Name: 랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 배우세요 랜덤 코니컬 틸트 방법을 사용하여 Saccharomyces cerevisiae exosome 단지의 3차원 구조를 재구성하는 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 전자현미경 초보 연구자에게 중요한 구조생물학 기술을 제공합니다.

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저자는 전체 프로토콜을 확립하기 위해 도움 예일 대학에서 초기 프로토콜과 왕 실험실의 구성원 확립 도움 UC 버클리에서 노갈레즈 실험실의 구성원을 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 지원에 대한 의학의 예일 학교 cryo - EM 시설 및 고성능 계산 센터에서 직원을 인정합니다. HW는 스미스 가족 Awardee입니다.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서에서 우리는 샘플 준비 상세한 프로토콜과 부정적인 얼룩의 전자 현미경을 사용하여 exosome 복잡한 세 차원 재건을 제시. 이 방법을 사용하여, 우리는 구조의 어떤 사전 지식없이 임의의 원뿔 기울기 방법을 사용하여 3D 재건을 획득하였습니다. 랜덤 원뿔 틸트 방식은 반드시 단일 샘플을 필요로하지 않습니다 그러나 다음과 같은 투영 일치 상세 검색 단계는 높은 해상도를 달성하기 위해서는 단일 표본이 필요합니다. 부정 얼룩 샘플, 얼룩 두께가 작동하기 위해 임의의 원뿔 기울기 방법에 대해서는 매우 중요합니다. 너무 얇은 얼룩이 재건의 유물을 소개하는 높은 기울기 각도에서 분자의 검은 헤일로가 발생합니다. 너무 두꺼운 얼룩은 현미경으로 입자의 신호 대 잡음 비율을 줄일 수 있습니다. 우리가 사용하는 지속적인 탄소 필름의 얇은 층이 적용 홀리 탄소 격자보다 쉽게​​ 최적의 얼룩 조건을 달성 도움이 될 수 있습니다. 집에서 만든 홀리 탄소 그러한 Quantifoil 또는 C -...

<table><tbody><tr><td>폴리비닐 포름알데히드 수지(Polyvinyl Formal Resin)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 포르메이트(Uranyl Formate)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>400 mesh 일반 그리드</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Carbon coater Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai-12 전자현미경</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글로우 방전 장치(Glow Discharger)</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Sputter Coater SCD 005</td></tr></tbody></table>

랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

단일 입자 전자 현미경 (EM)이 재건 최근 대형 macromolecular의 단지의 3 차원 (3D) 구조를 얻을 수있는 인기있는 도구가되었습니다. X - 선 crystallography에 비해 몇 가지 독특한 장점이 있습니다. 첫째, 단일 입자 EM 재건 특히 대형 macromolecular의 단지에 대해, X - 레이 crystallography에 병목있는 단백질 샘플을 구체화 필요가 없습니다. 둘째, 그것은 단백질 샘플을 다량 필요하지 않습니다. 결정에 필요한 단백질의 밀리그램에 비해, 단일 입자 EM 재건은 부정적인 얼룩 EM 방법을 사용하여 나노 어금니 농도에서 단백질 솔루션의 몇 마이크로 리터 필요합니다. 그러나, 높은 대칭과 함께 몇 macromolecular 어셈블리에도 불구하고, 하나의 입자는 EM은 특히 이러한 대칭없이 많은 표본에 대한 (하단보다 1 나노미터 해상도) 상대적으로 낮은 해상도로 제한됩니다. 이 방법도 연구에서 분자의 크기에 의해 제한, 일반적으로 냉동 수산화 표본에 대한 부정적인 스테인드 표본 300 KDA에 대한 즉, 100 KDA. 알 수없는 구조의 새로운 샘플의 경우, 우리는 일반적으로 부정적인 얼룩으로 분자를 포함하는 중금속 솔루션을 사용합니다. 표본은 다음 분자의 2 차원 (2D) micrographs을 위해 전송 전자 현미경으로 검사합니다. 이상적으로, 단백질 분자가 단일 차원 구조를 가지고 있지만 micrographs 다른 방향을 나타냅니다. 이러한 micrographs은 &quot;단일 입자&quot;로 디지털 및 컴퓨터에서 처리됩니다. 2 차원 배열과 분류 기법을 사용하여 같은 전망에 균일한 분자는 클래스로 클러스터된 수 있습니다. 그들의 평균 분자의 2 차원 형태의 신호를 향상시킬 수 있습니다. 우리가 적절한 상호 표정 (오일러 각도)와 입자를 지정 후, 우리는 3 차원 가상 볼륨에 2D 입자 이미지를 재구 성할 수있게 될 것입니다. 단일 입자 3 차원 재건에 필수적인 단계가 제대로 각 단일 입자의 적절한 방향을 지정하는 것입니다. 각도 reconstitution 1 임의의 원뿔 기울기 (RCT) 방법 2를 포함하여, 각 입자에 대한보기를 할당하는 방법은 여러 가지가 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 부정적인 얼룩 EM와 RCT를 사용하여 효모 exosome 복합 3D 재건을 얻는 우리의 연습을 설명합니다. 이것은 전자 현미경 및 이미지 프로세싱 우리의 프로토콜 RCT의 기본 원칙을 다음 있지만 방법을 수행할 수있는 유일한 방법은 아니라는 것을 주목하여야한다. 우리가 먼저 지속적인 얇은 탄소 필름 층으로 덮여 홀리 탄소 격자를 사용하여 단백질의 크기에 비해 두께 Uranyl - 편대의 계층에 단백질 샘플을 포함하는 방법에 대해 설명합니다. 그러면 표본을 수집 전송 전자 현미경에 삽입 untilted (0 급) 및 처리와 효모 exosome의 초기 3D 모델을 얻기 위해 나중에 사용됩니다 micrographs의 기울어진 (55 급) 쌍. 이를 위해, 우리는 RCT을 수행하고 다음 상세 검색 방법 3 일치 투영을 사용하여 초기 3D 모델을 수정하십시오.

이 문서는 부정적인 얼룩의 전자 현미경을 (EM)을 사용하여 생물 학적 macromolecules의 3 차원 (3D) 재건을하는 표준 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 임의의 원뿔 기울기 재건 방법 (RCT)을 사용하여 중간 해상도 Saccharomyces cerevisiae의 exosome의 복합의 3D 구조를 얻는 방법을 설명합니다.

랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

단일 입자 전자 현미경(EM) 재구성은 최근 거대 분자의 3차원(3D) 구조를 얻기 위한 대중적인 도구가 되었습니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 무작위 원뿔형 틸트(random conical tilt) 방법을 사용하여 엑소좀 복합체의 3차원 구조를 얻는 것입니다. 이는 먼저 홀 카본 그리드(holy carbon grid) 위에 얇은 탄소 필름 층을 증착하여 단백질 복합체를 위한 지지 기판을 만들고, 두 번째 단계로 염색을 진행함으로써 달성됩니다. 시료와 염색액을 그리드에 도포하면 시료가 중금속 염에 둘러싸이게 됩니다.그 후 전자 현미경 관찰을 통해 시료의 틸트 쌍 마이크로그래프(tilt pairs of micrographs)를 얻습니다. 마지막으로, 랜덤 원추형 틸트 방법(random conical tilt method)을 이용한 이미지 분석을 기반으로 엑소좀 복합체의 3차원 구조를 보여주는 결과를 도출합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 랜덤 원추형 틸트 방법을 위한 시료의 적절한 준비와 이후 이어지는 이미지 처리 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.시료 평가에 대한 예시 없이는 등급 판정 및 시료 준비 단계를 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시연이 매우 중요합니다. 랜덤 원추형 기울기법(random conical tilt method)의 원리는 전자 현미경 내에서 시료의 동일한 영역에 대해 한 쌍의 마이크로그래프를 촬영하는 것입니다. 하나는 시료를 기울이지 않은 상태에서 촬영하고, 다른 하나는 50에서 70도 사이의 각도로 기울인 상태에서 촬영합니다. 컴퓨터를 사용하여 디지털화된 마이크로그래프 쌍을 나란히 배치하고, 이 시연에서는 동일한 입자들의 이미지를 선택합니다.이 이미지들은 3차원 좌표의 숫자로 표시되어 있습니다. 기울이지 않은 입자의 이미지와 기울인 파트너 입자의 이미지는 기울기 축의 방향과 기울기 각도에 의해 서로 연관됩니다. 기울이지 않은 입자 이미지들을 정렬하면, 방위각 공간을 채우는 다수의 기울인 입자 이미지들을 사용하여 기울인 입자 이미지들을 해당 asMule 위치로 가져올 수 있으며, 역투영 알고리즘을 통해 분자의 3차원 구조를 재구성할 수 있습니다. 그리드를 제작하려면, 먼저 100 mL 유리 비커에 0.45 g의 폴리비닐포말 수지와 90 mL의 클로로포름을 첨가하여 0.5% form VAR 용액을 준비하십시오.흄 후드 내에서 비커를 알루미늄 호일로 덮고 form var 수지를 용해합니다. 작은 스터 바와 마그네틱 교반기를 사용하면 수지가 용해되는 데 약 15분이 소요됩니다. 그동

single-particle-electron-microscopy-reconstruction-exosome-complex

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Sectioning, Staining and TEM Imaging of embedded Exosomes: A Protocol to Visualize the Structural Features Using TEM (임베디드 엑소좀의 절편, 염색 및 TEM 이미징: TEM을 사용하여 엑소좀의 구조적 특징을 시각화하는 프로토콜)

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