고 너무 건조 얻을 하는 동물을 두지 마세요. 에탄올은 동물에서 증발 하 고, 후에 바로 다음 단계로 진행 합니다. 참고: 에탄올 매우 빠르게 증발.</li>
		<li>두 번 반복 단계 3.1.4 벌레 고정 되도록. 참고: 그것은 어두운 하 고 왜곡을 보고 동물에 대 한 정상입니다.</li>
		<li>DAPI의 10 µ L 추가 (10 µ g/mL) 벌레를. 즉시는 coverslip로 그들을 커버 하 고 투명 한 매니큐어 젤 슬라이드 인감.</li>
		<li>형광 현미경에서 약 10 분 후 동물을 보기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
아세톤 고정 (대체 방법)
	<ol>
<li>단계 2.8 m 9에서에서 열 충격 격판덮개 떨어져 세척 하 고 실내 온도에서 1 분 동안 1000 x g 에서 원심은 상쾌한 삭제. 씻어 dH2O의 1 mL와 펠 릿, 펠 릿, 수집 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>1000 x g 실 온에서 1 분에 15 분 원심 분리기에 대 한 30% 아세톤의 400 µ L을 추가 하 고 삭제는 상쾌한. DH2O의 500 µ L를 사용 하 여 씻어 동물 2 x. 폐기는 상쾌한.</li>
		<li>DAPI의 200 µ L 추가 (10 µ g/mL), 또는 15 분 동안 관에서 총 벌레 볼륨의 금액 x 4.</li>
		<li>1 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 2 펠 릿을 세척 dH2오 500 µ L x 벌레 유리 슬라이드에, coverslips와 함께 그들을 커버, 투명 매니큐어 젤, 슬라이드 봉인 놓고 형광 현미경 동물을 관찰.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 현미경 이미징
<ol><li>UV 광원 및 형광 현미경 켭니다. 현미경에 연결 된 컴퓨터를 켭니다.</li>
	<li>형광 현미경에 슬라이드를 로드 합니다. 낮은 전력 목표 렌즈 (10 배)를 사용 하 여 벌레, 찾아서, 400 X, 확대 힘 증가 표본에 집중.</li>
	<li>현미경으로 제공 하는 소프트웨어를 엽니다. 메뉴;에서 "인수" 클릭 "카메라"에 클릭 하 고 현미경;에 연결 된 카메라를 선택 소프트웨어와 통신 하기 위해 선택 된 카메라 수 있습니다. 참고: 다른 현미경 작업에서 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>같은 "수집", "다차원 수집"에 클릭 합니다. 새로운 "다차원 수집" 탐색 창이 열립니다. "다중 채널" 버튼을 클릭 하 고 모든 사용할 수 있는 채널이 표시 됩니다.</li>
	<li>파랑, 녹색, 및 표본 관찰 하 DIC (미분 간섭 명암)를 선택 합니다. "다차원 수집" 탐색 창에서 두고는 "블루-DAPI", "그린-GFP", 및 "회색-DIC", "Nomarski" 채널 "레드-rhodamine" 및 "백색 밝은 분야", 등의 다른 채널을 마우스 오른쪽 단추로 그들을 닫습니다.</li>
	<li>
첫째, 각 채널에 대 한 노출 시간 측정:
	<ol>
<li>"블루-DAPI" 채널을 선택 하 고 다음 자동된 노출 시간 DAPI 채널에서 라이브 이미지 "측정"에 클릭 왼쪽 클릭 하십시오. 라이브 이미지와 함께 새로운 창이 나타납니다.</li>
		<li>라이브 이미지 창의 왼쪽에 원하는 대로 이미지를 만드는 데 필요한 경우 수동으로 노출 시간을 조정 합니다.</li>
		<li>마지막으로, "확인 클릭" 라이브 이미지 창에서. 이 DAPI 채널에서 노출 시간을 설정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다른 채널, "그린-GFP" 및 "회색-DIC", "Nomarski", 그 채널에 대 한 노출 시간을 설정 하려면 4.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>"다차원 수집" 탐색 창에서 "시작" 설정으로 특정 노출 시간 순서 (위 참조) 3 다른 채널에서 3 이미지를 자동으로 수집을 클릭 합니다.</li>
	<li>파일을 저장 하려면 주 메뉴에, "파일" 다음 "다른 이름으로 저장"을 클릭 합니다. 파일 이름 및 폴더 이름을 입력 합니다. 나중에 참조할 수에 대 한 상세한 이미지 정보를 유지 하려면 기본 파일 형식으로 파일을 저장 합니다.</li>
	<li>
다른 형식으로 파일을 내보내려면:
	<ol>
<li>"파일"에 고 "내보내기"를 클릭 합니다. 이것은 수출 설정 창을 열 것 이다.</li>
		<li>파일 이름 및 폴더를 설정 합니다. 데이터 구성 "프로젝트 폴더 만들기"를 선택 합니다. 소프트웨어는 또한 다른 4 옵션을 지정 하려면 사용자 수 있습니다: "생성 병합 이미지", "이미지에 대 한 색상을 사용", "사용 하 여 채널 이름" 및 "결합 된 이미지에 만".</li>
		<li>"TIF", "BMP", "PSD", 또는 "JPG" 및 다른 형식 예: 드롭-다운 메뉴에서 원하는 파일 형식을 선택 합니다. 다음 클릭 하십시오 "시작" 내보낼.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 수 없다.

이 기사는 핵을 세포질 로부터 단백질 subcellular 변경 사항을 확인 하는 신속 하 고 효율적인 방법을 제시. 핵 구조 DAPI 얼룩 (그림 3)에 의해 확인 하는 동안 단백질 식 GFP 융해에 의하여 표시 했다. Immunostaining C. 선 충 단백질 도전 이기 때문에, 대부분 선 충 C. 단백질 subcellular 지 방화 마커 단백질 GFP, 나사로, mCherry, 등 그들을 태그 특징으로하는18,19 , 20 , 21.이 기사에서 gfp 의 단백질 세포질 지 방화를 보여 주기 위해 대상 유전자 exl-1 태그를 사용 되었다. 확인 하려면 핵 지역화, DAPI 얼...

단백질 subcellular 지 방화의 변화는 열 스트레스, 기아, 산화 스트레스, apoptosis, 단백질 인 산화 등 내부 또는 외부 신호에 응답에서 일반적인 메커니즘입니다. 예를 들어 열 스트레스는 FOXO 회원 DAF 16 핵 전 좌1,2, 및3,4신호 수신 죽음 미토 콘 드리 아에 입찰 translocates 프로 apoptotic BCL-2 단백질을 유도 합니다. 다양 한 기술을 이러한 변화를 감지할 수 있습니다. 서 부 럽 고 화학적 분리 subcellular 구조 (예, 미토 콘 드리 아 또는 핵)의 조합을 잘3목표 달성할 수 있었다. 그러나, 그것은 관심사의 단백질에 대하여 특정 항 체를 요구 한다. 따라서, 잘 설립 된 항 체는 성공에 열쇠 된다. 다른 접근은 다른 subcellular 구조 또는 세포 녹색 형광 단백질 (GFP), 빨간 형광 단백질 (RFP), 노란색 형광 단백질 (YFP), mCherry, 등 다양 한 마커 라벨 한편 라벨의 단백질을 다른 표시와 관심입니다. 그런 다음 대상5,6지역화 confocal 현미경 그들을 관찰 합니다. 방사성 동위 원소는 대상 단백질 레이블 및 다음 그들의 subcellular 지 방화7감지 대안 선택 이다. 그러나,이 메서드는 적절 한 교육 및 방사성 폐기물의 처리를 해야합니다. 특정 항 체의 부족, 적절 한 마커의 부재 또는 confocal 현미경 등의 scarceness 상황 대체 접근 고려 될 필요가 있다. 단백질의 핵 전 좌를 식별 하려면 그것만 표시와 함께 대상 단백질을 분류 하 고 얼룩 핵 화학 시 약 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)이만 일반 형광 현미경을 필요로 하기 때문에 함께 매력적입니다.
Immunolabeling C. 선 충 항 체와 달걀 껍질 또는 동물을 둘러싼 collagenous 표 피에의 낮은 침투성으로 인해 도전 이다. 한편, 선 충 C. 단백질 그들의 척추 orthologs에서 크게 분기 이기 때문에, 몇몇 상업 회사 특정 제품 C. 선 충 을 제공 합니다. 자신에 대 한 C. 선 충 항 체를 생성 하는 작은 실험실 어렵습니다. 종종 지역 사회에 있는 연구원은 단백질 지역화 또는 유전자 발현을 보여 주기 위해 태그 단백질 마커로 사용 합니다. 이 문서의 예를 들어 EXL 1::GFP를 사용 하 여 열 스트레스8에서 단백질 핵 전 좌를 추적. 동물 게놈에는 통합된 변환 exl 1::gfp 는 안정적으로 gfp 융해 유전자를 표현 하는 데 사용 됩니다. 연구 exl-1 소장, 체 벽 근육, 및 다른 subcellular 구조8에 표현 했다. 이 프로토콜에서는 벌레 애벌레 4 (L4) 단계로 동기화, 열 스트레스 실험, 및 행위 DAPI 얼룩, 에탄올 고정, 아세톤 고정 및 일반 형광 현미경 이미징 수행 하는 방법을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>Hoechst 33258 및 Hoechst 33342도 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>soft</td></tr><tr><td>tissue Zeiss&nbsp; AX10</td><td>Zeiss</td><td></td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Zeiss</td><td></td><td>현미경 소프트웨어</td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Zeiss</td><td></td><td>디지털 카메라</td></tr><tr><td>인큐베이터&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>투명 네일 폴리쉬 젤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60mm 페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-20 &마이크로; L 피펫터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; L 피펫터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &micro; L 피펫터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-200 &마이크로; L 피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 &마이크로; L 피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 와이어 웜 픽</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 subcellular 지 방화를 감지

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

이 프로토콜, 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합 단백질 및 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 단백질 subcellular 지 방화 변화;을 추적 하는 데는 얼룩 특히, 아래는 열 핵 전 스트레스 조건. 단백질 반응 대응에 외부 및 내부 신호. 공통 메커니즘의 subcellular 지 방화를 변경 하는. 이 문서는 항 체, 방사성 라벨 또는 confocal 현미경 요구 하지 않는 단백질 지 방화를 추적 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 문서에서는, GFP 포유류 CLIC4를 포함 하 여 염화 세포내 채널 단백질 (CLICs) 가족의 C. 선 충, 구성원에에서 대상 단백질 EXL-1 태그 데 사용 됩니다. (모터와 전체 유전자 시퀀스) 통합된 변환 exl 1::gfp 유전자 변형 라인 변환 및 γ 방사선에 의해 창조 되 고 안정적으로 유전자와 gfp를 표현 한다. 최근 연구는 열 스트레스, 아니라 산화 스트레스, 따라 EXL 1::GFP 핵에서 축적 했다. 핵 구조와는 DAPI GFP 신호 겹치는 신호 스트레스 EXL 1 subcellular 지 방화 변경 확인 합니다. 이 프로토콜 선물 DAPI 얼룩에 대 한 두 가지 다른 고정 방법: 고정은 에탄올과 아세톤 고정. 이 문서에 제공 된 DAPI 얼룩 프로토콜 신속 하 고 효율적 이며 GFP 신호 및 단백질 subcellular 지 방화 변경. 이 메서드는만 Nomarski, FITC 필터와 DAPI 필터 형광 현미경을 요구 한다. 그것은 작은 실험실 설정, 학부 학생 연구, 고 등 학생 연구 및 생명 공학 교실에 적합 합니다.

염화 물 채널 세포내 단백질 (클릭)는 높은 종12에 걸쳐 보존 다기능 단백질. 많은 연구가 보여줍니다 CLICs 세포, autophagy, apoptosis, 발암, 신생, 긴장과는 포유류 시스템13,,1415,16 대 식 세포 타고 난 면역 반응 조절 ,17. C. 선 충에 있는 두 개의 클릭 homologs: exl 1 과 실-4. 우리의 최근 연구가 보여주었다 exl 1 조절 동물 스트레스 관리8. 우리는 변환 exl ...

이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

이 방법은 세포 생물학과 같은 예쁜꼬마선충 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 핵 염색, GFP 및 세포 내 국소화 변화 신호를 동시에 빠르고 효율적으로 얻을 수 있다는 것입니다. 시작하려면 표적 유전자의 번역 구조와 일치하는 염색체 외 배열을 생성합니다.또는 예쁜꼬마선충 연구를 위한 공개 자원인 Caenorhabditis Genetic Center에서 이러한 계통을 얻을 수 있습니다. 또는 이전에 발표된 연구 실험실에서. 웜을 감마선에 노출시켜 염색체외세포를 유전체에 통합한 후, 각 동물이 GFP 또는 롤러와 같은 마커 단백질을 발현할 수 있도록 안정적으로 발현된 라인을 선택합니다.방사선 동안 생성된 돌연변이를 제거하려면 선을 최소 두 번 벗어나십시오. 그 결과로 생성된 형질전환 라인을 사용하여 스트레스 하에서 단백질 발현 패턴 변화를 검출할 수 있습니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 NGM 웜 플레이트를 준비한 후 OP50 클론을 줄무늬로 만들고 액체 LB 육수에 박테리아를 밤새 배양합니다.NGM 플레이트에 액체 OP50 배양액을 파종하고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하여 박테리아 잔디밭을 벌레의 먹이 공급원으로 재배합니다. 사용하기 전에 접시를 실온에서 최소 30분 동안 식히십시오. 열 스트레스 분석 이전에 최소 2세대 동안 기아 없이 섭씨 20도에서 형질전환 라인을 성장시킵니다.8-10 명의 젊고 육중한 성인을 새로운 지렁이 플레이트로 선택하십시오. 그런 다음 약 3-5 시간 동안 알을 낳고 접시에서 모든 성인을 꺼냅니다. 벌레를 동기화하려면 알을 부화시키고 네 번째 유충 또는 L4 단계까지 약 48시간 동안 유충을 성장시킵니다.그것은 반달 구조인 외음부로 식별할 수 있습니다. 그런 다음 섭씨 35도에서 2-5시간 동안 L4 유충과 함께 플레이트를 배양하여 벌레에 열 스트레스를 가합니다. 온도를 정확하게 측정하기 위해 인큐베이터에 온도계를 포함하십시오.10 마이크로 리터의 M9를 유리 슬라이드 중앙에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 열 충격을 받은 웜을 선택하여 버퍼 드롭으로 옮깁니다. 또는 M9를 사용하여 접시에서 벌레를 씻어냅니다.그런 다음 실온에서 1분 동안 중력의 1000배로 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 유리 슬라이드에 벌레를 추가합니다. 해부 현미경으로 연조직을 사용하여 과도한 액체를 배출합니다.그런 다음 현미경으로 관찰한 상태에서 10마이크로리터의 95% 알코올을 벌레에 넣고 계속 관찰합니다. 에탄올이 마르면 즉시 에탄올을 두 번 더 첨가하십시오. 그것은 해부 현미경으로 동물에서 에탄올이 증발하는 과정에 매우 중요합니다.에탄올이 동물에서 떨어지면 즉시 다음 단계로 진행하십시오. 웜에 10마이크로리터의 DAPI를 추가합니다. 즉시 커버 슬립을 적용하고 투명 매니큐어 젤로 슬라이드를 밀봉하십시오.매니큐어를 약 10분 동안 굳힌 후 형광 현미경으로 동물을 관찰합니다. 동물을 아세톤으로 고정하려면 M9를 사용하여 열 충격 플레이트를 씻어내고 실온에서 1분 동안 중력의 1000배로 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 증류수 1ml를 사용하여 펠릿을 세척합니다.상등액을 제거한 후 400마이크로리터의 30%아세톤을 첨가하고 샘플을 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 1분 동안 1000배 중력으로 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버린 후 500 마이크로 리터의 증류수를 사용하여 동물을 두 번 씻습니다.펠릿에 200마이크로리터의 DAPI를 추가하거나 튜브에 대한 총 웜 부피의 4배를 추가하고 샘플을 15분 동안 배양합니다. 샘플을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 500마이크로리터의 증류수를 사용하여 펠릿을 두 번 세척한 후 이전과 같이 장착하고 이미징합니다.이미징을 수행하려면 UV 광원과 형광 현미경을 켜십시오. 그런 다음 현미경에 연결된 컴퓨터를 켭니다. 슬라이드를 형광 현미경에 로드합니다.10X 대물 렌즈를 사용하여 벌레를 찾습니다. 그런 다음 배율을 400X로 높이고 표본에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 현미경과 함께 제공된 소프트웨어를 엽니다.Acquisition을 클릭한 다음 Camera를 클릭하고 현미경에 연결된 카메라를 선택합니다. 동일한 Acquisition(획득)에서 Multidimensional Acquisition(다차원 획득)을 클릭합니다. 그러면 새로운 Multidimensional Acquisition 탐색 창이 열립니다.다중 채널 버튼을 클릭하면 사용 가능한 모든 채널이 나타납니다. 파란색, 녹색 및 DIC를 선택하여 표본을 관찰합니다. Multidimensional Acquisition 탐색 창에서 파란색 DAPI, 녹색 GFP 및 회색 DIC 채널을 켜진 상태로 두고 빨간색 로다민 및 흰색 명시야와 같은 다른 채널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 닫습니다.각 채널의 노출 시간을 측정하려면 파란색 DAPI 채널을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 선택하고 측정"을 클릭하여 자동 노출 시간으로 라이브 이미지를 촬영합니다. 라이브 이미지 창의 왼쪽에서 원하는 경우 노출 시간을 수동으로 조정한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 비슷한 방식으로 GFP 및 DIC 채널의 노출 시간을 설정합니다. Multidimensional Acquisition 탐색 창에서 "시작"을 클릭하여 설정된 노출 시간에 따라 세 개의 서로 다른 채널 아래에서 세 개의 이미지를 순서대로 자동으로 수집합니다.파일을 저장하려면 주 메뉴에서 파일, 다른 이름으로 저장을 클릭합니다.파일 이름과 폴더를 입력합니다. 나중에 참조할 수 있도록 자세한 이미징 정보를 보존할 수 있도록 파일을 기본 파일 형식으로 저장합니다. 파일을 다른 형식으로 내보내려면 File(파일)에서 Export(내보내기)를 클릭합니다.파일 이름과 폴더를 설정합니다. 검사 프로젝트 폴더 만들기"데이터를 더 잘 구성하려면 드롭다운 메뉴에서 원하는 파일 형식을 선택한 후 시작"을 클릭하여 내보냅니다.예쁜꼬마선충에는 exl-1과 exc-4의 두 가지 염화물 세포 내 채널 단백질 상동체가 있습니다. 최근 연구에 따르면 exl-1은 동물의 스트레스 관리를 조절합니다. 여기서, translational exl-1 GFP 구조체를 동물 게놈에 통합하고, 녹색 형광 exl-1을 안정적으로 발현하는 형질전환 라인을 생성했습니다.열 스트레스 하에서 exl-1 GFP는 강한 GFP 신호가 핵과 겹치면서 장 영역의 핵에 축적됩니다. exl-1의 세포 내 국소화를 확인하기 위해 에탄올과 아세톤 고정 동물 모두에서 DAPI 염색을 수행했습니다. 두 방법 모두 동물의 몸에서 명확한 핵을 보여주며, 겹치는 GFP 및 DAPI 신호는 exl-1 GFP가 실제로 장 영역의 핵에 축적되었음을 확인합니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 한 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 예쁜꼬마선충에서 스트레스 하에서 GFP 신호와 단백질 핵 전좌를 보존하기 위해 빠른 고정을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

의 액체 기반 culturing 및 분배를위한...

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

"동결 균열"선충 C.의 내부 조직을 노출시키는 방법 단백질의 지역화를위한 항체의 elegans는 보여줍니다.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

골격 근육은 운동을 위해 필수적이며, 몸의 주요 단백질 저장소입니다. C. elegans의 내 근육 건강 측정이 설명되어 있습니다. 근육의 구조와 기능에 대한 전향 적 변화는 지역화 된 GFP 및 양이온 성 염료를 사용하여 평가됩니다.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해 C. 엘레

여기서, 우리는 선충 표백 후 선충근 및 형광 회복을 활용하여 생체 내에서 드 노보 단백질 합성을 평가하는 비방사성 및 비침습적 방법을 소개하고 설명합니다(FRAP). 이 방법은 단백질 합성의 새로운 변조기를 확인하기 위하여 유전 및/또는 약리학 스크린과 결합될 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.

세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

이 논문은 살아있는 선충에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 표지된 화물의 축삭 수송을 시각화하기 위한 형광 현미경 획득 매개변수의 최적화에 대해 설명합니다.

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

Caenorhabditis elegans 생식계통에서 동형접합 노크인 라인을 얻기 위한 CRISPR/Cas9 미세 주입 워크플로우.

카에노르랍디티스 엘레간스에서 생식계 특이 유전자의 CRISPR/Cas9 매개 내인성 형광 태깅

배우세요 C. elegans에서 열 스트레스 조건 하에서 GFP 융합 단백질을 이용한 단백질 핵 이동 추적 방법을. DAPI 염색으로 핵과 아형질 위치를 동시에 관찰하여 세포 생물학 연구에 활용하세요.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

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