연속 흐름 Microspotter을 사용하여 수정 된 표면에 세포의 침수 인쇄

이 절차의 전반적인 목표는 3개의 T 3 섬유아세포를 혈청으로 코팅된 표면에 인쇄하는 것입니다. 이는 먼저 조직 조직 배양 표면에 혈청을 사전 흡착함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 연속 유동 마이크로 스포터를 사용하여 섬유아세포의 현탁액을 표면에 인쇄한 다음 섭씨 37도에서 2시간 동안 세포를 배양

다음으로, 표준 세포 배양을 통해 파종된 세포와 프린팅된 세포를 프로피듐 요오드화물로 염색하고 비교를 위해 도립 현미경으로 시각화합니다. 궁극적으로 형광 현미경 검사는 관련 시점에서 세포 생존율, 밀도 및 형태를 평가하는 데 사용됩니다. 핀 인쇄와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 프린트 헤드가 표면에 밀봉을 형성하여 세포 매체에 잠겨 있는 동안 세포를 인쇄할 수 있다는 것입니다.

세포의 수중 인쇄는 신약 후보의 안전성과 효능을 스크리닝하는 데 유용하지만, 일반적으로 수중 인쇄는 다른 응용 분야에도 유용합니다. 예를 들어, 조직 절편에 대한 신약 후보를 분석하거나 장기 시스템의 모델로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 간 풍량 모델.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 프린터 프라이밍 및 셀 인쇄 중에 공기가 라인에 들어갈 수 없거나 세포가 사멸할 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. NIH 3 T 3 세포를 섭씨 37도의 흔들리는 수조에서 2-3분 동안 해동하기 시작합니다. 5ml의 완전한 배지에 세포를 다시 현탁시키고 1500Gs에서 3분 동안 원심분리합니다.

세포 펠릿을 방해하지 않고 세포 상등액을 제거합니다. 그런 다음 5ml의 배지에 세포를 다시 현탁시키고 10μl의 세포 현탁액을 0.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 10마이크로리터의 트리암 블루를 세포 현탁액에 추가하고 피펫 피펫 끝으로 염색된 세포 10마이크로리터를 혈세포 분석기 챔버에 넣고 저어줍니다.

10배 배율로 세포를 계수하기 전에 9개의 큰 사각형 중 4개에 대해 작은 흰색 공을 닮은 살아있는 세포를 계수합니다. 트리펜 블루 염색에서 짙은 파란색으로 나타나지 않는 살아있는 세포만 계수합니다. 큰 사각 당 세포의 평균 수를 산출해, 세포의 수를 곱하기 10, 본래 세포 현탁액에 있는 밀리리터 당 000개의 세포의 결과

그런 다음 100, 밀리리터당 000개의 세포의 밀도로 세포를 시드하고 각 T 25 플라스크에 총 5밀리리터를 넣습니다. 실험을 시작하기 전에 세포를 70-80% co의 유창성으로 배양합니다. 인쇄 표면을 준비하려면 마커를 사용하여 조직 배양 처리된 폴리스티렌 12의 바닥에 프린트 헤드 크기의 직사각형을 표시합니다.

웰 플레이트: 50마이크로리터의 소 태아 혈청을 직사각형 영역에 넣고 전체 영역에 펴 바릅니다. 팁을 사용하여 웰 플레이트를 멸균 생물 안전 후드에 밤새 두어 혈청 얼룩이 완전히 건조될 수 있도록 합니다. 침수 인쇄를 시작하려면 프린트 헤드를 증류수로 헹굽니다.

그런 다음 60mm 페트리 접시에 증류수를 채우고 프린트 헤드를 표면에 도킹하고 공압 펌프를 사용하여 분당 150마이크로리터로 2분 동안 각 라인을 통해 증류수를 흐릅니다. 그런 다음 페트리 접시에서 물을 버리고 깨끗한 물로 채웁니다. 그런 다음 물 속에서 프린트 헤드를 위아래로 세 번 움직입니다.

프린트 헤드 중앙을 사전 준비된 12웰 플레이트의 세럼 코팅 지점 위에 도킹합니다. 그런 다음 프린트 헤드를 Prewarm으로 프라이밍합니다. 채널당 300마이크로리터의 완전한 미디어.

여러 번 인쇄하는 경우 인쇄 사이에 물 헹굼 외에 표백제 헹굼을 추가하십시오. 표면에 50, 밀리리터당 000 세포의 농도로, 그리고 분당 60 마이크로리터로 부유 세포를 인쇄하는 것을 진행하십시오. 채널당 100마이크로리터.

세포 프린팅 후 프린트 헤드를 표면과 매니폴드에 도킹한 상태로 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 이산화탄소를 5%로 설정하고 섭씨 37도로 2시간 동안 설정합니다. 2시간 동안 배양한 후 프린트 헤드를 제거하고 배양 접시에 뚜껑을 놓습니다.

프린트 헤드가 제거되는 시간은 0시 시점으로 간주됩니다. 비교를 위해 표준 세포 배양도 수행됩니다. 혈청이 발견된 12웰 플레이트 중 하나에 1밀리리터의 예열 배지를 추가한 다음 나머지 세포 현탁액 1밀리리터를 12웰 플레이트의 단일 웰에 피펫팅합니다.

이것은 접시에 50, 000 세포를 포함하는 배양물을 생산할 것입니다. 세포 배양 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 2시간 동안 놓습니다. 2시간의 배양 후, 인쇄된 샘플과 파종(seeding) 샘플 간의 일관성을 위한 타이밍을 시작합니다.

이는 0시간 시점으로 간주됩니다. 0, 2, 24 및 48시간 후, 죽은 세포의 핵에만 통합되는 프로피듐 요오드화물로 염색하여 이미징을 위해 두 가지 방법 각각에서 세포를 준비합니다. 먼저 칼슘과 마그네슘이 함유된 인산염 부풀어 오른 식염수 1ml로 세포를 부드럽게 세 번 헹구어 이물질을 제거합니다.

다음으로, 각 배양 용기에 1ml의 예열 배양 배지를 추가한 다음 1마이크로리터의 프로피듐 요오드화물을 추가합니다. 원액은 섭씨 37도에서 프로피듐 요오드화물로 염색된 세포를 10분 동안 배양한 후 10배 및 40배 배율에서 도립 현미경을 사용하여 세포를 이미징합니다. 마지막으로 적절한 생물학적 위험 용기에 세포를 폐기합니다.

섬유아세포 세포주, NIH 3 T 3 세포를 물에 잠긴 표면에 인쇄하거나 파종했습니다. 프린팅 및 파종 후, 세포를 시각화하여 관련 시점의 밀도와 형태를 평가했습니다. 이미지는 세포가 각 시점과 각 배율에서 거의 동일한 표현형을 가지고 있음을 보여주었습니다.

이러한 수치에 기초하여, 효과적인 인쇄는 최소한으로 결정되었다. 세포 생존율은 프로피듐 요오드화물 염색을 사용하여 평가되었으며, 인쇄된 세포의 생존율이 각 시점에 대해 앉은 세포와 크게 다르지 않음을 밝혔습니다. 세포를 표면에 부착하는 두 가지 방법의 가장 큰 차이점은 세포의 밀도입니다.

인쇄된 셀 밀도는 2시간 시점에서 장착된 셀과 프린트된 셀 모두에서 50% 이상 감소합니다. 이러한 감소의 원인을 규명하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 그러나 전체 인쇄 밀도 비율은 시딩된 것과 비교할 때 훨씬 더 높습니다.

플로우 셀(flow cell)에서 프린트된 세포 밀도는 세포가 파종과 동일한 밀도로 프린팅되었지만 더 작은 면적에서 프린팅되었다는 점을 고려하여 각 시점에서 시딩된 세포보다 약 10배 더 조밀했습니다. 최종 시점에서 세포는 동일한 밀도에 있는데, 이는 세포 운동성과 자원 소비 제한 때문일 수 있습니다. 개발 이후 이 기술은 신약 개발 분야의 연구자들이 세포 및 암 에이즈, 심장 질환 및 기타 수요가 많은 분야에 대한 약물 독성 및 효능의 영향을 연구할 수 있는 길을 열었습니다.

부착(adherence), 프로그래밍 가능한 세포 접착(programmable cell adhesion)과 같은 다른 기술과 함께 수중 세포 프린팅을 사용함으로써, 당사는 확장된 약물 발견 및 개발 스크리닝을 위해 이 기술의 범위를 현탁 세포로 확장할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 수중 인쇄 기술을 사용하여 셀을 인쇄하는 방법을 확실히 이해하게 될 것입니다.