Name: Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: 학습하세요 마이크로패턴을 이용한 세포 아키텍처 정규화로 약물 효과를 정량 분석하는 방법을. Hela 세포에서 낮은 농도의 약물 효과도 민감하게 검출할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Micropatterns에 세포 준비 및 심는 <ol><li> 플레이스 6 잘 접시 2 독립 웰스 2 CYTOOchips 당신이 CYTOOchip의 오른쪽 하단 모서리에있는 'CYTOO "를 읽어 있도록. Micropatterns는 찬란 Cy3 또는 Cy5 염료로 분류하실 수 있습니다. 본 실험에 사용 CYTOOChips은 Cy3 찬란 micropatterns를 분류했습니다. 주의 : 어둠 속에 칩을 보관하십시오. </li><li> trypsinization로 헬라 세포를 (~ 80 %의 합류)를 수집합니다. 세포가 제대로 트립신 처리에 의해 분산되는 현미경으로 확인합니다. 4 분에 대한 300g에 세포를 수집하고 원심 분리기, 부드럽게 세포 펠렛을 resuspend. 세포를 카운트하고 15,000 세포 / 완료 DMEM/F12 문화 매체 ML의 농도로 희석. </li><li> 잘 CYTOOchip을 포함하는 각각에 4 ML (60,000 셀)을 분배. 주의 : 접시는이 센터에서 세포를 집중하는 경향이 있으므로 중간에 회전 움직임을 유도 피하기 위해 가능한 한 작은으로 이동해야합니다. </li><li> 후드 아래에 10 분에 대한 세포의 침전물은 다음 세포 배양기로 움직여. 10-20 분 후, 세포가 micropatterns을 준수하기 시작합니다. 10 분 후, 현미경으로 정기적으로 확인하십시오. </li><li> 최대한 빨리 세포가 첨부로 세포 매체를 변경하고 부드럽게 다음 절차를 사용하여 coverslip 표면을 플러시 : </li><li> 접시 평면 유지하는 것은, 부드럽게 잘의 측면에서 피펫으로 매체를 대기음. 주의 : 칩 건조 사라지게하지 않을,이 모든 액체를 대기음 없지만 항상 CYTOOchip을 감추기에 충분 할만큼 떠나지 않을 것을 의미합니다. </li><li> 4 ML PBS를 추가하고 처음엔 잘 측면으로 이동 칩의 중심에서 시작 다시 대기음. 공기에 칩을 노출하지 않고 설명으로 PBS를 대기음. 3-4 회 반복합니다. </li><li> 부유 세포에 대한 현미경 검사 : <ul><li> 부동 세포의 다수가 남아있는 경우, 세탁 절차를 반복합니다. </li><li> 당신은 거의 세포를 볼 경우, PBS의 일부를 대기음 2 ML 신선한 매체로 바꾸십시오. 기음과 두 번 신선한 중간 4 ML를 추가합니다. </li></ul></li><li> ° C 3 시간 최소 5 % CO 2 세포가 확산 전체를 달성하기위한 수 있도록 37 조직 문화의 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 참고 : micropatterns가 하나 또는 여러 개의 셀을 차지하는 것입니다 10~30% (2000-6500) 사이에이 방법을 사용합니다. 주의 : 세포 세탁 단계와 micropatterns에 대한 세포의 확산 것은 각각의 세포 라인에 특정 것입니다 전체에 필요한 시간 전에 준수해야하는 데 필요한 시간. </li></ol> 2. Blebbistatin 트리 트먼트 <ol><li> 17 mm의 주식 솔루션을 얻기 위해 100 % DMSO에 blebbistatin를 해산. 100 % DMSO 5 mm까지 추가로 주식 솔루션을 희석. 0.1 % DMSO에 5 μm의의 blebbistatin의 최종 농도를 얻을 문화 매체의 최종 희석하십시오. </li><li> 제어 조건, 단 0.1 %의 DMSO를 포함하는 중간 4 ML을 준비합니다. </li><li> 세포에있는 미디어를 기음과 치료 및 제어 조건 준비 4 ML 매체로 바꾸십시오. </li><li> 37 1 시간에 대한 품어 세포 ° C. </li></ol> 3. 세포 고정과 굴지의 스테 이닝 <ol><li> 세포 고정을위한 솔루션 준비 cytoskeleton 버퍼 (CB) 및 PFA 5 % 준비를위한 시약 섹션을 참조하십시오. CB는 특히 굴지의 필라멘트와 microtubules의 형광 라벨을 권장합니다. <ul><li> 1xCB - 자당 준비 : CB 2 ML에 자당의 1g을 추가합니다. 자당의 포함은 내부 세포 구조를 유지하는 데 도움이됩니다. </li><li> PFA - CB - 자당 4 % 준비 : 따뜻한 PFA 5 % 4 ML에 1xCB - 자당 1 ML을 추가합니다. 주의 :이 솔루션은 4 ° C 단 몇 일 동안 보관하실 수 있습니다. </li></ul></li><li> PFA의 고정 <ul><li> 4퍼센트 PFA - CB - 자당 솔루션 2 ML을 포함하는 6 자 판의 우물 (세탁 제외) CYTOO 로고와 장소를에 CYTOOchip 데리러 포셉를 사용하여 </li><li> RT 10 분 알을 품다 </li><li> PFA - CB - 자당을 제거하고 PBS로 한번 씻어 </li><li> 잔여 PFA의 crosslinking 활동을 담금질하기 위해 10 분 100 MM NH 4 Club 호텔 2 ML과 함께 두 번째 세척을 참고 : PFA 고정 슬라이드가 4 며칠 ° 형광 이미징을위한 organelle의 얼룩하기 전에 C에 대한 PBS에 저장할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 트리톤 X - 100 세포막의 Permeabilization 세제로 세포의 Permeabilization는 항체 또는 기타 프로브는 세포막에 침투 수 있으며 그렇지 않으면 어려운 자신의 로컬 리 제이션을 분석할 수 있도록 cytoskeletal 폴리머의 대비를 줄일 수 cytoskeleton의 단백질의 cytosolic 수영장의 일부를 제거합니다. <ul><li> RT 3 분 NH 4 Club 호텔을 제거 2 ML 추가 / 우물의 0.1 % 트리톤 X - 100 - CB </li><li> 2 ML PBS로 두 번 씻어 </li></ul></li><li> 굴지의 얼룩 형광 - phalloidin있는H는 기본 굴지에 바인딩은 굴지의 필라멘트를 얼룩하는 데 사용됩니다. <ul><li> 1.5 % BSA와 PBS에서 1:2000 희석 FITC - 복합 phalloidin 2 ML 추가 </li><li> RT에서 품어 1 H </li><li> 2 ML PBS로 한번 씻어 </li></ul></li><li> 핵의 얼룩 <ul><li> (PBS에 1μg / ML로 얼룩) Hoechst 2 ML 추가 </li><li> RT 3 분 알을 품다 </li><li> 2 ML PBS로 2 번 씻어 </li></ul></li><li> 슬라이드 마운트 <ul><li> 25-30 Mowiol의 μL 또는 기타 장착 솔루션을 사용하여 표준 현미경 슬라이드에 CYTOO 로고와 마운트 CYTOOchip에 CYTOOchips를 선택하십시오. </li></ul></li></ol> 4. 현미경의 설치 및 자동 이미지 수집 많은 이미징 소프트웨어 패키지는 제어 빠른 자동 이미지 수집 및 표시에 대한 현미경 존재합니다. 이 예제는 Metamorph 이미징 소프트웨어와 자동 인수는 CCD 카메라와 하마 마츠 Intensilight 수은 섬유 조명기 장착된 니콘 이클립스 티 현미경에서 수행을 사용합니다. 이미지 DAPI (핵), 싸이 - 3 (micropatterns)와 FITC - Phalloidin (굴지)에 해당하는 세 파장의 20x 확대에 인수됩니다. micropatterns의 숫자는 카메라와 목표의 설정에 따라 달라집니다 분야마다 시각. CYTOO의 micropatterns 크게 인수를 촉진 칩 전체 (100 또는 130 μm의) 서로 정의된 간격으로 위치하고 있습니다. <ol><li> 20x 확대를 선택합니다 </li><li> 오픈 다차원 수집 (메뉴 막대에 : 애플 리케이션 / 다차원 취득)과 실험의 다양한 매개 변수를 설정 : <ul><li> 파장 수 : 3 </li><li> 파장 유형 : DAPI, FITC, Cy3 </li><li> 최초의 세포의 분야에 초점을하여 각 파장에 대한 노출 시간을 설정 </li><li> 자동 초점은 각 파장에서 수행할 수 </li><li> 데이터를 저장할 위치를 선택하십시오 </li></ul></li><li> 12 micropatterns는 시각과 카메라 분야 (4 열 및 패턴 3 행) 중심으로 수 있도록 Cy3 파장과 위치 카메라를 선택합니다. </li><li> 다차원 취득을 실행하는 일기를 만듭니다. 일기 작성을위한 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. </li><li> 오픈 스캔 단계 기능 (메뉴 막대에 : 장비 / 무대 / 스캔 스테이지). 20x 확대 24 이미지가 포함된 각 12 micropatterns를 얻기위한, -400 μm의 X 단계의 크기 300 μm의의 Y 단계 크기, 6 열 4 행을 입력합니다. 실행으로 설정 저널에서 저널 MDA.JNL을 업로드할 수 있습니다. 다음 세 가지 파장의 전체 블록의 자동 수집을 시작하는 스캔을 누르십시오. 참고 : 단계 크기는 여기에 표시된 X와 Y가 카메라 분야에서 현재 micropatterns의 개수에 따라 달라집니다. 올바른 방향으로 운동에 대한 부정적인 가치를 요구할 수 있습니다 당신의 단계에 따라이 X 및 / 또는 Y에서 방향을 설정합니다. </li></ol> 5. 자동 이미지 처리 및 분석 많은 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 패키지는 존재합니다. 절차는 아래 개요 이미지 프로세싱과 오픈 소스 프로그램 ImageJ용으로 작성된 사용자 지정이 만든 매크로가 수행 분석 단계를 설명했다. 첫 번째 매크로 CellRef가 참조 셀, 세포막의 두 번째 Hypotenuse 대책 강성 / 축소를 만듭니다. 모두를 통해 요청할 수 있습니다 <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> micropatterns (매크로 CellRef)을 중심으로 세 가지 채널에 대한 이미지 스택을 만듭니다. micropatterns의 이용은 크게 현지화 및 개별 세포의 세분화는 자동 영상 처리의 첫 단계를 단순화, 셀 클러스터링 및 clumping을 방지합니다. 찬란 표시 micropattern 이미지는 micropatterns을 중심으로 지역을 정의하고 구분하는 데 사용됩니다. 이 지역은 다음 다른 채널에서 가져온 이미지로 바뀜과 먹죠. 해당 자른 이미지는 다음 각 파장에 대해 스택에 조립합니다. RGB - 스택은 또한 세 가지 채널 (그림 2)의 병합에서 만들어집니다. </li><li> 하나의 셀 선택 필터 (매크로 CellRef)을 적용 위의 지적으로 남은 micropatterns가 비어있는 동안, micropatterns의 10-30% (2000-6500)는, 단일 셀 또는 여러 세포에 의해 점유하고 있습니다. 단 하나의 세포에 의해 점유 micropatterns을 표시 이미지를 선택하려면, 매크로 이미지마다 핵의 숫자를 감지하여 모든 스택 (RGB하고 다른 파장)를 포함 하나 이상의 핵 또는 전혀 핵 (그림 3)에서 제거합니다. </li><li> 정규화되지 않은 완전히 셀 영역 컷을 해제 사용하는 필터 (매크로 CellRef) micropattern 가로질러 뻗어되지 않습니다 세포 제거 하려면 핵 필터를 탈출했을 세포, 굴지에 대한 FITC 채널을 사용하여 다른 필터를 분리 제거가 적용됩니다. 셀 영역은 계산하고 특정 컷 오프 (이하 계면 셀 면적보다 2 배에 대한 세포 분야) 아래 그 모든 스택에서 제거됩니다. 셀 봉투 영역은 패턴의 크기에 의해 결정됩니다. </li><li cellref> 이전 단계에서 단일 micropatterned 세포를 포함하는 이미지가 선택되었습니다. 이러한 이미지가 micropatterns 중심으로에도 불구하고, 그들 모두는 완벽하게 서로 정렬 적이 없습니다. 이미지 처리, ImageJ 플러그인 (MultiStackReg)를 체결하려면 micropattern 위치를 기반으로 모든 수집된 이미지와 모든 채널을 재개하는 적용됩니다. 이 단계는 이제 참조 세포의 단일 세포 분석 또는 작성 (그림 4)에 사용할 수있는 개별 이미지의 정렬 스택을 생성 <li> 참조 셀 (매크로 CellRef)를 구축 micropatterns에 성장하는 세포는 모든 세포와 비슷한 모양을 가지고 것을 의미합니다. 이 정규화는 여러 셀 이미지의 정확한 정렬 및 오버레이를 허용합니다. 전체 스택이 지남에 따라 각 이미지의 신호를 합산하면 하나가 "에 관한 약물 효과"를 시각화하고 평가할 수 있습니다. 최종 전체 이미지 또는 참조 셀은 표현과 이미지 분석을위한 독특하고 유용한 도구입니다 단 micropatterned 세포 (그림 4)로 구할 수 있습니다. ImageJ에서 참조 전지는 스택에서 필터링 및 정렬 이미지의 투영함으로써 구성되어 있습니다 (이미지&gt; 스택스&gt; Z - 프로젝트). 몇 가지 프로젝션 방법은 같은 평균이나 최대 강도로 적용할 수 있지만 일반적으로 중간 프로젝션은 이미지 스택의 주요 outliers을 제거하는 선택됩니다. 결과 심사를 촉진하기 위해 색상 코드 주파수지도로 monocolor 이미지를 변환 LUT는 (테이블을 조회) 적용됩니다. </li><li> 관심의 매개 변수 (매크로 Hypotenuse)를 측정하고 quantifying 양식이 하나의 주요 스트레스 섬유에 굴지의 cytoskeleton를 실시하고 있기 때문에이 비디오 문서에서는 L - micropatterns이 사용됩니다. 이런 방식으로 굴지 강조함으로써, cytoskeleton에 blebbistatin의 영향은 여러 가지 방법으로 확인할 수 : 또는 스트레스 섬유의 강도, 길이 또는 두께 얼룩 굴지 스트레스 섬유의 굴절률이 변화하고, 굴지의 필라멘트의 morphometric 기능의 변화를 측정 셀 모양 등은 이러한 매개 변수는 개별 셀 이미지 또는 최종 참조 셀 자체에 어느 측정할 수 있습니다. 여기, 5 μm의 제품 blebbistatin의 영향은 두 번째 ImageJ 매크로 (그림 7) Hypotenuse라는 이름을 사용하여 붕괴 세포의 수를 세어 특징했다. 간단히, L - micropattern의 thresholded 이미지는 셀 삼각형 모양의 이론적 hypotenuse을 정의하는 데 사용됩니다. 다음 굴지의 스테인드 이미지 thresholding는 대략적인 실제 셀 모양을 위해 수행됩니다. 세포 삼각형과 실제 오목 세포막의 이론 hypotenuse 사이의 영역은 다음 측정됩니다. 세포가 붕괴되면, 이론적 hypotenuse 아래 영역이 나타납니다. 붕괴 세포의 비율 제어를 비교하는 데 사용 조건을 처리됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 어떤 세포의 예로는 바로 micropatterns에 모습이어야하며 1.6-1.8에서 설명하는 중요한 세척 단계 후 몇 시간은 그림 5에 표시됩니다. CYTOOchips에서 15 분 후, 둥근 헬라 세포들은 fibronectin micropatterns (그림 5A)을 준수한다는 의미 같은 거리에서 관찰하고 있습니다. 세포 문화 선박의 부드러운 흔들림에도 불구하고 고정 남아있는 경우 접착이 완료되었습니다. 여러 세포에 의해 점령 micropatterns의 수를 최소화하기 위해, 과자는 다음 cytophobic 영역을 통해 부유 세포를 제거하는 PBS로 플러시됩니다. 몇 시간 후, 완전히 micropatterns 끌었 아르 세포는 그림 5B에 표시된 사람처럼 보이게됩니다. blebbistatin, 고정 및 굴지과 핵의 얼룩과 세포의 배양 후 얻은 전형적인 단일 셀 이미지는 그림 6에서 제공됩니다. 여러 이미지와 ImageJ CellRef 매크로를 사용하여 영상 처리의 자동 취득 후, 색상 코딩된 주파수지도 굴지의 강도 모든 세포 이미지 (6C 6F 및 그림)를 통해 평균을 묘사되는 생성됩니다. nontreated 및 취급 조건을 참조 셀의 비교 연구에서 표현형 쉽게 관찰하기 위해이 방법의 가능성을 보여줍니다 및 셀룰러 약물 효과를 탐험 특히 유용합니다. 세포에 blebbistatin의 효과 중 하나가 가능한 분석의 예제는 그림 7에 표시됩니다. 붕괴 세포의 번호 (이론 hypotenuse에 따라 기존의 빈 공간 ie. 전지) 50 컨트롤 세포에 감지하고 ImageJ의 Hypotenuse 매크로에 의해 감지는 5 μm의의 blebbistatin 대우 50 전지가 표시됩니다. blebbistatin 취급 인구의 붕괴 세포의 증가 숫자는 스트레스 섬유 세포 내에 수축성 actinomyosin 세력의 blebbistatin 억제로 인한 세포막에 따라서 긴장의 이완을 반영합니다. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Metamorph으로 새 저널을 만드는 방법. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 자동 이미지 처리 절차의 그림 2. 플로우 차트. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 단일 세포 밖으로 필터링. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 참조 셀 구축. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 세포 시딩. A) 헬​​라 세포는 B) 헬라 세포 내 micropatterns (10X 배율)에 퍼지는 전체 이후 플러싱 단계 (4X 배율) 이후 micropatterns을 준수. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 그림 6. 컨트롤과 약물 치료 조건에 nonpatterned 및 micropatterned 세포의 비교. 헬라 세포는 3 시간 동안 씨앗 5 μm의의 1 시간 blebbistatin (하단 패널) 또는 왼쪽 치료 (패널 위)와 치료를했다. 제어 nonpatterned 세포 (A)에서 굴지 5 μm의의 blebbistatin (D) 치료시 눈에 보이지 분해 여러 섬유로 조립. L - micropatterns에서 제어 세포가 삼각형 모양 (B)를 채택하고 nonpatterned 세포 (D)에 비해 L.의 2 apices 사이의 주요 굴지 섬유 (스트레스 섬유)를 개발, blebbistatin는 L - micropatterned에 중요한 phenotypic 변화를 유도 전지 (E). 약물 효과와 제어 및 처리 조건의 비교 직접 시각화는 20 세포에서 만들어진 참조 셀 프레 젠 테이션으로 신속하게 시각하실 수 있습니다. blebbistatin는 세포의 붕괴와 주요 스트레스 섬유가 사라집니다 (F)를 처리하는 동안 각각의 세포와 마찬가지로, 명확하고 강한 스트레스 섬유, 제어 참조 셀 (C)에 존재합니다. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. 매크로 Hypothenuse를 사용하여 세포에 blebbistatin의 효과 분석의 예. 제어 세포의 25 %가 붕괴 동안, 이것은 약화 actinomyosin 수축성 네트워크 (N = 50 세포)를 반영 5 μm의의 blebbistatin 치료 세포를 75 %로 3 배 증가했습니다.

<ol><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+guides+the+orientation+of+the+cell+division+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis.</a> Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).</li>
<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropy+of+cell+adhesive+microenvironment+governs+cell+internal+organization+and+orientation+of+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).</li>
<li>Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nat Methods. , (2010).</li>
<li>Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+network+mechanics+and+active+contractility+determine+cell+and+tissue+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape.</a> Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+cadherins+control+nucleus+and+centrosome+position+and+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity.</a> J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).</li>
<li>Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+patterns+epithelial-mesenchymal+transition+via+intercellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction.</a> J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).</li>
<li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li>
<li>Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).</li>
<li>Pouthas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+migrating+cells%2C+the+Golgi+complex+and+the+position+of+the+centrosome+depend+on+geometrical+constraints+of+the+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum.</a> J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).</li>
<li>Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+study+of+mitotic+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation.</a> Nature. 447, 493-496 (2007).</li>
<li>Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).</li>
</ol>

앤 Béghin 제외한 모든 저자는이 문서에 등장하는 시약 및 장비를 생산 CYTOO SA의 직원입니다.

micropattern 중 선택 5 μm의의 blebbistatin의 효과는 일반 문화 지원에 거의 감지되지만, 효율적인 부량 하나의 주요 스트레스 섬유에 굴지 집중 micropatterns에 가능합니다. 이것은 세포에 blebbistatin 효과의 정확한 양을 정함 은닉 굴지의 cytoskeleton의 시각화을 향상시킵니다. micropattern 형상의 선택은 분석의 설계에 중요하고 연구에 강조하는 phenotypic 변경에 따라 설계되었습니다. 결론 Micropatterns 특히 낮은 농도에서 약물 효과의 시각화 및 부량을 용이하게합니다. 셀 기반 assays를위한 접착제 micropatterns과 동질적인 평면 기판의 교체는 생산 데이터의 정확성, 감도 및 품질을 향상시킵니다. 결과적으로, 적은 세포는 강력한 통계 결과에게 3 달성하기 위해 분석을 위해 필요합니다. 접착제 micropatterns 기능성 연구를 향상시키고 독성 또는 간접적으로 약물 효과를 유도하지 않도록하기 위해 낮은 약물 농도에 phenotypic 변화를 탐험을위한 진정한 기회를 제공합니다. 적절한 심사 플랫폼을 사용하는 경우 micropatterns이 유전자 / 약물 검사 응용 프로그램을 개선하기위한 제약 회사의 요구 사항을 충족시킬 수 있습니다. 세포 현상을 분석하고 quantifying에 대한 micropatterns를 이용해 왔습니다 최근 간행물 중 일부는 추가 예제 3-13 아래 인용하고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> 세포 배양 </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM - FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips 당신의 선택의 단백질의 흡착 수 있습니다 </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1X </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 챔버 계산하면 (Kova 슬라이드) </td><td> Prolabo </td><td> 71287.01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax - I </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (F 탈 소 혈청) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 페니실린 &amp; 스트렙토 마이신 </td><td> PAA </td><td> A15 - 101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 웰스 - 판 </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 원심 분리기 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> 마약, 고정 및 immunostaining </td></tr><tr><td colspan="2" > Cytoskeleton 버퍼 1X (CB) </td><td > 시그마 </td><td > MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889 </td><td > 10 MM MES 산도 6.1, 138mM KCl, 3mM MgCl, 2mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > 자당 </td><td > 시그마 </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> CB 1.185X 54 ML과 PFA 32% 10 ML를 섞어 </td></tr><tr><td colspan="2"> 트리튼 - X100 </td><td> 시그마 </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS의 정제 </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 알부민 혈청 보빈 (BSA) </td><td> 시그마 </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin - FITC </td><td> 시그마 </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Club 호텔 0.1M </td><td> 시그마 </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> 이미지 수집 </td></tr><tr><td colspan="2"> Epifluorescent 현미경 </td><td> 니콘</td><td> 에클 립스 티 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD 카메라 </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ 소프트웨어 </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

지금까지, 대부분의 HCA (하이 컨텐츠 분석) 연구는 마이크로 번호판을 처리 조직 문화에 동질적인 기판에 성장 자기편 세포 라인 수행하고 있습니다. 이러한 조건에서 세포는 확산 및 세포 형태, 형태학 및 행동에 내재된 변화의 결과로 모든 방향으로 나눕니다. 전체 인구의 높은 휴대 전화의 변화는 특히 약물 개발을위한, HCA의 성공을 막는. 모든 개별 세포의 모양과 내부 극성을 정상화하기 위해 micropatterns의 능력이 중요한 병목 현상 1-2 해결을위한 엄청난 기회를 제공합니다. 액세스 및 micropatterning 기술의 사용을 촉진하기 위하여, CYTOO는 coverslip과 microwell 형식에서 사용할 수 micropatterns를 사용할 준비가의 범위를 개발하였습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 CYTOOchip micropatterns, 약물 치료, 고정 및 얼룩 자동 수집, 자동 영상 처리 및 최종 데이터 분석에 대한 셀 시딩에서 모든 절차에 대한 자세한 절차를 제공합니다. 이 예제를 통해, 우리는 micropatterns는 셀 기반 assays을 촉진하는 방법을 보여줍니다. 세포 cytoskeleton의 변경은 동질적인 기판에 대한 교양 세포의 수치 어렵지만, 모든 세포에서 세포 유착 연락처 체계적 위치로 인해 굴지의 meshwork의 재현성 조직 micropatterns 결과에 culturing 세포. 세포내 아키텍처의 이러한 정상화는 굴지의 cytoskeleton에도 작은 영향 부량과 같이 blebbistatin, 굴지 - 마이 오신의 상호 작용의 억제제를 사용하는 프로토콜 이러한 집합 시연 가능합니다.

세포 구조를 정상화 접착제 micropatterns는 약물 효과의 검출에 감도를 증가 재현성을 개선하고 자동화된 이미지 수집 및 분석을 단순화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 기존의 세포 배양 지원을 수행하고 결과적으로 과도한 휴대 전화의 변화로 고통 받고 약물 / siRNA 심사 assays를 도움이 될 것입니다.

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

현재까지 대부분의 HCA(고함량 분석) 연구는 조직 배양 처리된 균일한 기질에서 배양된 부착성 세포주를 사용하여 수행되어 왔습니다...

다음 절차의 전반적인 목표는 특정 접착성 미세 패턴에서 구현된 세포 구조 및 위치의 표준화가 어떻게 이미지 획득의 자동화를 용이하게 하고, 기존의 유리 커버슬립 지지체에서는 불가능한 약물 효과의 민감하고 견고한 정량화를 포함한 단순한 이미지 처리를 가능하게 하는지 보여주는 것입니다. 이는 L자형 SI three 표식 미세 패턴이 있는 SI two 칩에 heli 세포를 시딩함으로써 달성됩니다. 세포는 삼각형 모양을 형성하며 L자의 양 끝을 가로지르는 주요 스트레스 섬유를 구축합니다. 이후 패턴 세포를 lebos statin과 함께 배양하거나 처리하지 않은 상태로 둔 다음, 고정 및 염색하여 액틴 세포골격과 핵을 시각화합니다.그 후 마이크로패턴 세포의 이미지를 획득하고 cell ref 매크로를 사용하여 처리함으로써 분석을 위한 이미지 스택을 생성하며, hypotenuse 매크로를 사용하여 표현형을 정량화합니다. 결과적으로, 표준 세포 배양 조건에서는 검출되지 않는 저용량 BLEs statin이 마이크로패턴 HELOC 세포에 미치는 유의미한 효과를 확인할 수 있습니다. 안녕하세요, 환영합니다.오늘은 세포 분석을 위한 접착성 마이크로 패턴의 사용 방법을 설명하는 실험 프로토콜을 안내해 드리고, 이러한 접착성 마이크로 패턴 상에서 매우 낮은 용량의 약물을 용이하게 정량화할 수 있음을 보여주는 실험 데이터를 제시하고자 합니다. 이 마이크로 패턴을 처음 보시면, 세포 분석 중 이미지 캡처 시 발생하는 변동성 문제를 어떻게 해결할 수 있는지 즉시 이해하실 수 있을 것입니다. 마이크로 어레이와 매우 유사하게 세포들이 배열되어 있기 때문에, 현미경 스테이지를 세포에서 세포로 쉽게 이동시키며 단계별로 이미지를 캡처할 수 있기 때문입니다.하지만 이것이 마이크로 패턴이 제공하는 유일한 장점은 아닙니다. 사실 십자형이나 Y자형과 같은 특정 전형적인 마이크로 패턴에서는 내부 세포 구조를 표준화할 수 있기 때문에 훨씬 더 많은 개선 사항을 제공합니다. 즉, 세포 소기관, 방추사, 세포골격 및 다양한 단백질 네트워크가 세포마다 동일한 위치에 있거나 동일한 방향으로 배열되어, 이러한 특정 패턴에서 약물이 미치는 영향을 훨씬 더 쉽게 예측하고 정량화할 수 있습니다. 이는 일반적인 페트리 접시나 마이크로플레이트에서 수행하는 방식과는 상당히 상반되는 개념으로 보일 수 있습니다.물론 일반적으로 세포들이 돌아다니며 다양한 형태를 띠는 모습을 자주 보게 됩니다. 반면 접착성 마이크로 패턴 위에서는 모든 세포가 이 접착성 마이크로 패턴에 반응하여 동일한 방식으로 구조를 조직하기 때문에 모두 비슷하게 보이기 시작할 것입니다. 이것이 사실 다소 인위적으로 보일 수 있지만, 자세히 생각해보면 페트리 접시가 훨씬 더 인위적이지 않을까요?조직 내에서 세포는 인접한 세포뿐만 아니라 세포외 기질에 의해 제약을 받기 때문입니다. 따라서 세포는 세포 구조를 결정짓는 많은 공간적 정보를 받게 됩니다. 그리고 이것이 바로 우리가 마이크로 패턴을 이용해 구현하고자 하는 것입니다.우리는 이러한 공간 정보를 세포에 복원하고 있으며, 모든 세포는 이에 반응하여 동일한 방식으로 조직화되고 있습니다. 이제 모든 세포가 유사하게 보이므로 '참조 세포(reference cell)'라는 개념을 도입할 수 있는데, 이는 모든 이미지를 평균화하여 특정 조건에서 세포가 어떻게 보이는지를 진정으로 대표하는 단일 이미지를 얻을 수 있음을 의미합니다. 그런 다음 약물을 처리하고 해당 참조 세포를 다시 관찰함으로써, 그 약물에 반응하여 세포의 형태나 조직이 어떻게 변형되었는지 확인할 수 있습니다.Situ two 칩 두 개를 6-well 플레이트의 독립된 웰 두 개에 각각 배치하며, 이때 situ two 로고가 읽을 수 있는 방향인지 확인하십시오. 본 실험에 사용되는 situ two 칩은 FibroGen SI three로 염색된 마이크로 패턴이 형성되어 있으며, 사용 전까지 암소에 보관해야 합니다. 약 80% confluency에 도달한 HeLa 세포를 트립신으로 수집하고, 현미경 하에서 세포가 적절히 단일 세포로 분리되었는지 확인하십시오. 300 ×g에서 4분간 원심 분리한 후 세포를 부드럽게 재현탁하고, 세포 수를 측정하여 15,000 cells/mL 농도로 희석하십시오.불완전 D-M-E-M-F 12 배양 배지에 웰당 60,000개의 세포를 분주합니다. 배지 내에 회전 운동이 발생하여 세포가 중앙으로 집중되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 최대한 움직이지 않아야 합니다. 후드 내에서 10분 동안 세포를 침강시킨 후, 세포 배양기로 옮깁니다.세포 배양기 내에서 10~20분 정도 지나면 세포가 부착되기 시작하며, 10분 후부터 현미경으로 세포의 부착 여부를 정기적으로 확인하십시오. 세포 배양액을 교체하고, 다음 절차를 4회 반복하여 과잉 세포를 제거합니다. 플레이트를 평평하게 유지한 상태에서 웰의 측면으로부터 배양액을 조심스럽게 흡입하십시오.칩이 마르는 것을 방지하기 위해 충분한 양의 배지를 유지하도록 주의하십시오. 4 mL의 PBS를 첨가하고 칩의 중앙부터 흡입하십시오. 그런 다음 이전과 마찬가지로 웰의 측면으로 이동하여 PBS의 대부분을 흡입한 후, 현미경으로 부유 세포가 있는지 확인하십시오.부유 세포가 많이 남아 있는 경우, 세척 과정을 반복하십시오. 세포 수가 매우 적은 경우, PBS의 일부를 흡입하여 제거하고 2 mL의 신선한 배지로 교체한 후, 신선한 배지 4 mL를 두 차례 추가하십시오. 세포가 충분히 퍼질 수 있도록 세포 배양기에서 3시간 동안 배양하십시오.이 방법을 사용하면 마이크로 패턴의 10~30%가 단일 세포에 의해 점유되며, 나머지 패턴은 비어 있거나 여러 세포에 의해 점유됩니다. 세포에 BLEs statin을 처리하려면 17 mM 약물 스톡 용액을 0.1% DMSO가 포함된 4 mL 배지로 희석하여 최종 농도를 5 µM로 맞춥니다. 대조군의 경우 0.1% DMSO만 포함된 배지를 준비합니다. 칩이 마르는 것을 방지하기 위해 세포 배지를 흡입한 후 즉시 BLEs statin 또는 대조군 용액으로 교체합니다.세포를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 세포골격 완충액을 준비합니다. 2 mL의 cb에 sucrose 1 g을 첨가합니다.이는 세포 내부 구조를 보존하는 데 도움이 됩니다. 5% PFA 4 mL에 CB sucrose 1 mL를 혼합합니다. CB sucrose 용액에 포함된 PFA 2 mL를 추가합니다.새 6-웰 플레이트의 두 웰에 준비합니다. 세포를 고정하려면 핀셋으로 CY 2 칩을 집어 CB sucrose 용액 내의 PFA 2 mL가 들어 있는 6-웰 플레이트에 넣습니다. 상온에서 10분 동안 세포를 배양한 후, PFA를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 100 mM ammonium chloride 2 mL로 세포를 10분 동안 세척합니다.잔류 PFA 가교 활성을 억제하기 위해, 0.1% Triton X 100이 포함된 PBS 2 mL를 첨가하여 3분 동안 세포를 투과화하고, PBS로 2회 세척한 후, 1.5% BSA가 포함된 PBS 내에서 1:2000으로 희석한 ZI 결합 phalloidin 2 mL로 액틴 필라멘트를 염색하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 다음, 2 mL의 PBS로 세포를 1회 세척합니다. 이어서, 핵을 염색합니다.1 mg/mL 농도로 PBS에 희석된 용액 2 mL를 첨가하고 상온에서 3분 동안 배양합니다. 2 mL의 PBS로 2회 세척합니다. 25~30 µL의 al과 같은 마운팅 용액을 사용하여 2개의 칩을 표준 슬라이드에 마운팅합니다.세 가지 파장의 이미지를 획득하기 위해, Metamorph 이미징 소프트웨어와 NIK icon eclipse T 현미경을 사용합니다. 이 현미경에는 CCD Hema Matsu 카메라와 intens lite 수은 파이버 조명 장치가 장착되어 있습니다. 먼저 20배 배율을 선택하십시오.다음으로 메뉴 표시줄에서 다차원 획득(multidimensional acquisition)을 엽니다. 실험의 다양한 매개변수를 설정하십시오. 먼저 데이터를 저장할 위치를 지정합니다.파장의 수를 3개로 설정하고, SI 3파장을 선택한 후, 카메라 시야의 중앙에 12개의 마이크로 패턴이 오도록 커버슬립 슬라이드를 배치하십시오. 시야당 시각화되는 마이크로 패턴의 수는 카메라 및 대물렌즈 설정에 따라 달라질 수 있습니다. 각 파장에 대한 노출 시간과 오토포커스를 설정하십시오.PS three의 경우, 다차원 획득(multi-dimensional acquisition)을 수행하는 저널을 생성하고 이를 MDA jnl로 저장합니다. 각 이미지에 12개의 마이크로 패턴이 포함된 총 24장의 이미지를 획득하기 위해 스캔 스테이지 기능을 엽니다. 설정 저널에 열 6개와 행 4개를 입력하고, x 단계 크기는 -400 micron, y 단계 크기는 300 micron으로 설정하여 실행합니다. MDA jnl 저널을 업로드한 후 scan을 눌러 3가지 파장에서의 24장 이미지 자동 획득을 시작합니다.이 비디오에서는 L자형 마이크로 패턴을 사용하여 단일 주요 액틴 스트레스 섬유(actin stress fiber)의 형성을 유도함으로써, 세포의 부착되지 않은 부분을 지지하게 하고, 평면 피브로넥틴(fibronectin) 위에 놓인 세포와 비교하여 BLEs statin이 세포에 미치는 영향을 시각화하고 측정하는 과정을 단순화합니다. 자동 이미지 처리 및 분석을 위해, 오픈 소스 프로그램인 ImageJ용으로 작성된 두 가지 맞춤형 매크로를 설명합니다. 첫 번째 매크로는 원본 이미지 스택에서 개별 세포를 추출하고 참조 세포를 생성하며, 두 번째 매크로는 세포막의 붕괴 정도를 측정합니다.첫 번째 단계는 원본 이미지에서 개별 세포를 분할하는 것입니다. 형광 표지된 마이크로 패턴 이미지를 사용하여 마이크로 패턴을 중심으로 한 영역을 추출하며, 이는 파장별 이미지로 크롭된 후 각 파장별 스택으로 다시 재조립됩니다. 단일 세포가 포함된 마이크로 패턴을 선택하기 위해, 매크로가 이미지당 핵의 수를 감지하여 핵이 하나보다 많거나 없는 경우를 모든 스택에서 제거합니다.마지막으로, Image J 플러그인인 multi-stack reg를 사용하여 수집된 모든 이미지와 모든 채널을 마이크로패턴 위치를 기준으로 다시 정렬합니다. 이 단계를 통해 개별 이미지의 라인 스택이 생성되며, 이는 단일 세포 분석이나 참조 세포 생성에 사용될 수 있습니다. Image J에서 참조 세포는 스택에서 필터링 및 정렬된 이미지들의 투영(projection)을 통해 구축됩니다.여러 가지 투영 방법을 적용할 수 있으나, 일반적으로 이미지 스택의 이상치를 제거하기 위해 중앙값 투영(median projection)이 선택됩니다. 참조 셀(reference cell)은 마이크로패턴 셀에서만 얻을 수 있는 표현 및 이미지 분석을 위한 독특하고 유용한 도구입니다. 이를 용이하게 검토하기 위해, 단색 이미지를 부호화된 빈도 맵으로 변환하는 룩업 테이블(lookup table) 또는 LUT가 적용됩니다.BLEs의 스타틴 효과를 규명하기 위해, 두 번째 Image J 매크로를 사용하여 세포의 강성(rigidity)과 붕괴(collapse)를 분석하였습니다. 간단히 설명하면, L 마이크로 패턴의 임계값 이미지를 사용하여 세포 삼각형 모양의 이론적 빗변을 정의합니다. 그다음, 액틴 염색 이미지의 임계값 처리를 수행하여 세포 모양을 정의합니다.이후 이론적인 빗변과 실제 오목한 세포막 사이의 면적 차이를 측정하며, 이론적인 빗변 아래에 면적이 형성된 세포는 붕괴된 것으로 간주합니다. 5 µM BLEs statin의 영향은 처리군과 대조군에서 붕괴된 세포의 수를 비교하여 특성화하였습니다. BLEs statin으로 처리하거나 처리하지 않은 L 마이크로패턴 세포의 전형적인 이미지가 제시되어 있으며, 세포는 고정 후 마이크로패턴을 염색하였습니다.액틴과 핵이 각각 빨간색, 녹색, 파란색으로 표시되었습니다. 대조군 조건과 비교하여 BLEs statin이 세포 모양에 미치는 영향에 주목하십시오. 평면 피브로넥틴 상에서 BLEs statin 또는 대조군과 함께 배양한 후의 대표적인 세포들이 여기에 표시되어 있습니다.세포를 고정하고 염색하였으며, 액틴과 핵은 각각 녹색과 청색으로 나타납니다. 처리군과 대조군 조건 사이의 유사성에 주목하십시오. BLEs statin으로 처리한 세포 또는 처리하지 않은 대조군 세포로부터 얻은 참조 세포의 전형적인 이미지가 표시되어 있습니다.연구 대상의 표현형을 쉽게 관찰할 수 있는 이 접근법의 잠재력에 주목하십시오. 다음은 매크로 하이포테뉴스(macro hypotenuse)를 사용하여 BLEs statin이 세포에 미치는 영향을 분석한 예시입니다. 대조군 세포의 25%가 수축된 반면, 5 µM BLEs statin 처리 세포에서는 이 비율이 3배 증가한 75%로 나타났으며, 이는 약화된 actinin 수축 네트워크를 반영합니다.이 영상을 시청하신 후, 여러분은 접착성 마이크로 패턴이 고함량 분석(high content analysis)의 여러 병목 현상을 어떻게 해결하는지에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 첫째, 접착성 마이크로 패턴을 사용하면 이미지 캡처 처리 분석이 훨씬 더 간편해집니다. 둘째, 세포의 형태와 행동을 표준화함으로써 세포 간 변동성을 줄일 수 있기 때문에, 매우 낮은 용량의 약물이 나타내는 아주 미세한 효과까지 검출할 수 있습니다.마지막으로, 세포 분석에서 좋은 결과를 얻기 위해 통상적으로 수천 개의 세포가 필요한 것과 비교하여, 당사의 기준 세포를 사용하면 수십 개의 세포만으로도 견고하고 유의미한 결과를 얻을 수 있습니다.

improved-visualization-quantitative-analysis-drug-effects-using

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 기판에 원하는 장소에서 세포를 삽입하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. 이 방법은 패턴을 기판에 전지 가득 microwells를 포함하는 실리콘 칩을 틀지하여 세포를. 이 방법은 세포 사이의 diffusible 및 juxtacrine 신호를 조절하는 새로운 방법을 제공합니다.

바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

이 3D 미세유체 프린팅 기술은 수중 표면에 세포 배열을 인쇄합니다.  우리는 세포 배열이 3D 플로우 셀에서 수중 표면에 미세유체적으로 전달되는 방법을 설명합니다.  물에 잠긴 표면에 인쇄함으로써, 다양한 분야에서 약물 스크리닝 및 세포 독성 평가를 허용하는 세포 마이크로어레이가 생성되었습니다.

연속 흐름 Microspotter을 사용하여 수정 된 표면에 세포의 침수 인쇄

우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.

화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

이 방법론은 기판 강성, 단백질 조성 및 세포 형태와 같은 세포 외 매트릭스 큐가 슈완 세포 (SC) 표현형을 조절하는 메커니즘을 설명하는 것을 목표로합니다.

슈완 세포 표현형 사양을 평가하기 위한 튜블드 세포 외 세포 매트릭스 미세 환경의 준비

우리는 미세 유체 플랫폼에서 모세혈관 보조 어셈블리를 사용하여 박테리아 및 콜로이드와 같은 액체에 매달려있는 미세 크기의 물체를 폴리디메틸실록산 기판에 규정 된 배열로 패턴화하는 기술을 제시합니다.

순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

이 연구는 형광 단백질 마이크로패턴의 시각화된 변위를 기반으로 단일 세포 수축력의 단순화되고 핸드오프 정량화를 위해 마이크로웰 형식으로 형광 표지된 엘라스토머 수축성 표면(FLECS) 기술을 활용하기 위한 유연한 프로토콜을 제시합니다.

마이크로 패턴화된 엘라스토머를 이용한 단일 세포 수축성의 단순화된 고처리량 분석

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

학습하세요 마이크로패턴을 이용한 세포 아키텍처 정규화로 약물 효과를 정량 분석하는 방법을. Hela 세포에서 낮은 농도의 약물 효과도 민감하게 검출할 수 있습니다.

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

더 많은 동영상 탐색