SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

이 절차의 전반적인 목표는 이미지 처리 소프트웨어 SPHIRE를 사용하여 전자 극저온 현미경 데이터의 단일 입자 분석을 통해 거대분자 복합체의 구조를 결정하는 것입니다. 단일 입자 Cryo-EM은 원자에 가까운 분해능에서 거대분자 구조를 연구하기 위한 주류 기술로 자리잡고 있습니다. SPHIRE는 사용자 친화적인 방식으로 Cryo-EM 데이터를 반자동으로 처리할 수 있는 새로운 소프트웨어 패키지입니다.

SPHIR의 주요 장점은 자동 검증 메커니즘입니다. 대부분의 절차는 한 번만 실행하면 되며 결과는 객관적이고 재현 가능합니다. 고분해능 Cryo-EM은 개별 잔류물을 배치하는 데 사용할 수 있으므로 복잡한 미세분자 기계의 조직과 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 방법을 처음 사용하는 사용자는 고해상도 구조를 얻는 것이 샘플의 품질과 입력 데이터에 크게 좌우된다는 점을 명심해야 합니다. SPHIRE 애플리케이션 사용을 시작하려면 터미널에서 GUI를 엽니다. UTILITIES를 열어 e2display로 초저온 현미경 이미지를 표시합니다.

내장된 측정 도구를 사용하여 픽셀당 옹스트롬 단위의 가장 긴 입자 축을 측정합니다. 프로젝트 설정을 엽니다. CTF 창 크기를 입자 상자 크기 이상으로 설정합니다.

입자 상자 크기를 입자 직경의 최소 1 1/2배 이상인 짝수로 설정합니다. 입자 반경을 측정된 길이의 절반 이상으로 설정합니다. 점-그룹 대칭(알려진 경우)과 대략적인 분자 질량을 입력합니다.

설정을 등록합니다. 그런 다음 MOVIE 메뉴에서 Micrograph 동영상 정렬을 엽니다. unblur 및 summovie 실행 파일 경로를 설정합니다.

정렬되지 않은 원시 마이크로그래프 동영상을 선택하고 파일 이름 변수를 와일드카드로 바꿔 입력 마이크로그래프 경로 패턴을 설정합니다. 출력 디렉토리의 이름을 지정합니다. 동영상 프레임의 수, 현미경 전압, 프레임당 노출을 입력합니다.

프로세스를 실행하여 용량 가중 및 용량 가중치가 적용되지 않은 모션 보정 평균 현미경 사진을 생성합니다. 그런 다음 CTER 메뉴를 열고 CTF 추정을 선택합니다. 용량에 가중치가 부여되지 않은 현미경 사진을 입력으로 설정합니다.

출력 디렉터리의 이름을 지정하고 데이터 수집 매개 변수를 입력합니다. 가장 낮은 주파수를 0285 역 옹스트롬으로 설정하고 가장 높은 주파수를 0.285 역 옹스트롬으로 설정합니다. 프로세스를 실행하여 CTF 매개 변수 목록을 생성합니다.

그런 다음 WINDOW 메뉴를 열고 Particle Picking을 선택합니다. 선량 가중 현미경 그래프를 입력으로 설정하고 e2boxer 유틸리티를 시작합니다. 입자 피킹을 수동 또는 자동으로 수행할 수 있습니다.

선택한 입자를 이미지 스택으로 추출하고 스택을 BDB 데이터베이스의 단일 가상 이미지 스택으로 결합합니다. 파티클을 선택하고 쌓았으면 ISAC 메뉴를 열고 ISAC 2D 클러스터링을 선택합니다. BDB 데이터베이스의 가상 이미지 스택을 입력으로 설정합니다.

클래스당 이미지 수를 추정합니다.나머지 파라미터를 채우고 2D 클래스 평균을 생성합니다. 2D 분류가 완료되면 데이터 표시 유틸리티를 사용하여 검증된 재현 가능한 클래스 평균을 확인합니다.

여러 입자 방향이 표시되고 클래스 평균의 품질이 만족스러운지 확인합니다. 검증된 클래스 평균에 속하는 입자만 포함하는 새 가상 이미지 스택을 생성합니다. 그런 다음 VIPER 메뉴를 열고 데이터 표시 유틸리티를 사용하여 클래스 평균을 봅니다.

품질이 좋지 않거나 입자의 동일한 뷰를 표시하는 클래스 평균을 삭제합니다. 나머지 클래스 평균을 새 파일에 저장합니다. 그런 다음 초기 3D 모델 RVIPER를 선택하고 클래스 평균의 작은 선택을 입력으로 사용합니다.

명령을 실행하여 단백질의 초기 재현 가능한 3D 모델을 생성합니다. 분자 그래픽 프로그램인 Chimera에서 모델을 검사합니다. 모델을 관심 단백질의 상동 단백질 또는 도메인의 알려진 구조와 비교합니다.

SPHIRE의 VIPER 메뉴로 돌아가서 3D 참조 생성을 선택합니다. 올바른 픽셀 크기와 3D 마스크를 사용하여 초기 3D 참조 모델을 생성합니다. 메르디앙(MERIDIEN) 메뉴를 열고 3D 미세 조정(3D Refinement)을 선택합니다.

입력 이미지 스택과 초기 3D 참조 파일 경로를 입력합니다. 출력 디렉토리의 이름을 지정하고 참조 모델의 마스크를 3D 마스크로 설정합니다. 하드 2D 마스크 적용을 선택합니다.

시작 해상도를 20에서 25 옹스트롬 사이로 설정하고 3D 미세 조정을 실행하여 필터링되지 않은 절반 볼륨을 생성합니다. 그런 다음 키메라에서 필터링되지 않은 절반 볼륨으로 봅니다. 모든 단백질 밀도는 연결되어 있지만 노이즈 아티팩트는 연결되어 있지 않은 이진화 임계값을 결정합니다.

SPHIRE의 MERIDIEN 메뉴로 돌아가서 적응형 3D 마스크를 엽니다. 필터링되지 않은 절반 볼륨 입력값과 이진화 임계값을 입력합니다. 출력 마스크의 이름을 지정하고 프로세스를 실행하여 가장자리가 부드러운 3D 마스크를 생성합니다.

그런 다음 샤프닝을 열고 필터링되지 않은 절반 볼륨을 모두 선택합니다. 소프트 가장자리 절반 볼륨 3D 마스크를 사용자 제공 마스크로 설정합니다. 절반 볼륨을 병합한 다음 병합된 볼륨을 필터링하고 선명하게 하는 프로세스를 실행합니다.

로그 파일을 열어 최종 해상도 추정치를 확인합니다. 3D 미세 조정 중에 생성된 입력 이미지 스택의 입자 각도 분포에 대한 3D 맵을 생성합니다. Chimera에서 선명하고 필터링된 3D 모델을 엽니다.

밀도 맵과 고해상도 기능을 검사합니다. Chimera에서 각도 분포를 열고 오일러 각도가 등방성으로 분포되어 있는지 확인합니다. SORT3D 메뉴를 열고 3D 변동성 추정을 선택합니다.

검증된 클래스 평균에 속하는 입자 이미지의 가상 스택에서 3D 가변성 맵을 생성합니다. 후속 집중된 3D 클러스터링을 위해 이 가변성 맵에서 이진화된 3D 마스크를 생성합니다. 그런 다음 3D 클러스터링 RSORT3D 열고 이전 3D 미세 조정의 디렉토리를 입력으로 선택합니다.

출력 디렉토리의 이름을 지정하고 전역 및 초점이 맞춰진 3D 마스크를 설정합니다. 대규모 데이터 세트의 경우 그룹당 최소 5, 000에서 10, 000개의 이미지를 사용합니다. 정렬 프로세스를 실행하여 각 동종 3D 그룹의 체적을 생성합니다.

Chimera를 사용하여 겉보기 해상도가 가장 높은 구조를 식별합니다. SPHIRE의 SORT3D 메뉴로 돌아가서 로컬 하위 세트 미세 조정을 엽니다. 하위 집합 텍스트 파일 경로를 가장 높은 해상도 구조에 해당하는 입자 ID 클러스터 파일로 설정합니다.

3D 미세 조정 디렉토리를 필터링되지 않은 절반 볼륨이 포함된 디렉토리로 설정하고 다시 시작 반복을 이전 3D 미세 조정에서 가장 높은 해상도 반복으로 설정합니다. 명령을 실행하여 필터링되지 않은 로컬 절반 볼륨을 생성합니다. 그런 다음 로컬 절반 볼륨 중 하나에서 가장자리가 부드러운 3D 마스크를 만듭니다.

로컬 절반 볼륨을 병합하고 저역 통과 필터를 적용하지 않고 병합된 볼륨을 선명하게 합니다. 그런 다음 LOCALRES 메뉴를 열고 Local Resolution을 클릭합니다. 로컬 절반 볼륨을 선택합니다.

그런 다음 가장자리가 부드러운 로컬 마스크를 선택합니다. 전체 해상도를 병합된 로컬 볼륨을 선명하게 할 때 추정된 절대 해상도로 설정합니다. 볼륨의 로컬 해상도를 계산합니다.

그런 다음 3D 로컬 필터를 엽니다. 선명하게 된 필터링되지 않은 로컬 볼륨을 입력으로 설정합니다. 로컬 해상도 맵과 가장자리가 부드러운 3D 마스크를 선택합니다.

뾰족한 볼륨에 로컬 해상도 필터를 적용하여 최종 3D 모델을 생성합니다. 결과 볼륨 및 로컬 해상도 맵을 Chimera에서 엽니다. Surface Color 도구를 시작하고 메뉴에서 볼륨을 선택하고 로컬 해상도에 따라 표면을 색칠하는 옵션을 선택합니다.

독소 복합체 TcdA1은 초저온 현미경으로 이미지화되었습니다. 모든 이미지는 명확하게 식별할 수 있는 단일 입자와 톤 고리가 파워 스펙트럼에서 4옹스트롬 이상의 해상도로 확장되는 것을 보여주었습니다. 입자는 e2boxer를 사용하여 선택한 다음 이미지 스택으로 추출되었습니다.

2차원 클래스 평균은 ISAC(Iterative Stable Alignment and Clustering)에 의해 생성되었습니다. 이러한 클래스 평균은 RVIPER로 재현 가능한 3D 모델을 계산하는 데 사용되었습니다. 이 모델은 이전에 해결된 TcdA1의 결정 구조와 잘 일치했습니다.

MERIDIEN을 사용하여 이 모델을 자동으로 3D 미세 조정한 결과, 거의 원자 분해능 map. 3D 변동성 분석을 통해 히스티딘 태그가 지정된 N 말단 영역, 수용체 결합 도메인 및 TcB 결합 도메인의 국부적인 유연성을 나타낼 수 있었습니다. 로컬 해상도 계산이 수행되었습니다.

선명하게 된 모델은 국부적으로 필터링되고 국부 해상도에 해당하는 색상 스케일이 적용되어 변동성이 높은 영역과 해상도가 낮은 영역 간의 토폴로지 일치를 보여주었습니다. TcdA1의 최종 3.5옹스트롬 해상도 Cryo-EM 구조는 대부분의 측쇄에서 명확한 밀도를 보여주었습니다. 이 세부 수준을 가진 밀도 맵은 de novo 원자 모델 구축에 추가로 사용할 수 있습니다.

이 접근 방식을 사용하면 선험적 구조 정보 없이 몇 시간 또는 며칠 내에 거의 원자 분해능 구조를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 고품질 데이터만 사용하고 중간 결과를 확인하십시오. Cryo-EM 샘플의 조성 및 구조적 이질성은 원자에 가까운 분해능에 도달하는 데 제한 요인이 될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이제 cryo-EM 구조 측정에 SPHIR을 사용하는 방법을 잘 이해했을 것입니다. 보시다시피 SPHIR에 포함된 클러스터링 루틴을 사용하면 관심 단백질의 구조를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 구조적 역학을 연구하고 복잡한 분자 메커니즘에 대한 중요한 기계론적 통찰력을 제공할