랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

다음 실험의 전반적인 목표는 무작위 원뿔 기울기 방법을 사용하여 엑소좀 복합체의 3차원 구조를 얻는 것입니다. 이것은 먼저 거룩한 탄소 그리드에 얇은 층의 탄소 필름을 증착하여 단백질 복합체와 염색에 대한 지지 기질을 두 번째 단계로 수행함으로써 달성됩니다. 표본과 얼룩은 그리드에 적용되어 표본을 중금속 염에 묻습니다.

그런 다음 전자 현미경을 수행하여 표본의 현미경 사진의 기울기 쌍을 얻습니다. 마지막으로, 무작위 원뿔 기울기 방법을 사용한 이미지 분석을 기반으로 엑소좀 복합체의 3차원 구조를 보여주는 결과를 얻습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 무작위 원뿔 기울기 방법에 대한 표본을 잘 준비하는 것과 View에 따른 이미지 처리 절차가 어려운 경우가 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법의 시연은 샘플 평가에 대한 설명 없이는 등급 및 시편 준비 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 무작위 원뿔형 기울기 방법의 원리는 전자 현미경 내부에서 표본의 동일한 영역에 대한 한 쌍의 현미경 사진을 촬영해야 합니다. 한 사진은 기울어지지 않은 위치에서 표본을 촬영한 것이고, 다른 한 장은 50도에서 70도 사이의 각도로 기울어진 표본을 찍은 것입니다.컴퓨터를 사용하여 디지털화된 현미경 그래프 쌍을 나란히 놓고 동일한 입자의 이미지를 이 그림에서 선택합니다.

이 이미지는 3차원 좌표에서 숫자로 표시됩니다. 기울어지지 않은 입자와 기울어진 파트너의 이미지는 틸트 축의 방향과 틸트 각도에 의해 서로 상관됩니다. 기울어지지 않은 입자 이미지의 정렬은 방위각 공간을 채우는 기울어 진 입자의 여러 이미지를 사용하여 기울어 진 입자의 이미지를 뮬 위치로 가져 오고, 분자의 3 차원 구조를 백 프로젝션 알고리즘을 사용하여 그리드를 먼저 제작하여 재구성 할 수 있으며, 0.45 그램의 폴리 비닐 공식 수지를 첨가하여 0.5 % 형태의 VAR 솔루션을 준비하고, 90 밀리리터의 클로로포름을 100 밀리리터 유리 비커에 넣습니다.

흄 후드에서 비커를 알루미늄 호일로 덮고 var 수지 형태를 용해시킵니다. 8개의 작은 교반 막대와 자기 교반을 사용하면 수지가 용해되는 데 약 15분이 걸립니다. 한편, 깨끗하고 사전 세척된 현미경 유리 슬라이드는 메탄올과 Kim 물티슈로 표시됩니다.

형태 후 var 수지가 완전히 용해됩니다. 클로로포름에서 용액 표면에 1ml의 50% 글리세롤을 첨가합니다. 첨가된 글리세롤의 부피를 조절하면 성탄소의 구멍 밀도에 영향을 미칩니다.

초음파의 끝을 용액에 끼웁니다. 약 1 인치 깊이에서 최대 출력을 사용하여 1 분 동안 초음파 처리하면 용액 형태의 글리세롤 방울 에멀젼이 만들어집니다. 더 긴 초음파 처리는 성스러운 탄소에 있는 구멍의 더 작은 크기를 일으키게 할 것이다.

이 단계가 끝나면 용액이 유백색이 됩니다. 초음파 처리 딥 직후, 깨끗한 유리는 에멀젼 속으로 수직으로 미끄러집니다. 1초 동안 그것들을 꺼내 여과지를 사용하여 슬라이드 바닥을 닦아서 슬라이드 표면 위에 얇은 플라스틱 필름을 형성합니다.

클로로포름이 증발한 후 광학 현미경으로 필름에 있는 구멍의 밀도와 크기를 확인하십시오. 여기에 설명된 준비 조건은 직경이 3-4마이크로미터 사이인 400메쉬 그리드의 각 정사각형에 10-20개의 구멍을 생성해야 합니다. 유리 슬라이드가 건조되면 슬라이드 표면의 플라스틱 필름 가장자리를 자릅니다.

슬라이드를 물에 수직으로 담궈 증류수 표면에 필름을 띄웁니다. 물 표면의 박막은 빛 반사에 대해 깜박이는 각도로 관찰할 수 있습니다. 그리드의 매끄러운 표면이 아래를 향하도록 필름에 400개의 메쉬 구리 그리드를 하나씩 놓습니다.

종이 한 장을 사용하여 격자가 있는 플라스틱 필름을 집습니다. 종이를 뒤집어 말리십시오. 페트리 접시에서 종이를 메탄올에 담그어 구멍에 남아 있는 글리세롤을 제거하고 종이를 자연 건조시킵니다.

탄소 증발기를 사용하여 약 20나노미터 두께의 탄소 층으로 그리드를 코팅합니다. 증발 시간을 사용하여 원하는 두께를 제어합니다. 두께는 공지된 두께의 탄소층의 회색과 비교하여 탄소의 회색 색에 의해 결정될 수 있습니다.

클로로포름이 함유된 탄소 층 그리드를 유리 페트리 접시에 30분 동안 담궈 형태 var 제거를 제거한 다음 그리드를 건조하면 집에서 만든 신성한 탄소 그리드가 생성됩니다. 다음으로, 약 5나노미터 두께의 얇은 탄소 층을 갓 절단된 운모 표면에 증발시킵니다. 그런 다음 증류수 아래의 여과지 조각에 신성한 탄소 그리드를 조심스럽게 놓습니다.

집에서 만든 기구에 운모 표면의 얇은 탄소를 물 표면에 띄우고 신성한 탄소 그리드에 천천히 쌓습니다. 그리드가 있는 여과지를 집어 말리십시오. 흄 후드에서 새로운 2% 소변기 포름산염 용액을 만들어 엑소좀 복합체의 음성 염색을 시작합니다.

서면 절차에 설명된 대로 용액 튜브를 알루미늄 호일 조각으로 덮으십시오.빛 노출을 방지하려면 용액을 동일하게 사용해야 합니다. 데이 글로우 방전은 글로우 방전 장치를 사용하여 전체 탄소 그리드를 통해 하나의 얇은 탄소를 방전합니다. 다음으로, 깨끗한 퍼퓸 조각을 벤치 피펫에 놓고 퍼필 위에 50마이크로리터의 소변기 포름산염 염색 용액 방울 3개를 놓고 엑소좀 복합체를 약 50나노몰의 농도로 희석합니다. 희석 완충액 피펫을 사용하여 글로우 방전 그리드가 그리드가 될 때까지 희석된 단백질 4마이크로리터를 사용합니다.

샘플을 그리드에 1분 동안 그대로 두었다가 핀셋을 사용하여 여과지 조각으로 잔류 용액을 닦아냅니다. 첫 번째 얼룩 방울 위에 그리드를 즉시 뒤집고 약 10초 동안 그리드를 앞뒤로 여러 번 움직여 그리드를 헹굽니다. 마지막 헹굼 후 세 개의 얼룩 방울 각각에 대해 이 과정을 반복하고 얼룩이 그리드에 1분 더 머물도록 합니다.

그런 다음 여과지 한 조각으로 얼룩을 닦아내십시오. 그리드 표면에 얼룩 용액의 얇은 층을 유지하고 그리드가 흄 후드에서 건조되도록 합니다. 샘플 그리드를 샘플 홀더에 넣은 다음 홀더를 FEI TE nine 12 전자 현미경에 넣습니다.

낮은 배율에서 샘플 그리드를 확인하여 최상의 염색 사각형을 찾으십시오. 좋은 사각형에는 약 1-2 마이크로 미터 크기의 12 개의 구멍과 그 안에 어두운 얼룩진 영역이 있습니다. FEI 사용자 인터페이스의 저선량 모드를 켜고 저선량 모드에서 검색 초점과 노출 위치를 정렬합니다.

카메라 길이가 1.5미터인 분수 모드로 검색을 설정합니다. 초점을 150K 배율로 설정하고 1초 동안 측정된 노출 시간으로 노출을 50K 배율로 설정합니다. 일반적으로 검색 모드와 노출 모드 모두에서 그리드에서 인식할 수 있는 피처가 정렬을 수행하는 데 사용됩니다.

검색 모드에서 얼룩이 잘 난 구멍을 찾아 위치를 저장하십시오. 광장의 CCD 사진을 찍습니다. 표본을 55도로 기울이고 다른 사진을 찍습니다.

두 그림을 비교하고 두 현미경 사진에서 쌍을 이루는 구멍을 식별합니다. 스테이지를 다시 0도로 기울입니다. 저선량 키트를 사용하여 약 마이너스 0.7마이크로미터의 디포커스로 고배율로 검색 모드에서 식별된 각 구멍의 사진을 촬영합니다.

모든 구멍의 사진을 찍은 후 스테이지를 기울입니다.tage 동일한 배율을 사용하여 55도. 약 마이너스 1.2 마이크로미터의 디포커스로 기울어진 표본의 현미경 사진을 찍습니다. 집에서 만든 성스러운 탄소 격자의 불규칙한 패턴을 사용하여 저배율 현미경 사진의 패턴을 기반으로 해당 기울기 쌍의 현미경 사진을 식별합니다.

상관 관계를 파악하는 데 도움이 되도록 균일한 분포의 입자가 있고 입자 주위에 후광이 없는 현미경 기울기 쌍을 선택합니다. 주변에 명백한 얼룩 후광이 있는 현미경 사진은 데이터를 처리하기 위해 폐기해야 합니다. 프로그램 설정으로 시작 절차에서.

이미지 처리는 Eman 패키지에서 프로세스 2D를 사용하여 시연됩니다. 이미지 형식을 변경하려면 iMagic five 패키지가 2D 정렬을 수행하고 스파이더 패키지를 수행합니다. 3D 재구성 및 미세 조정을 수행하려면 DM three Gatan 디지털 이미지를 스파이더 이미지 형식으로 변환하십시오.

프로세스 2D 명령을 사용하여 파티클 쌍을 선택합니다. 스파이더 프로그램 패키지에 배포된 웹 프로그램을 사용하여 프로그램은 스파이더 스크립트를 사용하여 선택한 모든 입자를 상자 밖으로 입자의 좌표를 자동으로 저장합니다. 스크립트는 기울어진 입자와 기울어지지 않은 입자 스택을 저장합니다.

UN 틸트 입자를 IMAG five 형식으로 변환합니다. EM 2 EM 프로그램 밴드 패스를 사용하여 IMAG 5의 InCorp prep 명령을 사용하여 UN 틸트 입자를 필터링 및 마스킹하고 center 명령을 사용하여 밴드 패스 마스킹된 입자를 중앙에 배치합니다. imag five에서는 IMAG five 프로그램을 자동으로 실행하는 배치 스크립트를 사용하여 입자를 동종 클래스로 반복적으로 정렬하고 분류합니다.

다음으로, IMAG five의 MSA names in class 명령을 사용하여 입자의 클래스 조회 테이블을 생성하고, 헤더 명령을 사용하여 각 입자에 대한 정렬의 변환 및 회전 값에 대한 플롯 파일을 생성합니다. iMagic five에서 EM two EM 프로그램을 사용하여 정렬된 입자를 스파이더 형식으로 변환합니다. 그런 다음 클래스 조회 테이블을 스파이더 문서 파일로 변경합니다.

각 입자에 대한 정렬의 변환 및 회전 값도 스파이더 문서 파일 대역 통과 필터로 변환되며, IMAG five의 기울어지지 않은 입자와 마찬가지로 기울어진 입자를 마스킹하고 중앙에 배치하여 중앙 기울어진 입자에 대한 새로운 데이터 세트를 생성합니다. IMAG five에서 생성된 다중 참조 정렬 문서와 웹 프로그램에서 생성된 DCB 파일에서 각도 문서 파일을 만듭니다. 스파이더에서 백 프로젝션 스크립트를 사용하여 각 클래스 평균에 대해 하나의 초기 모델을 가져옵니다.

마지막으로, 기울어지지 않은 모든 입자에 대해 스파이더 스크립트를 사용하여 초기 볼륨의 프로젝션 미세 조정을 수행하여 RCT를 사용하여 최종 볼륨을 얻습니다. 약 50개의 엑소좀이 복원되었습니다. 부피는 기울어지지 않은 입자의 50개 등급에 속하는 각 입자에 해당하는 기울어진 입자에서 생성됩니다.

스파이더 패키지에 구현된 백 프로젝션을 사용하여 프로젝션 매칭 개선을 수행한 다음 이러한 볼륨을 초기 모델로 사용하고 표시된 엑소좀의 3D 볼륨을 약 18ang 추가 해상도로 생성한 다음 3D 맵에서 복합체의 다른 부분에 대한 원자 모델을 덕인할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 RCT를 사용하여 표본의 좋은 내러티브 스탠딩 그리드를 생성하는 것부터 피어 투 피어 현미경 사진에 이르기까지 3차원 재구성을 얻는 방법, 그리고 마지막으로 이미지 분석 기술을 사용하여 재구성을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기에서 설명한 프로토콜 외에도 이미지 분석에서 최종 재구성을 얻는 몇 가지 방법이 있습니다.

신뢰할 수 있는 올바른 재구성을 얻기 위한 가장 중요한 단계는 잘 준비된 표본으로 작업하는 것입니다.