Name: SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: 배우세요 SPHIRE 소프트웨어를 활용한 저온 전자현미경 단일 입자 이미지 처리 프로토콜입니다. 고해상도 단백질 구조 결정을 위한 반자동 분석 방법을 익혀 연구 효율성을 높이세요.

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우리는 TcdA1 현미경 사진을 제공 한 D. Roderer에게 감사드립니다. EMAN2 인프라를 지속적으로 지원해 준 Steve Ludtke에게 감사드립니다. 이 작업은 막스 플랑크 협회 (SR)와 유럽 연합 (EU)의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007-2013) (부여 번호 615984) (SR에)에 의거 한 유럽 기금과 국립 연구소 건강 R01 GM60635에서 PAP).

<ol><li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. -C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+structure+of+human+%CE%B3-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atomic structure of human γ-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li>
<li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li>
<li>von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li>
<li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li>
<li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPARX%2C+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+%C3%85+reconstruction+of+rotavirus+VP6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980(2015).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera%3FA+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrank%2C+J+%22Three-Dimensional+Electron+Microscopy+of+Macromolecular+Assemblies%22">Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies</a>. , Oxford University Press. (2006).</li>
<li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwarmPS%3A+rapid%2C+semi-automated+single+particle+selection+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%2FFolding+and+Design%22%5BJournal%5D)">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li>
<li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li>
<li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+focused+classification%2C+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis%2C+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+revolution+will+not+be+crystallized%3A+a+new+method+sweeps+through+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

단일 입자 Cryo-EM은 최근 몇 년 동안 급속한 발전을 보였으며 중요한 생물학적 중요성을 지닌 고분자 복합체의 수많은 원자 분해 구조를 전달했습니다 25 . 현재 필드에 들어가고있는 많은 초보 사용자를 지원하기 위해 단일 입자 이미지 분석 플랫폼 SPHIRE 를 개발했으며 영화 정렬, 입자 선택, CTF 추정, 초기 모델을 포함한 전체 워크 플로우에 대한 워크 플로우 프로토콜을 제시합니다 계산, 2D 및 3D 이질 분석, 고해상도 3D 세분화 및 로컬 해상도 추정 및 필터링. 여기에 설명 된 프로토콜은 관심 단백질의 cryo-EM 현미경 사진과 SPHIRE의 독립 실행 형 GUI가 제공하는 전산 도구를 사용하여 3D 구조 결정에 대한 간단한 안내서로 제공됩니다. 워크 플로의 주요 특징은의 절차는 재현성에 의한 검증 개념에 의존하고 매개 변수 조정을 필요로하지 않기 때문에 단 한 번만 실행해야합니다. 이 자동 검증 메커니즘은 다른 소프트웨어 패키지보다 SPHIRE의 주된 이점입니다. 왜냐하면 결과는 객관적이며 재현성이 있으며, 가장 중요한 것은 수용 가능한 계산 비용으로 얻을 수 있기 때문입니다. 이 파이프 라인은 숙련 된 사용자가 자신의 방법으로 더욱 독립적 인 검증 및 평가를 수행 할 수 있도록 풍부한 진단 정보를 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 구조 생물학 및 전자 현미경 검사에서 적어도 원소 이론적 배경을 가진 초보 사용자는 자체 데이터 및 자동화 된 검증 절차를 사용하여 근사 해상 구조를 얻을 수 있어야합니다. 그러나 원 자성 해상도 구조를 얻는 것이 항상 쉬운 것은 아니며 그 결과는 샘플 및 입력 데이터의 품질에 따라 크게 달라질 것입니다에이. 여기에 제시된 절차에서는 고품질의 정렬되지 않은 원시 EM 영화를 사용할 수 있으며 평균은 명확하게 식별 할 수있는 균질하고 무작위로 배향 된 단일 입자를 나타냅니다. 일반적으로 분자의 대칭성, 크기 또는 전반적인 형상에 대한 제한은 없지만, 저 분자량은 특히 단백질이 특징이없는 구형을 가졌을 때 제한 요인이 될 수 있습니다. 대개 높은 포인트 - 그룹 대칭을 갖는 더 크고 잘 정렬 된 입자의 분석은 덜 까다 롭습니다. 따라서, 초보자 사용자는 잘 특성화 된 Cryo-EM 데이터 세트를 사용하여 먼저이 프로토콜을 실행하는 것이 좋습니다. SPHIRE 자습서 데이터 (http : /sphire.mpg.de) 또는 원시 동영상이있는 EMPIAR 제출 데이터 세트 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) 중 하나가 좋은 출발점입니다 . 자체 데이터를 처리 할 때 일부 데이터 세트 또는 일부 이미지가 특정 품질을 충족시키지 못할 가능성이 매우 높습니다.기준. 이러한 맥락에서 워크 플로우의 주요 단계에 대해 프로그램이 수행하는 자동화 된 안정성 및 재현성 검사 외에도 사용자가 프로토콜의 특정 &quot;검사 점&quot;에서 결과를 시각적으로 검사하는 것이 좋습니다. 특히 최종 재구성 만족스럽지 않다. 첫 번째 육안 검사는 영화 정렬 ( 프로토콜 단계 2 ) 및 CTF 추정 ( 프로토콜 단계 3 ) 후에 현미경 수준에서 수행 할 수 있습니다. 결과로 얻은 동작 보정 된 평균은 분명히 식별 가능하고 잘 분리 된 단일 입자를 보여야하며, 그 파워 스펙트럼은 분명하게 식별 가능하고 등방성 인 Thon 링을 보여야합니다. 가시적 인 공간 주파수는 대부분의 경우 구조가 원칙적으로 궁극적으로 결정될 수있는 가장 높은 해상도를 정의합니다. 충분한 품질과 그 파워 스펙트럼의 모션 보정 된 평균의 예는 섹션 #SPHIRE의 Drift 및 CTF 평가 GUI 도구 (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php)를 사용하여 최종 결과에 부정적인 영향을 줄 수있는 이상치 이미지를 제거 할 수 있습니다. 입자 선별과 관련하여 SPHIRE 파이프 라인에서 중요한 단계는 ISAC ( 프로토콜 단계 5.2) 를 사용하는 2D 분류입니다. 여기서 사용자는 프로그램에 의해 자동으로 식별 된 재현 가능한 2D 클래스 평균이 각도 공간을 준 균일하게 커버하기에 충분한 방향 범위를 채택하도록 제어해야합니다. 클래스 평균의 품질이 만족스럽지 않은 경우 (시끄러운 및 / 또는 흐릿한 이미지) 및 / 또는 재현 가능한 클래스 평균 수가 매우 낮은 경우 자동 피킹 품질을 개선하고 데이터 세트 이미징 또는 샘플 준비를 최적화하십시오. 대부분의 경우 좋은 2D 클래스 평균을 산출하지 못하는 데이터 세트로부터 신뢰할 수있는 재구성을 계산할 수 없습니다. 고품질 2D 클래스 평균의 예분노는 &quot;대표 결과&quot;섹션에 나와 있습니다. 자동화 된 방식으로 RVIPER를 사용하여 신뢰할 수있는 초기 3D 모델을 얻으려면 최소 100 개의 클래스 평균이 필요합니다 ( 프로토콜 단계 6.1 ). 이 단계에서 사용자는 가장 높은 품질의 평균을 선택하고 가능한 한 많은 입자의 방향을 포함시켜야합니다. 초기 모델의 품질은 이후의 고해상도 3D 개선의 성공에 중요합니다. 다른 소프트웨어 패키지에서는 &quot;나쁜&quot;입자를 제거하기 위해 3D 분류가 수행되기도합니다 8 , 9 . 그러나 SPHIRE에서 이러한 입자의 대부분은 ISAC을 사용하는 2D 분류 중에 이미 자동으로 제거됩니다. 따라서 재구성 및 3D 변동성 분석이 데이터 집합의 이질성을 나타내는 경우에만 3D 정렬의 계산 집약적 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 가장 중요한 점은 사용자는 항상 조심스럽게 결과 3D 볼륨을주의 깊게 검사해야하며 ( 프로토콜 단계 9.3 ) 각 밀도의 기능이 공칭 해상도와 잘 일치하는지 확인해야합니다. &lt;9Å의 분해능에서 α- 나선에 해당하는 막대 모양의 밀도가 보입니다. &lt;4.5Å의 해상도에서 베타 시트의 가닥에 해당하는 밀도는 일반적으로 잘 분리되며 부피가 큰 아미노산이 보입니다. 고해상도 맵 (&lt;3Å)은 명확한 식별이 가능한 사이드 체인을 보여야하므로 정확한 원자 모델을 구축 할 수 있습니다. SPHIRE의 자동화 된 재현성 테스트와 최소한의 육안 검사 덕분에 현재의 프로토콜은 일반적으로 모든 유형의 단일 입자 cryo-EM 프로젝트에 적용 가능하다는 것을 입증 한 결과입니다. 각 처리 단계의 대표 결과는 다음과 같은 TcdA1 독소의 재구성을 위해 나타납니다.Photorhabdus luminescens 21 은 원자 분해능에 가까운 것으로 알려져있다. 비슷한 품질의 밀도 맵을 사용하여 신개념 또는 실제 공간의 정제뿐만 아니라 새로운 백본 추적을 통해 신뢰할 수있는 원자 모델을 구성 할 수 있으므로 복잡한 분자 메커니즘을 이해할 수있는 견고한 구조 프레임 워크를 제공합니다. 접근 코드 : EM 구조 및 처리되지 않은 영화에 대한 좌표는 전자 현미경 데이터 뱅크 및 전자 현미경 파일럿 이미지 아카이브에 각각 EMD-3645 및 EMPIAR-10089로 기탁되었습니다.

직접 전자 검출기 기술의 개발 후, 단일 입자 Cryo-EM의 현저한 진보는 현재 구조 생물학을 변형시키고 있습니다 1 . X 선 결정학에 비해이 기술은 결정질을 필요로하지 않고 단백질 물질을 소량 만 필요로하는 동시에 샘플의 순도에 대한 제한이 거의 없으며 근원 분해능에서 구조를 결정할 수 있습니다. 중요하게, 다른 조성 또는 상태를 이제 계산으로 분리 할 수 ​​있고, 다른 형태의 구조 결정을 전례없는 수준에서 수행 할 수있다. 최근에 도전 분자의 밀도지도는 de novo 모델 구축을 가능하게하여 해상도에 따라 생성 될 수 있으므로 동작 모드 2 , 3 , 4 , 5 에 대한 깊은 이해가 가능합니다. 3DEM (3D Electron Microscopy) 커뮤니티 (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy)에서 다양한 이미지 처리 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있으며 대부분 개발 중입니다. EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 및 SPARX 11을 비롯한 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 다양한 분자량 및 대칭성을 나타내는 단백질에 대한 근원 분해능이 달성되었습니다. 각 패키지는 다른 수준의 사용자 전문 지식을 필요로하며 사용자 지침, 자동화 및 확장 성의 다른 수준을 제공합니다. 또한, 일부 프로그램은 이미지 분석의 모든 단계를 용이하게하기위한 완벽한 환경을 제공하지만 다른 프로그램은 알려진 작업에서 시작하는 정렬 매개 변수의 세분화와 같은 특정 작업을 최적화하도록 설계되었습니다추론 구조. 보다 최근에는 APPION 12 및 SCIPION 13 을 포함하여 위에 나열된 여러 소프트웨어 패키지의 접근 방식과 프로토콜을 통합하는 단일 처리 파이프 라인을 제공하는 여러 플랫폼이 개발되었습니다. Cryo-EM의 현재 개발에 기여하기 위해 SPARX는 SPHIRE (고해상도 전자 현미경 검사용 SPARX)라고하는 단일 입자 분석을위한 새로운 독립형 및 완벽한 플랫폼으로 재 개발되었습니다. 현장의 새로운 연구자를위한 기술의 접근성을 높이고 현대의 완전 자동화 된 고급 전자 현미경으로 대량 생산 된 데이터에 대처하기 위해 처리 파이프 라인을 사용하기 쉽도록 다시 디자인하고 단순화했습니다 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 및 워크 플로우의 주요 단계 자동화. 더욱이, 새로운 알고리즘이 추가되어 신속하고 재현성 있고 자동화 된 구조 결정을 cr요 - EM 이미지. 또한 정제 및 이질성 분석 과정에서 발생하는 공통적 인 인공물을 피하기 위해 재현성에 의한 검증이 도입되었습니다. 이 프로그램은 광범위하게 수정되었지만 직접적인 오픈 소스 코드, 현대적인 객체 지향 디자인 및 모든 기본 기능을위한 Python 인터페이스와 같은 핵심 기능이 유지되었습니다. 따라서 블랙 박스 프로그램으로 변경되지 않아 사용자가 Python 코드를 연구하고 쉽게 수정할 수 있고, 추가 응용 프로그램을 만들거나 전체 워크 플로우를 수정할 수 있습니다. 이것은 비표준 Cryo-EM 프로젝트에 특히 유용합니다. 여기서는 SPHIRE의 GUI를 사용하여 cryo-EM 이미지에서 근사 해상 밀도 맵을 얻기위한 프로토콜을 제시합니다. 그것은 원시 Cryo-EM 직접 탐지기 영화에서 밀도 맵을 생성하는 데 필요한 모든 단계를 상세히 설명하며 특정 거대 분자 유형에만 국한되지 않습니다. 이 프로토콜은 주로 newc워크 플로우를 통해 현장에서의 정보를 제공하고 처리의 중요한 단계는 물론 함정과 장애물에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 더 많은 고급 기능과 SPHIRE의 이론적 배경은 다른 곳에서 설명 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>SPHIRE</td><td>Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund; 및 Houston Medical School, Houston, Texas&nbsp;</td><td></td><td>http://sphire.mpg.de</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>University of California, San Francisco</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ Unblur</td><td>Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td></tr><tr><td>Coot</td><td>MRC Laboratory of Molecular Biology,&nbsp; Cambridge</td><td></td><td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>EMAN2</td><td>Baylor College of Medicine, Houston</td><td></td><td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td></tr><tr><td>컴퓨팅 클러스터, 1824개의 코어가 있는</td><td>Max Planck Institute of Molecular Physiology</td><td></td><td>Linux 클러스터, 각각 2개의 프로세서가 있는 76&nbsp; 노드 Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz 및 128 Gb</td></tr><tr><td>RAM TITAN KRIOS 전자 현미경;</td><td>FEI</td><td></td><td>300 kV, Cs 보정, XFEG</td></tr><tr><td>Falcon II 직접 전자 검출기</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU (자동 데이터 수집 소프트웨어)</td><td>FEI</td><td></td><td>https://www.fei.com/software/epu/</td></tr></tbody></table>

sphire를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (고해상도 전자 현미경 용 스파크)는 단일 입자 전자 극저온 현미경 (cryo-EM) 데이터의 반자동 처리를위한 새로운 오픈 소스, 사용자 친화적 인 소프트웨어 모음입니다. 여기에 제시된 프로토콜은 단일 입자 구조 결정 파이프 라인의 모든 단계를 안내하여 Cryo-EM 현미경 사진 영화에서 시작하는 원자 가까이의 해상도 구조를 얻는 방법을 자세히 설명합니다. 이 단계는 새로운 SPHIRE 그래픽 사용자 인터페이스에서 제어되며 사용자 개입을 최소화해야합니다. 이 프로토콜을 사용하여 Photorhabdus luminescens의 Tc 독소 복합체 인 3.5Å 구조의 TcdA1이 9500 개의 단일 입자에서만 추출되었습니다. 이 간소화 된 접근 방식은 원시 상태에서 정제 된 거대 분자 복합체의 무소음 및 비 편향 원자 모델을 얻기 위해 광범위한 처리 경험과 선험적 인 구조 정보없이 초보자를 도울 것입니다.

<html> 위에서 설명한 프로토콜은 Photorhabdus luminescens Tc 복합체 (TcdA1) 20 , 21 , 22 의 A 구성 요소의 112 개의 직접 검출기 영화에서 시작하여 실행되었습니다. 이 데이터 세트는 300 kV의 가속 전압에서 작동되는 고휘도 전계 방출 총 (XFEG)이있는 Cs 보정 전자 저온 현미경으로 기록되었습니다. 이미지는 표본 규모에서 1.14 Å의 픽셀 크기에서 60 e - / Å -2 의 총 선량으로 자동 획득되었습니다. 무비 프레임 정렬 후 ( 프로토콜 단계 2 ), 결과로 얻은 모션 보정 평균은 등방성 톤 링을 고해상도까지 확장합니다 ( 그림 2a ). 개개의 입자는 쉽게 보이고 잘 분리되어있었습니다 ( 그림 2b ). 그런 다음 입자를 e2boxer의 득점 도구를 사용하여 선택했습니다.lass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( 프로토콜 단계 4.1 ). 이 경우,보다 선별적인 옵션을 사용하여 적절한 임계 값이 설정되었습니다 ( 그림 2c ). 112 개의 디지털 현미경 사진은 9,652 개의 입자를 산출했다. 추출 된 이미지 ( 프로토콜 단계 4.2 )의 대부분은 잘 정의 된 입자를 포함하고 상자 크기는 권장 된 것처럼 입자 크기보다 1.5 배 정도 컸다 ( 그림 2d ). 다음으로 ISAC을 사용하여 2D 이질성 분석을 수행했습니다 ( 프로토콜 단계 5 ). 98 개의 클래스 평균을 산출했다 ( 그림 3a ). 이러한 2D 클래스 평균을 사용하여 중간 해상도 ( 그림 3b )에서 VIPER ( 프로토콜 단계 6 )를 사용하여 ab initio 모델을 계산했습니다. 이 모델은 3.9Å 해상도에서 이미 해결 된 TcdA1의 결정 구조와 우수한 일치를 보여준다 ( 그림 3c ). 이 ab initio 모델은 초기 온도로 사용되었다.<html> (MERIDIEN)을 사용하여 ~ 40,000 개의 비대칭 단위만으로 3.5Å (0.143 기준) 재구성 ( 프로토콜 단계 7 )을 달성했습니다 ( 그림 4 ). 이 근 원자 분해능 맵은 24 시간 내에 획득되었으며, 다중 코어의 이점을 취하는 워크 플로우 단계에서 최대 96 개의 CPU를 사용했습니다. 3 차원 가변성 분석 (프로토콜 단계 8)의 경우, 단계 8.3.3에서 그룹 당 2,000 개의 입자 이미지 만 사용되었으며 ( 즉 , 프로세스는 5 개의 초기 3D 그룹으로 시작 함) 8.3.4 단계에서 가장 작은 그룹 크기 인 200 개의 이미지가 적은 수의 입자 (~ 10,000). 이 분석은 주로 정제에 사용 된 His 태그를 포함하는 복합체의 N- 말단 부위에서 국부적 인 유연성을 나타냅니다 ( 그림 5a ). 실제로, 12 개의 N- 말단 잔기 및 His 태그는 이전에 공지 된 TcdA1의 결정 구조에서 분해되지 않았다이 가변 영역은 수용체 결합 영역과 BC 결합 영역에서 더 많은 가변성이 검출되었다 ( 그림 5a ). 구조의 만족스러운 해상력과 데이터 세트의 비교적 작은 크기로이 이질성은 허용 될 수있는 것으로 결정되었으므로 초점을 맞춘 3D 분류 23 은 수행되지 않았다. 마지막으로 최종 밀도지도의 로컬 해상도가 계산되었다 ( 프로토콜 단계 9.1, 그림 이 품질의 볼륨은 Coot 24 또는 다른 정제 도구 ( 그림 6 )를 사용하여 새 모델을 구축하는 데 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;그림 1 : SPHIRE를 사용한 이미지 처리. ( a ) SPHIRE 소프트웨어 패키지의 GUI. 워크 플로의 특정 단계는 GUI의 왼쪽에서 각각의 그림을 선택하여 활성화 할 수 있습니다 ( &quot;워크 플로우 단계&quot;). 워크 플로의이 단계와 관련된 명령 및 유틸리티는 GUI의 중앙 영역에 나타납니다. 명령 중 하나를 선택하면 각 매개 변수가 GUI의 오른쪽 영역에 표시됩니다. 고급 매개 변수는 일반적으로 미리 설정된 기본값을 수정하지 않아도됩니다. ( b ) SPHIRE GUI를 이용한 단일 입자 이미지 처리의 워크 플로우 단계. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> 그림 2 : 모션 보정 및 부분르 추출. ( a , b ) 일반적인 고품질, 저용량, 드리프트 교정 된 디지털 현미경 사진은 1.7 μm의 디 포커스에서 촬영되었습니다. 파워 스펙트럼 (a)에서 2.7 Å의 해상도까지 확장되는 등방성 톤 링과 2D 이미지에서 잘 식별 가능한 입자 ( b )에 주목하십시오. ( c ) e2boxer를 이용한 입자 선택. 녹색 원은 선택된 입자를 나타냅니다. ( d ) 선량 가중 현미경 사진에서 추출한 대표적인 미립자. 스케일 바 = 20 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> 그림 3 : 2D 클러스터링 및 초기 모델 생성. ( a ) 2D 등급 평균 갤러리, 대다수의 측면보기 o<html> 입자. 스케일 바 = 20 nm. ( b ) 기준 자유 클래스 평균으로부터 RVIPER를 사용하여 얻은 TcdA1의 Ab initio 3D지도. ( c ) TcdA1 결정 구조 (리본) (pdb-id 1VW1)의 초기 Cryo-EM 밀도 (투명 회색) 로의 리지드 바디 피팅. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> 그림 4 : TcdA1의 Cryo-EM 3D 구조. ( a , b ) ~ 9,500 입자 이미지를 사용하여 계산 된 TcdA1의 최종 3.5Å 밀도지도 : ( a ) 측면 및 ( b ) 평면도. ( c ) α 헬릭스와 β 시트에 대한 cryo-EM 밀도의 대표 영역.arge.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> 그림 5 : 가변성 분석 및 로컬 해상도. ( a ) 예리한 TcdA1 저온 EM지도의 표면 (회색)과 가변성지도 (녹색). 더 명확하게하기 위해 변동성 맵은 30 Å까지 로우 패스 필터링되었습니다. ( b ) TcdA1의 표면 렌더링은 국부적 해상도 (Å)에 따라 채색 된 날카로운 Cryo-EM 맵을 나타낸다. 높은 변동성과 낮은 지역 해상도 사이의 토폴로지 협약에 유의하십시오. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> 그림 6 : 3D 모드el Coot를 이용한 TcdA1의 건물. Cryo-EM 밀도 및 원자 모델의 대표적인 영역이 α 나선 구조로 표시됩니다. 원자 모델은 Coot를 사용하여 새로 만들었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

이 프로시저의 전반적인 목표는 이미지 프로세싱 소프트웨어인 SPHIRE를 사용하여 전자 저온 현미경 데이터의 단일 입자 분석을 통해 거대 분자 복합체의 구조를 결정하는 것입니다. 단일 입자 cryo-EM은 원자 수준에 가까운 해상도로 거대 분자 구조를 연구하기 위한 주류 기술이 되고 있습니다. SPHIRE는 cryo-EM 데이터를 사용자 친화적인 방식으로 반자동 처리할 수 있게 해주는 새로운 소프트웨어 패키지입니다.SPHIRE의 주요 장점은 자동 검증 메커니즘입니다. 대부분의 절차는 단 한 번만 실행하면 되며, 결과는 객관적이고 재현 가능합니다. 고해상도 cryo-EM을 사용하여 개별 잔기를 배치할 수 있으며, 이를 통해 복잡한 미세 분자 기계의 구조와 기능에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다.이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 고해상도 구조를 얻는 것이 샘플의 품질과 입력 데이터에 크게 좌우된다는 점을 유념해야 합니다. SPHIRE 애플리케이션을 사용하려면 터미널에서 GUI를 실행하십시오. UTILITIES를 열어 e2display로 저온 전자현미경 이미지를 표시합니다.내장된 측정 도구를 사용하여 픽셀당 옹스트롬(angstrom per pixel) 단위로 입자의 가장 긴 축을 측정하십시오. 프로젝트 설정(Project Settings)을 엽니다. CTF 윈도우 크기를 최소한 입자 박스 크기 이상으로 설정하십시오.입자 박스 크기를 입자 직경의 최소 1 1/2배인 짝수로 설정하십시오. 입자 반경을 측정된 길이의 최소 절반으로 설정하십시오. 점군 대칭(알고 있는 경우)과 대략적인 분자량을 입력하십시오.설정을 등록하십시오. 다음으로, MOVIE 메뉴에서 Micrograph movie alignment를 엽니다. unblur 및 summovie 실행 파일 경로를 설정하십시오.정렬되지 않은 원본 현미경 사진 동영상을 선택하고, 파일 이름 변수를 와일드카드로 대체하여 입력 현미경 사진 경로 패턴을 설정하십시오. 출력 디렉토리 이름을 지정하십시오. 동영상 프레임 수, 현미경 전압 및 프레임당 노출 시간을 입력하십시오.선량 가중치(dose-weighted) 및 선량 비가중치(dose-unweighted) 운동 보정 평균 마이크로그래프를 생성하는 프로세스를 실행하십시오. 다음으로 CTER 메뉴를 열고 CTF Estimation을 선택하십시오. 선량 비가중치 마이크로그래프를 입력값으로 설정하십시오.출력 디렉토리 이름을 지정하고 데이터 수집 파라미터를 입력하십시오. 최저 주파수를 0285 inverse angstroms로, 최고 주파수를 0.285 inverse angstroms로 설정하십시오. 프로세스를 실행하여 CTF 파라미터 목록을 생성하십시오.다음으로, WINDOW 메뉴를 열고 Particle Picking을 선택하십시오. dose-weighted 마이크로그래프를 입력값으로 설정하고, e2boxer 유틸리티를 실행하십시오. 수동 또는 자동으로 파티클 피킹을 수행하십시오.선택한 입자들을 이미지 스택으로 추출하고, 이 스택들을 BDB 데이터베이스 내의 단일 가상 이미지 스택으로 결합하십시오. 입자 선택 및 스택 작업이 완료되면 ISAC 메뉴를 열고 ISAC 2D Clustering을 선택하십시오. BDB 데이터베이스의 가상 이미지 스택을 입력값으로 설정하십시오.클래스당 이미지 수를 추정합니다. 나머지 파라미터를 입력하고 2D 클래스 평균을 생성합니다. 2D 분류가 완료되면 Display Data 유틸리티를 사용하여 검증된 재현 가능한 클래스 평균을 확인합니다.다양한 입자 방향이 표현되었는지 확인하고 클래스 평균의 품질이 만족스러운지 검증하십시오. 검증된 클래스 평균에 속하는 입자들만 포함하는 새로운 가상 이미지 스택을 생성하십시오. 다음으로, VIPER 메뉴를 열고 Display Data 유틸리티를 사용하여 클래스 평균을 확인하십시오.품질이 낮거나 입자의 동일한 뷰를 보여주는 클래스 평균값들을 삭제하십시오. 나머지 클래스 평균값들을 새 파일로 저장하십시오. 그 다음 Initial 3D Model RVIPER를 선택하고, 소수의 클래스 평균값 선택물을 입력값으로 사용하십시오.단백질의 초기 재현 가능한 3D 모델을 생성하기 위한 명령을 실행하십시오. 분자 그래픽 프로그램인 Chimera에서 모델을 검토하십시오. 해당 모델을 관심 단백질의 상동 단백질 또는 도메인의 알려진 구조와 비교하십시오.SPHIRE의 VIPER 메뉴로 돌아가서 Create 3D Reference를 선택하십시오. 정확한 픽셀 크기와 3D 마스크를 사용하여 초기 3D 참조 모델을 생성하십시오. MERIDIEN 메뉴를 열고 3D Refinement를 선택하십시오.입력 이미지 스택과 초기 3D 참조 파일 경로를 입력하십시오. 출력 디렉터리 이름을 지정하고, 참조 모델의 마스크를 3D 마스크로 설정하십시오. 'Apply hard 2D mask'를 선택하십시오.시작 해상도를 20에서 25 angstroms 사이로 설정하고, 3D 정밀화를 실행하여 필터링되지 않은 하프 볼륨(half-volumes)을 생성합니다. 그 다음, Chimera에서 필터링되지 않은 하프 볼륨을 확인합니다. 모든 단백질 밀도는 연결되되 노이즈 아티팩트는 연결되지 않는 이진화 임계값을 결정합니다.SPHIRE의 MERIDIEN 메뉴로 돌아가서 Adaptive 3D Mask를 엽니다. 필터링되지 않은 half-volume 입력값과 이진화 임계값(binarization threshold)을 입력합니다. 출력 마스크의 이름을 지정하고 프로세스를 실행하여 경계가 부드러운 3D 마스크를 생성합니다.그 다음, Sharpening을 열고 필터링 되지 않은 두 반분할 볼륨(half-volumes)을 모두 선택하십시오. 소프트 엣지 반분할 볼륨 3D 마스크를 사용자 제공 마스크로 설정하십시오. 반분할 볼륨들을 병합한 후, 병합된 볼륨을 필터링하고 샤프닝하는 프로세스를 실행하십시오.로그 파일을 열어 최종 해상도 추정치를 확인하십시오. 3D 정밀화(refinement) 과정에서 생성된 입력 이미지 스택의 입자 각도 분포 3D 맵을 생성하십시오. 샤프닝 및 필터링 처리된 3D 모델을 Chimera에서 여십시오.밀도 맵과 고해상도 특징을 검사하십시오. Chimera에서 각도 분포를 열고, 오일러 각(Euler angles)이 등방성으로 분포되어 있는지 확인하십시오. SORT3D 메뉴를 열고, 3D 변동성 추정(3D Variability Estimation)을 선택하십시오.검증된 클래스 평균에 속하는 입자 이미지의 가상 스택으로부터 3D 변동성 맵을 생성합니다. 이후의 집중 3D 클러스터링을 위해 이 변동성 맵으로부터 이진화된 3D 마스크를 생성합니다. 그런 다음 3D Clustering RSORT3D를 실행하고, 이전 3D 정밀화(refinement)의 디렉토리를 입력값으로 선택합니다.출력 디렉토리의 이름을 지정하고, 글로벌 및 포커스 3D 마스크를 설정하십시오. 대규모 데이터 세트의 경우 그룹당 최소 5,000~10,000장의 이미지를 사용하십시오. 정렬 프로세스를 실행하여 각 균질한 3D 그룹의 볼륨을 생성하십시오.Chimera를 사용하여 겉보기 분해능이 가장 높은 구조를 식별하십시오. SPHIRE의 SORT3D 메뉴로 돌아가 Local Subset Refinement를 엽니다. subset 텍스트 파일 경로를 가장 높은 분해능 구조에 해당하는 파티클 ID 클러스터 파일로 설정하십시오.3D 정밀화 디렉토리를 필터링되지 않은 하프 볼륨이 포함된 디렉토리로 설정하고, 재시작 반복 횟수를 이전 3D 정밀화의 최고 해상도 반복 횟수로 설정하십시오. 로컬 필터링되지 않은 하프 볼륨을 생성하는 명령어를 실행하십시오. 그런 다음, 로컬 하프 볼륨 중 하나를 사용하여 소프트 엣지 3D 마스크를 생성하십시오.로컬 하프 볼륨들을 병합하고, 로우 패스 필터를 적용하지 않은 상태에서 병합된 볼륨을 샤프닝합니다. 다음으로, LOCALRES 메뉴를 열고 Local Resolution을 클릭합니다. 로컬 하프 볼륨들을 선택하십시오.그런 다음, 로컬 소프트 엣지 마스크(local soft-edged mask)를 선택합니다. 전체 해상도를 병합된 로컬 볼륨을 샤프닝할 때 추정된 절대 해상도로 설정합니다. 볼륨의 로컬 해상도를 계산합니다.다음으로 3D Local Filter를 엽니다. sharpened unfiltered local volume을 입력값으로 설정하십시오. local resolution map과 soft-edged 3D mask를 선택합니다.최종 3D 모델을 생성하기 위해 샤프닝된 볼륨에 국소 해상도 필터를 적용하십시오. 생성된 볼륨과 국소 해상도 맵을 Chimera에서 엽니다. Surface Color 도구를 실행하고, 메뉴에서 해당 볼륨을 선택한 후 표면을 국소 해상도에 따라 채색하는 옵션을 선택하십시오.독소 복합체 TcdA1을 저온 전자현미경(cryo-microscopy)으로 촬영하였습니다. 모든 이미지에서 개별 입자가 명확하게 식별되었으며, 파워 스펙트럼의 Thon rings는 4 Å 미만의 분해능까지 나타났습니다. e2boxer를 사용하여 입자를 선택한 후 이미지 스택으로 추출하였습니다.반복적 안정 정렬 및 클러스터링(iterative stable alignment and clustering, ISAC)을 통해 2차원 클래스 평균을 생성하였습니다. 이 클래스 평균은 RVIPER를 사용하여 재현 가능한 3D 모델을 계산하는 데 사용되었습니다. 이 모델은 이전에 규명된 TcdA1의 결정 구조와 잘 일치하였습니다.MERIDIEN을 이용한 이 모델의 자동 3D 정밀화를 통해 원자 수준에 가까운 해상도의 맵을 생성했습니다. 3D 변동성 분석 결과, 히스티딘 태그가 붙은 N-말단 영역, 수용체 결합 도메인 및 TcB 결합 도메인의 국소적 유연성이 확인되었습니다. 국소 해상도 계산을 수행했습니다.정밀화된 모델을 국소적으로 필터링하고 국소 해상도에 해당하는 색상 척도를 적용한 결과, 변동성이 높은 영역과 해상도가 낮은 영역 사이의 위상적 일치함이 나타났습니다. TcdA1의 최종 3.5-angstrom 해상도 cryo-EM 구조에서는 대부분의 곁사슬에 대한 명확한 밀도가 관찰되었습니다. 이 정도 수준의 세부 정보를 가진 밀도 맵은 de novo 원자 모델 구축에 추가로 활용될 수 있습니다.이러한 접근 방식을 사용하면 사전 구조 정보 없이도 몇 시간 또는 며칠 내에 원자 수준에 근접한 해상도의 구조를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 고품질 데이터만을 사용하고 중간 결과를 확인하십시오. cryo-EM 시료의 구성 및 구조적 불균질성은 원자 수준의 해상도에 도달하는 데 제한 요인이 될 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후, 여러분은 cryo-EM 구조 결정을 위해 SPHIRE를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 보신 바와 같이, SPHIRE에 포함된 클러스터링 루틴을 통해 관심 단백질의 구조를 규명할 수 있을 뿐만 아니라, 구조적 동역학을 연구하고 복잡한 분자 메커니즘에 대한 핵심적인 기전적 통찰을 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

극저온 전자 현미경 검사법의 단일 입자 분석은 고해상도에서 생물학적 앙상블의 구조를 결정하는 데 사용되는 주요 기술 중 하나입니다. Scipion은 현미경에 의해 획득된 정보를 처리하고 생물학적 표본의 3D 재구성을 달성하기 위해 전체 파이프라인을 만드는 도구를 제공합니다.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

극저온 전자 현미경(cryoEM) 그리드에 지지층을 적용하면 입자 밀도를 높이고, 공기-물 계면과의 상호 작용을 제한하고, 빔 유도 동작을 줄이고, 입자 배향 분포를 개선할 수 있습니다. 이 백서에서는 cryoEM 그리드를 그래핀 단층으로 코팅하여 cryo-sample 전처리를 개선하기 위한 강력한 프로토콜에 대해 설명합니다.

고분해능 구조 측정을 위해 Monolayer Graphene을 Cryo-Electron Microscopy Grid에 적용

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Enhancing Density Maps by removing the majority of particles in single particle cryyogenic electron microscopy final stacks(단일 입자 극저온 전자 현미경 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 향상)

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