랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

다음 실험의 전체적인 목표는 랜덤 원추형 틸트(random conical tilt) 방법을 사용하여 엑소좀 복합체의 3차원 구조를 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 홀 카본 그리드(holy carbon grid) 위에 얇은 카본 필름 층을 증착하여 단백질 복합체를 위한 지지 기질을 만들고, 두 번째 단계로 염색을 진행합니다. 시편과 염색약을 그리드에 도포하면 시편이 중금속 염에 둘러싸이게 됩니다.

그 다음, 시편의 틸트 쌍 마이크로그래프를 얻기 위해 전자 현미경 관찰을 수행합니다. 마지막으로, 랜덤 원추형 틸트법(random conical tilt method)을 이용한 이미지 분석을 기반으로 엑소좀 복합체의 3차원 구조를 보여주는 결과를 얻습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자들은 랜덤 원추형 틸트법을 위한 시편 준비가 까다로운 경우가 많고, 이어지는 이미지 처리 과정 또한 어렵기 때문에 고전할 수 있습니다.

시료 평가에 대한 설명 없이는 등급 및 시편 준비 단계를 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시연은 매우 중요합니다. 무작위 원뿔형 틸트(random conical tilt)법의 원리는 전자현미경 내부에서 시편의 동일한 영역에 대해 한 쌍의 마이크로그래프를 촬영하는 것입니다. 하나는 기울이지 않은 상태의 시편을 촬영하고, 다른 하나는 50에서 70도 사이의 각도로 기울인 시편을 촬영합니다. 컴퓨터를 사용하여 디지털화된 마이크로그래프 쌍을 나란히 배치하고, 이 시연에서는 동일한 입자의 이미지들을 선택합니다.

이 이미지들은 3차원 좌표의 숫자로 표시되어 있습니다. 기울이지 않은 입자의 이미지와 기울인 파트너 입자의 이미지는 기울임 축의 방향과 기울임 각도에 의해 서로 상관관계가 있습니다. 기울이지 않은 입자 이미지들을 정렬하면, 방위각 공간을 채우는 기울인 입자의 다수 이미지들을 사용하여 기울인 입자 이미지들을 해당 asMule 위치로 가져올 수 있으며, 이를 통해 역투영 알고리즘을 사용하여 분자의 3차원 구조를 재구성할 수 있습니다. 그리드를 제작하려면, 먼저 100 mL 유리 비커에 0.45 g의 폴리비닐포멀 수지와 90 mL의 클로로포름을 첨가하여 0.5% Formvar 용액을 준비하십시오.

흄 후드 내에서 비커를 알루미늄 호일로 덮고 form var 수지를 용해합니다. 작은 스터 바와 마그네틱 교반기를 사용하면 수지가 용해되는 데 약 15분이 소요됩니다. 그동안 미리 세척된 현미경 유리 슬라이드를 메탄올과 Kim wipes로 닦아 냅니다.

클로로포름 내에서 formvar 수지가 완전히 용해된 후, 용액 표면에 50% glycerol 1 mL를 첨가하십시오. 첨가하는 glycerol의 부피를 조절하면 holy carbon의 구멍 밀도에 영향을 줍니다.

초음파 팁의 끝부분을 용액에 담급니다. 약 1인치 깊이에서 최대 출력을 사용하여 1분 동안 초음파 처리하면, 용액 형태로 글리세롤 액적의 에멀젼이 형성됩니다. 초음파 처리 시간이 길어질수록 홀리 카본(holy carbon)의 구멍 크기는 더 작아집니다.

이 단계 이후 용액은 우윳빛으로 변합니다. 초음파 세척 직후, 깨끗한 유리 슬라이드를 에멀전 용액에 수직으로 담급니다. 1초 후 슬라이드를 꺼내어 필터 페이퍼로 슬라이드 바닥면을 닦아내어 슬라이드 표면에 얇은 플라스틱 막을 형성합니다.

클로로포름이 증발한 후, 광학 현미경으로 필름 내 구멍의 밀도와 크기를 확인하십시오. 여기에 설명된 제조 조건으로는 400 mesh 그리드의 각 사각형당 10~20개의 구멍이 생성되어야 하며, 구멍의 직경은 3~4 µm 사이여야 합니다. 유리 슬라이드가 건조되면, 슬라이드 표면에 있는 플라스틱 필름의 가장자리를 자르십시오.

슬라이드를 물에 수직으로 담가 증류수 표면에 필름을 띄웁니다. 물 표면의 박막은 빛 반사를 이용해 얕은 각도에서 관찰할 수 있습니다. 400 mesh 구리 그리드의 매끄러운 면이 아래를 향하도록 하여 필름 위에 하나씩 올립니다.

격자가 그려진 플라스틱 필름을 종이 조각을 사용하여 들어 올립니다. 종이를 뒤집어 건조시킵니다. 페트리 접시에서 종이를 메탄올에 담가 구멍 내의 잔류 글리세롤을 제거한 후, 종이를 공기 중에서 건조시킵니다.

탄소 증착기를 사용하여 그리드에 약 20 nanometers 두께의 탄소 층을 코팅합니다. 이때 증착 시간을 조절하여 원하는 두께를 맞춥니다. 두께는 기지의 두께를 가진 탄소 층의 회색조와 비교하여 탄소의 회색 정도를 통해 확인할 수 있습니다.

폼바(form var)를 제거하기 위해 유리 페트리 접시에 담긴 클로로포름에 탄소 층 그리드를 30분 동안 담근 후, 그리드를 건조시키면 수제 홀리 카본(holy carbon) 그리드가 생성됩니다. 다음으로, 갓 떼어낸 마이카 표면에 약 5 nm 두께의 얇은 탄소 층을 증착시킵니다. 그 후, 증류수 아래의 거름종이 위에 홀리 카본 그리드를 조심스럽게 올려놓습니다.

자체 제작한 장치를 사용하여 마이카 표면의 얇은 탄소 막을 수면 위로 띄운 다음, 이를 홀 카본 그리드 위에 천천히 안착시킵니다. 그리드가 놓인 거름종이를 집어 들어 건조시킵니다. 흄 후드 내에서 2% uranyl formate 용액을 새로 조제하여 엑소좀 복합체의 음성 염색을 시작합니다.

서면 절차에 기술된 대로, 빛 노출을 방지하기 위해 솔루션 튜브를 알루미늄 호일 조각으로 덮습니다. 솔루션은 당일에 사용해야 합니다. 글로우 방전 장치를 사용하여 얇은 탄소 박막을 탄소 그리드 전체에 글로우 방전 처리합니다. 다음으로, 벤치 위에 깨끗한 파라필름 조각을 놓습니다. 파라필름 위에 우라닐 포르메이트 염색 솔루션 50 µL 방울 3개를 피펫으로 분주합니다. 희석 버퍼를 사용하여 엑소좀 복합체를 약 50 nM 농도로 희석합니다. 희석된 단백질 4 µL를 글로우 방전 처리된 그리드 위에 피펫으로 분주합니다.

샘플을 그리드 위에 1분 동안 그대로 둔 다음, 핀셋을 사용하여 여과지 조각으로 잔류 용액을 흡수합니다. 그리드를 즉시 첫 번째 염색액 방울 위로 뒤집고, 약 10초 동안 그리드를 여러 번 앞뒤로 움직여 헹굽니다. 세 가지 염색액 방울 각각에 대해 이 과정을 반복하고, 마지막 헹굼 후 염색액이 그리드 위에 1분 더 머물도록 합니다.

그 후 필터 페이퍼 조각으로 염색액을 닦아냅니다. 그리드 표면에 염색액을 얇게 남겨두고 흄 후드 내에서 그리드를 건조시킵니다. 샘플 그리드를 샘플 홀더에 장착한 후, 홀더를 FEI TE nine 12 전자 현미경에 넣습니다.

저배율에서 샘플 그리드를 확인하여 염색 상태가 가장 좋은 영역을 찾습니다. 적절한 영역은 크기가 약 1~2 µm인 구멍이 12개 정도 있으며, 그 내부에 어둡게 염색된 부위가 관찰됩니다. FEI 사용자 인터페이스의 low dose 모드를 켜고, low dose 모드에서 search focus와 expose position을 정렬합니다.

검색 모드를 1.5m 카메라 길이의 분할 모드(fraction mode)로 설정하십시오. 초점은 150K 배율로 설정하고, 노출은 1초의 측정 노출 시간과 함께 50K 배율로 설정하십시오. 일반적으로 검색 및 노출 모드 모두에서 그리드 상의 식별 가능한 특징을 이용하여 정렬을 수행합니다.

탐색 모드에서 염색 상태가 좋은 구멍들을 찾아 위치를 저장합니다. 해당 영역의 CCD 사진을 촬영합니다. 시편을 55도로 기울인 후 다시 사진을 촬영합니다.

두 사진을 비교하여 두 마이크로그래프에서 짝이 맞는 구멍들을 식별하십시오. 스테이지를 다시 0도로 기울입니다. 저선량 키트를 사용하여 검색 모드에서 식별된 각 구멍을 약 -0.7 µm의 디포커스 값으로 고배율에서 촬영하십시오.

모든 홀의 사진 촬영을 마친 후, 동일한 배율을 유지하며 스테이지를 55도로 기울입니다. 약 -1.2 µm의 디포커스(defocus) 상태에서 기울어진 시편의 마이크로그래프를 촬영합니다. 자체 제작한 holy carbon 그리드의 불규칙한 패턴을 이용하여, 저배율 마이크로그래프의 패턴을 기반으로 그에 대응하는 기울기 쌍(tilt pair)의 마이크로그래프를 식별합니다.

상관관계 분석을 위해 입자가 균일하게 분포되어 있고 입자 주변에 헤일로(halo)가 없는 현미경 사진 기울기 쌍을 선택하십시오. 데이터 처리를 위해 입자 주변에 뚜렷한 염색 헤일로가 있는 현미경 사진은 폐기해야 합니다. 절차의 프로그램 설정부터 시작하십시오.

이미지 처리는 Eman 패키지의 process 2D를 사용하여 시연합니다. 이미지 형식을 변경하려면 iMagic five 패키지를 사용하여 2D 정렬을 수행하고 spider 패키지를 사용합니다. 3D 재구성 및 정밀화를 수행하려면 DM three Gatan 디지털 이미지를 spider 이미지 형식으로 변환하십시오.

process 2D 명령어를 사용하여 입자 쌍을 선택합니다. spider 프로그램 패키지에 포함된 웹 프로그램을 사용하면, 프로그램이 입자의 좌표를 자동으로 저장하고 spider 스크립트를 사용하여 선택된 모든 입자를 박스 아웃(box out)합니다. 이 스크립트는 기울어진(tilted) 입자 스택과 기울어지지 않은(un tilted) 입자 스택을 저장합니다.

UN tilted 입자들을 IMAG five 형식으로 변환합니다. EM two EM 프로그램의 밴드 패스 기능을 사용하여, IMAG five의 InCorp prep 명령어로 UN tilted 입자들을 필터링하고 마스킹하며, center 명령어를 사용하여 밴드 패스 마스킹된 입자들의 중심을 맞춥니다. IMAG five에서 IMAG five 프로그램들을 자동으로 실행하는 배치 스크립트를 사용하여 입자들을 균질한 클래스로 반복적으로 정렬하고 분류합니다.

다음으로, IMAG five의 MSA names in class 명령어를 사용하여 입자의 클래스 조회 테이블을 생성하고, header 명령어를 사용하여 각 입자의 정렬에 대한 병진 및 회전 값의 플롯 파일을 생성합니다. iMagic five에서 EM two EM 프로그램을 사용하여 정렬된 입자를 spider 형식으로 변환합니다. 그런 다음 클래스 조회 테이블을 spider 문서 파일로 변경합니다.

각 입자의 정렬에 대한 이동 및 회전 값을 spider 문서 파일로 변환합니다. IMAG five에서 기울이지 않은 입자에 대해 수행한 것과 동일하게, 기울어진 입자들에 대해서도 밴드 패스 필터링, 마스킹 및 중심 잡기를 수행하여 중심이 잡힌 기울어진 입자들에 대한 새로운 데이터 세트를 생성합니다. IMAG five에서 생성된 다중 참조 정렬 문서와 웹 프로그램에서 생성된 DCB 파일을 사용하여 각도 문서 파일을 생성합니다. spider의 역투영 스크립트를 사용하여 각 클래스 평균에 대한 초기 모델을 하나씩 얻습니다.

마지막으로, spider 스크립트를 사용하여 기울이지 않은 모든 입자를 대상으로 초기 볼륨의 투영 정밀화(projection refinement)를 수행하여 RCT를 통해 최종 볼륨을 얻습니다. 엑소좀에 대해 약 50개의 재구성이 얻어졌습니다. 이 볼륨들은 기울이지 않은 입자의 50개 클래스 각각에 해당하는 기울어진 입자들로부터 생성됩니다.

spider 패키지에 구현된 역투영(back projection)을 사용하여, 이 볼륨들을 초기 모델로 설정하고 투영 매칭 정밀화(projection matching refinement)를 수행하였습니다. 약 18 Å 해상도로 생성된 엑소좀의 3D 볼륨을 통해, 3D 맵 내에 복합체 각 부분의 원자 모델을 배치할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 시편의 적절한 내러티브 스탠딩 그리드 제작부터 마이크로그라프 획득, 그리고 최종적으로 이미지 분석 기술을 이용한 재구성에 이르기까지, RCT를 사용하여 3차원 재구성을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 여기서 설명한 프로토콜 외에도, 이미지 분석에서 최종 재구성을 얻기 위한 여러 가지 방법이 존재합니다.

신뢰할 수 있고 정확한 재구성 결과를 얻기 위해 가장 중요한 단계는 표본을 충분히 잘 준비하는 것입니다.