Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

다음 절차의 전반적인 목표는 특정 접착 마이크로 패턴에서 달성된 세포 구조 및 위치의 정규화를 통해 기존의 유리 커버 슬립 서포트에서는 달성할 수 없는 약물 효과의 민감하고 강력한 정량화를 통해 이미지 획득 및 간단한 이미지 처리를 쉽게 자동화할 수 있는 방법을 보여주는 것입니다. 이는 L자형 SI 3개의 표지된 마이크로 패턴을 가진 SI 2개의 칩에 헬리 셀을 시딩함으로써 달성됩니다. 세포는 삼각형 모양을 채택하여 L의 두 끝에 걸쳐 주요 응력 섬유를 형성합니다.패턴 세포는 다음으로 lebos statin으로 배양하거나 처리하지 않은 상태로 두었습니다.

그런 다음 Cell Ref 매크로를 사용하여 마이크로패턴 세포의 이미지를 획득하고 처리하여 분석을 위한 이미지 스택을 생성하고 빗변 매크로를 사용하여 표현형을 정량화합니다. 궁극적으로, 표준 세포 배양 조건에서는 검출되지 않는 마이크로패턴 HELOC 세포에 대한 저용량 BLEs 스타틴의 유의미한 효과를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 환영합니다.

오늘 저희는 세포 분석을 위해 접착 마이크로 패턴을 사용하는 방법을 설명하고 이러한 접착 마이크로 패턴에서 매우 낮은 용량의 약물을 쉽게 정량화하는 방법을 보여주는 실험 데이터를 보여주는 실험 프로토콜을 안내해 드리기 위해 이 자리에 모셨습니다. 따라서 이러한 마이크로 패턴을 처음 보면 세포 분석 중 이미지 캡처의 가변성 문제를 어떻게 해결할 수 있는지 즉시 이해할 수 있습니다. 마이크로 어레이와 같은 실제 세포 배열을 가짐으로써 현미경 단계를 세포에서 세포로 쉽게 이동하여 단계적으로 이미지를 캡처할 수 있기 때문입니다.

그러나 물론 그것이 제공하는 마이크로 패턴의 유일한 장점은 아닙니다. 실제로 크로스보(crossbo) 또는 Y와 같은 특정 전형적인 미시 패턴에서 우리는 실제로 내부 세포 구조를 정규화하고 있기 때문에 훨씬 더 많은 개선을 제공합니다. 따라서 이러한 특정 패턴에 대한 약물의 효과를 훨씬 쉽게 예측하고 정량화할 수 있습니다. 이제 이것은 고전적인 페트리 접시 또는 마이크로 플레이트에서 일반적으로 수행되는 것과는 상당히 반직관적 인 것처럼 보일 수 있습니다.

글쎄요, 물론 여러분은 종종 세포가 움직이고 다른 형태를 채택하는 것을 볼 수 있기 때문입니다. 반면 접착 마이크로 패턴에서는 모든 세포가 이 접착 마이크로 패턴에 반응하고 동일한 방식으로 구조를 구성하기 때문에 비슷하게 보이기 시작합니다. 이것은 사실 약간 인공적으로 보일지도 모르지만, 자세히 보면 페트리 접시는 더욱 인공적이지 않습니까?

조직에서 세포는 인접 세포와 세포 외 기질에 의해 제약을 받기 때문입니다. 그래서 그들은 많은 공간 정보를 받고 있으며, 이는 셀 아키텍처의 방향을 정하고 있습니다. 그리고 이것은 마이크로 패턴의 광고에 현장에서 우리가 하는 일입니다.

우리는 이 공간 정보를 세포에 복원하고 있으며 모든 세포는 이에 반응하고 같은 방식으로 조직하고 있습니다. 이제 세포가 모두 비슷하게 생겼기 때문에 참조 셀의 개념을 도입할 수 있는데, 이는 모든 이미지를 평균화하고 주어진 조건에서 세포가 어떻게 보이는지를 실제로 나타내는 단일 이미지를 얻을 수 있음을 의미합니다. 그런 다음 약물을 추가하고 해당 참조 세포를 다시 살펴보고 해당 약물에 대한 반응으로 세포의 형태나 조직을 어떻게 변형시켰는지 확인할 수 있습니다.

2개의 situ 2 칩을 6개의 웰 플레이트의 2개의 독립적인 well에 개별적으로 배치하여 situ two 로고를 읽을 수 있도록 합니다. 이 실험에 사용된 situ two 칩에는 FibroGen SI three로 염색된 마이크로 패턴이 있으므로 사용하기 전에 어두운 곳에 보관해야 합니다. 트립신에 의하여 대략 80%confluent인 hela 세포를 모으고 4 분 동안 300 G에 현미경 분리기의 밑에 제대로 individualized 다는 것을 검사하고 resus는 세포를 현탁시키고, 15의 농도, 밀리리터 당 000의 세포에 세포를 온화하게 세고 묽게 한다.

불완전한 D-M-E-M-F 12 배양 매체에서 60 의 우물 당 000의 세포를 분배한다. 플레이트는 매체에서 회전 운동이 발생하지 않도록 가능한 한 적게 움직여야 하며, 이는 세포를 중앙에 집중시키는 경향이 있습니다. 세포가 후드 아래에서 10분 동안 침전되도록 한 다음 세포 배양기로 이동합니다.

세포 배양기에서 10-20분 이내에 세포는 10분 후에 부착되기 시작하고 세포가 부착되었을 때 현미경으로 정기적으로 확인합니다. 세포 매체를 변경하고 다음 절차를 4회 반복하여 초과된 세포를 제거합니다. 플레이트를 평평하게 유지하면서 우물 측면에서 매체를 부드럽게 흡인합니다.

칩이 마르지 않도록 충분한 매체를 보관하도록 주의하십시오. PBS 4ml를 넣고 칩 중앙부터 흡입합니다. 그런 다음 이전과 같이 대부분의 PBS를 흡인하기 위해 웰 측면으로 이동하고 현미경 아래에서 떠 다니는 세포가 있는지 확인합니다.

많은 양의 부유 셀이 남아 있으면 세척 절차를 반복하십시오. 세포가 거의 없는 경우 PBS의 일부를 흡인하고 2ml의 새로운 배지 흡입으로 교체한 다음 4ml의 새로운 배지를 두 번 추가합니다. 세포가 완전히 퍼질 수 있도록 세포 배양기에서 3시간 동안 세포를 배양합니다.

이 방법을 사용하면 마이크로 패턴의 10%에서 30% 사이가 단일 셀에 의해 점유되는 반면 다른 패턴은 비어 있거나 여러 셀이 차지합니다. BLE로 세포를 치료하기 위해 스타틴은 17밀리몰의 약물 원료 용액을 4밀리리터의 배지에 0.1%DMSO가 함유된 5마이크로몰의 최종 농도로 희석합니다. 대조군의 경우, 0.1%DMSO로 배지를 준비하고, 세포 배지만 흡인하고, 칩이 건조되는 것을 방지하기 위해 BLE, 스타틴 또는 대조 용액으로 신속하게 교체하십시오.

세포를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 이 배양 중에 세포골격 완충액을 준비합니다. cb 2밀리리터에 자당 1g을 첨가합니다.

이것은 내부 세포 구조를 보존하는 데 도움이 됩니다. CB 자당 1ml와 5%PFA 4ml를 혼합합니다. CB 자당 용액에 2 밀리리터의 PFA를 첨가하십시오.

신선한 6 개의 우물 플레이트의 2 개의 우물에서. 세포를 고정하려면 집게를 사용하여 CY 2 칩을 집어 CB 자당 용액에 2 밀리리터의 PFA가 들어있는 6 웰 플레이트에 놓습니다. 실온에서 10분 동안 세포를 배양하고 PFA를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척한 다음 100밀리몰 염화암모늄 2밀리리터로 10분 동안 세포를 세척합니다.

잔류 PFA 가교 활성을 없애기 위해 0.1% tritton X 100을 함유하는 PBS 2ml를 3분 동안 첨가하여 세포를 투과하고, PBS 염색 액틴 필라멘트로 2ml의 ZI conjugated fain을 1에서 2000으로 2회 세척하여 PBS에서 1.5% BSA와 함께 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 2ml의 PBS로 세포를 한 번 씻습니다. 다음으로, 핵을 지탱합니다.

PBS에 호크된 1밀리리터당 1밀리그램 2밀리리터를 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다. PBS 2ml로 두 번 씻으십시오. 25-30 마이크로리터의 장착 솔루션을 사용하여 표준 슬라이드에 측면 두 개의 칩을 장착합니다.

세 가지 파장의 이미지를 획득하기 위해 Metamorph 이미징 소프트웨어와 NIK icon eclipse T 현미경을 사용합니다. CCD Hema Matsu 카메라와 intens lite 수은 섬유 조명기가 장착되어 있습니다. 먼저 20배 배율을 선택합니다.

다음으로 메뉴 모음에서 multidimensional acquisition을 엽니다. 실험의 다른 매개 변수를 설정합니다. 먼저 데이터를 저장할 위치를 표시하십시오.

파장 수를 3으로 설정하고 SI 3 파장을 선택한 다음 12개의 마이크로 패턴이 카메라 필드의 중앙에 오도록 커버 슬립 슬라이드를 배치합니다. 필드별로 시각화되는 마이크로 패턴의 수는 카메라와 대물렌즈 설정에 따라 달라집니다. 각 파장과 자동 초점에 대한 노출 시간을 설정합니다.

PS three의 경우, 다차원 수집을 실행하는 분개장을 만들고 MDA jnl로 저장합니다. 스캔 스테이지 기능을 열어 각각 12개의 마이크로 패턴을 포함하는 24개의 이미지를 획득합니다. 실행할 저널에 마이너스 400 미크론 x 스텝 크기, 300 미크론 y 스텝 크기의 6개 열과 4개의 행을 입력하고 저널 MDA jnl 프레스 스캔을 업로드하여 3개 파장에서 24개 이미지의 자동 획득을 시작합니다.

이 비디오에서는 L 마이크로 패턴을 사용하여 세포의 연결되지 않은 부분을 지지하는 단일 주요 액틴 스트레스 섬유의 형성을 트리거하고 일반 피브로넥틴에 있는 세포와 비교하여 BLE 스타틴이 세포에 미치는 영향의 시각화 및 측정을 단순화합니다. 자동화된 이미지 처리 및 분석을 위해 원시 이미지 스택에서 오픈 소스 프로그램 이미지 J용으로 작성된 두 개의 사용자 정의 매크로를 간략하게 설명하며, 첫 번째 매크로는 개별 셀을 추출하고 참조 셀을 생성합니다. 두 번째 매크로는 세포막의 붕괴를 측정합니다.

첫 번째 단계는 원시 이미지에서 개별 세포를 세분화하는 것입니다. 형광 표지된 마이크로 패턴 이미지는 마이크로 패턴을 중심으로 영역을 delit하는 데 사용되며, 각 파장에 대한 이미지에서 잘리고 각 파장에 대한 스택으로 재조립됩니다. 단일 세포가 있는 마이크로 패턴을 선택하기 위해 매크로는 이미지당 핵 수를 감지하고 모든 스택에서 둘 이상의 핵을 포함하거나 핵이 없는 패턴을 제거합니다.

마지막으로, image J plugin multi-stack reg는 수집된 모든 이미지와 모든 채널을 마이크로패턴 위치에 따라 재정렬하는 데 사용됩니다. 이 단계에서는 이제 단일 세포 분석 또는 참조 셀을 생성하는 데 사용할 수 있는 개별 이미지의 라인 스택을 생성합니다. 이미지 J에서 참조 셀은 스택에서 필터링되고 정렬된 이미지를 투영하여 구성됩니다.

여러 투영 방법을 적용할 수 있지만 일반적으로 이미지 스택의 이상값을 제거하기 위해 중앙값 투영이 선택됩니다. reference cell은 micropattern cell에서만 얻을 수 있는 표현 및 이미지 분석을 위한 독특하고 유용한 도구입니다. 검사를 용이하게 하기 위해 룩업 테이블 또는 LUT가 적용되어 모노 컬러 이미지를 코딩된 주파수 맵으로 변환합니다.

BLEs 스타틴 효과를 특성화하기 위해 두 번째 이미지 J 매크로를 사용하여 세포의 강성과 붕괴를 분석했습니다. 간단히 말해서, L 마이크로 패턴의 임계값 이미지는 세포 삼각형 모양의 이론적 빗변을 정의하는 데 사용됩니다. 다음으로 액톤 염색 이미지의 임계값을 수행하여 세포 모양을 정의합니다.

이론적인 빗변과 실제 오목한 세포막 사이의 면적 차이를 측정한 다음, 이론적인 빗변 아래에 영역을 나타내는 세포가 축소된 것으로 간주됩니다. 5마이크로몰 BLE 스타틴의 영향은 치료 조건과 대조 조건에서 붕괴된 세포의 수를 비교하여 특성화되었습니다. BLEs, 스타틴으로 처리되거나 처리되지 않은 상태로 방치된 L 미세패턴 세포의 전형적인 이미지는 세포가 고정되고 염색된 미세패턴으로 표시됩니다.

액틴과 핵은 각각 빨간색, 녹색 및 파란색으로 표시됩니다. BLEs 스타틴이 대조군 조건과 비교하여 세포 모양에 미치는 영향에 주목하십시오. BLEs 스타틴으로 배양한 후의 대표적인 세포 또는 플레인 피브로넥틴에 대한 대조군이 여기에 나와 있습니다.

세포는 고정되고 염색되었으며, 액틴과 핵은 각각 녹색과 파란색이다. 치료된 상태와 통제된 상태 사이의 유사성에 주목하십시오. BLEs 스타틴으로 처리되거나 처리되지 않은 상태로 방치된 세포에서 얻은 참조 세포의 일반적인 이미지가 표시됩니다.

연구 중인 표현형을 쉽게 관찰할 수 있는 이 접근 방식의 잠재력에 주목하십시오. 다음은 매크로 빗변을 사용하여 BLEs 스타틴이 세포에 미치는 영향을 분석한 예입니다. 대조군 세포의 25%가 붕괴된 반면, 5개의 마이크로몰 BLEs 스타틴 처리 세포에서는 75%가 3배 증가하여 약화된 액티닌 수축 네트워크를 반영했습니다.

이 내용을 시청한 후에는 접착 마이크로 패턴이 고함량 분석에서 여러 병목 현상을 해결하는 방법을 잘 이해하게 되었을 것입니다. 첫째, 접착 마이크로 패턴을 사용하여 이미지 캡처 처리 분석을 훨씬 더 간단하게 만들었습니다. 둘째, 마이크로 패턴을 사용하면 매우 낮은 용량으로 약물의 매우 미묘한 효과를 감지할 수 있는데, 이는 약물의 형태와 행동을 정규화하여 세포 간 변동성을 줄이기 때문입니다.

마지막으로, 세포 분석에서 좋은 결과를 얻기 위해 일반적으로 필요한 수천 개의 세포와 비교했을 때, 당사의 기준 세포를 사용하면 강력하고 유의미한 결과를 얻기 위해 수십 개의 세포만 있으면 됩니다.