연속 흐름 Microspotter을 사용하여 수정 된 표면에 세포의 침수 인쇄

이 실험 절차의 전반적인 목적은 혈청이 코팅된 표면에 T3 섬유아세포를 프린팅하는 것입니다. 이는 먼저 조직 배양 표면에 혈청을 사전 흡착시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 연속 흐름 마이크로 스포터를 사용하여 섬유아세포 현탁액을 표면에 프린팅한 후, 세포를 37 °C에서 2시간 동안 배양하는 것입니다.

다음으로, 프린팅된 세포와 표준 세포 배양을 통해 파종된 세포를 propidium iodide로 염색한 후, 비교를 위해 도립 현미경으로 관찰합니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 관련 시점에서 세포의 생존율, 밀도 및 형태를 평가합니다. 핀 프린팅과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 프린트 헤드가 표면에 밀봉되어 세포가 세포 배지에 잠긴 상태에서 프린팅될 수 있다는 점입니다.

세포의 침지 프린팅은 새로운 약물 후보 물질의 안전성과 효능을 스크리닝하는 데 유용하지만, 일반적인 침지 프린팅은 다른 응용 분야에도 유용합니다. 예를 들어, 조직 절편을 대상으로 새로운 약물 후보 물질을 분석하거나, 이를 장기 시스템 모델로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 간 관류 모델이 이에 해당합니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 프린터 프라이밍 및 세포 프린팅 과정에서 라인에 공기가 유입되면 세포 사멸을 유발할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 먼저, 37°C의 쉐이킹 워터 배스에서 NIH 3T3 세포를 2~3분 동안 해동하십시오. 세포를 5mL의 완전 배지에 재현탁하고 1500G에서 3분 동안 원심분리하십시오.

세포 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 세포 상층액을 제거합니다. 그런 다음 5 mL의 배지로 세포를 재현탁하고, 세포 현탁액 10 µL를 0.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 옮깁니다. 이어서 세포 현탁액에 tripan blue 10 µL를 첨가하고 피펫 팁으로 섞어줍니다. 염색된 세포 10 µL를 헤모사이토미터 챔버에 피펫팅하여 넣습니다.

10배율로 세포 수를 측정하기 전에, 9개의 큰 사각형 중 4개에서 작은 흰색 공 모양으로 보이는 생존 세포의 수를 셉니다. 트립판 블루 염색으로 인해 진한 파란색으로 보이지 않는 생존 세포만 측정하십시오. 큰 사각형당 평균 세포 수를 계산하면, 해당 세포 수에 10,000을 곱한 값이 원래 세포 현탁액의 mL당 세포 수가 됩니다.

그런 다음 T 25 플라스크 각각에 총 5 mL의 부피로 밀리리터당 100,000 cells의 밀도로 세포를 분주합니다. 실험을 시작하기 전까지 세포를 70~80% 밀도로 배양합니다. 프린팅 표면을 준비하려면, 조직 배양 처리된 폴리스티렌 12 바닥면에 마커를 사용하여 프린트 헤드 크기의 직사각형을 표시합니다.

웰 플레이트의 직사각형 영역에 태아 송아지 혈청 50 µL를 피펫으로 분주하고 전체 영역에 걸쳐 펴 바릅니다. 팁을 제거한 후, 혈청 반점이 완전히 마르도록 웰 플레이트를 멸균 바이오안전 작업대 내에 하룻밤 동안 둡니다. 침지 프린팅을 시작하려면 증류수로 프린트 헤드를 헹굽니다.

그 다음 60 millimeter 페트리 접시를 증류수로 채우고 프린트 헤드를 표면에 고정시킨 후, 공압 펌프를 사용하여 각 라인에 150 microliters per minute의 속도로 2분 동안 증류수를 흘려보냅니다. 그런 다음 페트리 접시의 물을 버리고 깨끗한 물로 다시 채웁니다. 이어서 프린트 헤드를 물속에서 세 번 위아래로 움직여 줍니다.

미리 준비한 12-웰 플레이트의 혈청 코팅 지점 중앙에 프린트 헤드를 정렬합니다. 그런 다음 Prewarm 완제 배지를 채널당 300 µL씩 사용하여 프린트 헤드를 프라이밍합니다.

여러 번 프린팅을 수행하는 경우, 프린팅 사이에 물 세척 외에 표백제 세척 단계를 추가하십시오. 부유 세포를 50,000 cells/mL 농도로, 분당 60 µL의 속도로 표면에 프린팅하십시오. 채널당 100 µL를 사용합니다.

세포 프린팅 후, 프린트 헤드를 표면 왼쪽의 도킹 위치에 두고 매니폴드와 함께 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 5% carbon dioxide 및 37 °C로 설정하여 2시간 동안 배양합니다. 2시간의 배양 후, 프린트 헤드를 제거하고 배양 접시에 뚜껑을 덮습니다.

프린트 헤드를 제거한 시점을 0시간 시점으로 간주합니다. 비교를 위해 표준 세포 배양도 함께 수행합니다. 혈청이 점적된 12-웰 플레이트 중 하나에 미리 데워둔 배지 1 mL를 첨가한 후, 남은 세포 현탁액 1 mL를 취해 12-웰 플레이트의 단일 웰에 피펫으로 분주합니다.

이렇게 하면 디쉬 내에 50,000개의 세포가 포함된 배양이 생성됩니다. 세포 배양 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 2시간 동안 두십시오. 2시간의 배양이 끝난 후, 프린팅 샘플과 시딩 샘플 간의 일관성을 위해 시간 측정을 시작하십시오.

이 시점을 0시간 시점으로 간주합니다. 0, 2, 24, 48시간 후에, 죽은 세포의 핵에만 결합하는 propidium iodide로 염색하여 두 가지 방법 각각으로 준비한 세포를 이미징합니다. 먼저, 세포의 잔해를 제거하기 위해 칼슘과 마그네슘이 함유된 phosphate puffed saline 1 mL로 세포를 세 번 부드럽게 헹굽니다.

다음으로, 각 배양 용기에 미리 데워둔 배양 배지 1 mL를 넣은 후, propidium iodide 스탁 솔루션 1 µL를 추가합니다. propidium iodide로 염색된 세포를 37 °C에서 10분 동안 배양한 다음, 도립 현미경을 사용하여 10배 및 40배 배율로 세포를 이미징합니다. 마지막으로 세포를 적절한 생물학적 위험물 폐기 용기에 버립니다.

섬유아세포 세포주인 NIH 3T3 세포를 침전 표면에 프린팅하거나 파종하였습니다. 프린팅 및 파종 후, 관련 시점에서 세포의 밀도와 형태를 평가하기 위해 시각화하였습니다. 이미지를 통해 각 시점과 각 배율에서 세포들이 거의 동일한 표현형을 가지고 있음을 확인하였습니다.

이러한 수치들을 바탕으로, 유효 프린팅량은 매우 적은 것으로 판단되었습니다. 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 염색을 통해 세포 생존능을 평가한 결과, 각 시간대별로 프린팅된 세포의 생존능은 파종된 세포와 유의미한 차이가 없음을 확인하였습니다. 세포를 표면에 부착시키는 두 가지 방법의 주요 차이점은 세포의 밀도입니다.

2시간 시점에서 프린팅된 세포 밀도는 파종된 세포와 프린팅된 세포 모두에서 50% 이상 감소했습니다. 이러한 감소의 원인을 규명하기 위한 추가 연구가 필요합니다. 하지만 파종된 밀도와 비교했을 때 전반적인 프린팅 밀도 비율은 여전히 유의미하게 더 높게 유지되었습니다.

세포를 파종할 때와 동일한 밀도로 출력하되 더 좁은 면적에 출력했음을 고려하면, 플로우 셀 내의 출력된 세포 밀도는 각 시점마다 파종된 세포보다 약 10배 더 높았습니다. 최종 시점에서는 세포들이 동일한 밀도를 보이는데, 이는 세포 이동성과 자원 소비의 제한으로 인한 것으로 보입니다. 이 기술은 개발 이후 신약 개발 분야의 연구자들이 세포에 대한 약물 독성과 효능, 암 보조제, 심장 질환 및 기타 수요가 많은 분야의 영향을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

부착성 및 프로그래밍 가능한 세포 부착과 같은 다른 기술과 침지 세포 프린팅을 병행하여 사용함으로써, 우리는 이 기술의 범위를 부유 세포까지 확장하여 약물 발견 및 개발 스크리닝 범위를 넓힐 수 있습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 당사의 침지 프린팅 기술을 사용하여 세포를 프린팅하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.