성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 복잡한 장비나 기술 없이 쥐 간 세포의 혼합 1차 배양물로부터 여러 대식세포 배양을 얻는 것입니다. 이것은 먼저 콜라겐분해효소 관류에 의한 성체 쥐 간 세포의 해리를 통해 달성된 다음 실질 간세포 세포 분획을 분리하여 이루어집니다. 다음으로, 세포를 성장 배지가 있는 조직 배양 플라스크인 T 75에서 배양하여 간 세포의 혼합된 1차 배양을 확립합니다.

그런 다음 10-12일 배양 후 배양 플라스크를 흔들어 대식세포를 플라스틱 접시로 쉽게 옮긴 다음 짧은 배양 기간 후에 선택적 접착으로 수확합니다. 마지막으로, 6개 세포 중 10개 이상을 동일한 T 75 조직 배양 플라스크에서 2주 이상 2일 또는 3일 간격으로 반복적으로 수확할 수 있습니다. 간 대식세포에 대한 분리 방법은 잘 설명되어 있습니다.

그러나 대부분의 이전 방법은 원심 일러스트레이터와 같은 정교한 장비와 정교한 기술이 필요했습니다. 여기에서는 특별한 장비나 고급 실험실 기술이 필요하지 않은 성체 포장 간 세포의 혼합 1차 배양물에서 충분한 수와 순도의 간 대식세포를 얻을 수 있는 간단하고 새로운 방법을 제시합니다. 동물 해부, 간 관류 및 세포 준비는 국립 동물 보건 연구소(National Institute of Animal Health)의 Norco, Yamanaka 및 Miko yoshioka 박사에 의해 시연될 것입니다.

그런 다음 문화적 위험으로부터 간 대식세포를 분리하고 정화하는 방법을 National Institute of Agro Biological Sciences의 Dr.Taketo Takeno에 의해 보여줄 것입니다. 시작하겠습니다. 쥐 간이 풍부하게 생성될 수 있도록 준비하려면 세척액 한 병과 콜라겐 분해 효소 용액 한 병을 예열하는 것으로 시작하십시오.

그런 다음 피부 꼬집기로 진정을 확인한 후 마취된 성인 수컷 쥐를 스테인리스 스틸 팬에 넣고 복부와 흉부에 70% 에탄올을 분사합니다. 그런 다음 절개 가위로 복부 중앙을 작게 절개하고 피부를 벗겨냅니다. 그런 다음 가위로 복부를 열고 문맥의 위치를 확인합니다.

그런 다음 문맥 아래에 수술 실을 통과시키고 실을 느슨하게 조입니다. 그런 다음 하반핵과 장간막 정맥의 원위부를 모기 클램프로 고정하여 혈액이 간으로 역류하는 것을 방지합니다. 횡격막을 가위로 절개하여 흉강을 열고 안과 가위로 문맥을 작게 절개 한 후 심장을 노출시키고 2mm 플라스틱 카테터를 정맥에 삽입하고 카테터 주위의 실을 단단히 조입니다.

예열 세척 용액으로 관류 시스템을 로드한 다음 카테터에 연결합니다. C 2에서 분당 10밀리리터의 속도로 관류를 시작합니다. 동시에 해부 가위로 오른쪽 심방 벽을 자릅니다.

10분 동안 풍성한 양을 계속한 다음 풍량 용액을 콜라겐분해효소 용액으로 전환하고 10-20분 동안 관류합니다. 분당 10ml의 속도로 멸균 비커에 25ml의 콜라겐분해효소 용액을 채웁니다. 그런 다음 관류 간을 제거하고 조심스럽게 비커에 넣습니다.

가위로 간을 작은 조각으로 다집니다. 생성된 세포 현탁액에 75ml의 저온 MEM을 추가합니다. 부드러운 피펫팅 후 100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 여과합니다.

소화되지 않은 조직 조각에서 결합 조직을 제거하려면 여과액을 50ml 원추형 튜브에 모으십시오. 여과액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 먼저 섭씨 4도에서 1분 동안 50Gs로 세포를 회전시켜 세포를 4번 세척합니다. 분리된 상태에서 상등액을 조심스럽게 폐기한 다음 펠릿을 차가운 MEM에 다시 현탁시키고 마지막 세척 후 세포를 다시 스핀다운합니다.

성장 배지에서 간 세포를 재현탁시킵니다. 이제 5-10 T 75 조직 배양 플라스크에 6.7 곱하기 10에서 평방 센티미터 당 네 번째 세포의 밀도로 세포를 파종합니다. 배양 플라스크를 인큐베이터에 넣고 2-3일마다 성장 배지를 교체합니다.

배양 하루 후, 실질 간세포(parenchymal hepatocytes)가 플라스크 표면에 퍼져 1개 또는 2개의 둥근 핵이 있는 전형적인 다각형 코팔 돌 같은 형태를 보여줍니다. 배양 후 며칠 이내에 실질 간세포는 상피 세포 형태를 잃고 더 편평한 섬유아세포 세포로 변형됩니다 6일째 경, 위상차, 밝은 둥근 대식세포와 같은 세포가 섬유아세포 시트에서 증식하기 시작합니다. 세포와 같은 대식세포의 성장은 12일경에 최대 수준에 도달합니다.

대식세포와 같은 세포의 수는 섬유아세포 시트가 퇴화하기 시작하는 19일경에 감소합니다. 따라서 약 7일에서 10일의 배양이 끝나면 대식세포가 재현유탁된 후 30분 동안 배양 플라스크를 상호 흔들어 세포 시트에서 증식한 대식세포를 배양 배지에 현탁시킵니다. 100mm 비조직 배양 등급 플라스틱 접시를 두 개의 T 75 플라스크에서 추출한 매체로 각각 재생합니다.

배양 플라스크에 성장 배지를 다시 채우고 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양 기간 후 30 분 동안 플라스틱 접시를 배양하고, 배지를 흡인하여 접시를 세 번 씻고, 다른 오염 된 섬유 아세포 세포가 부유 된 상태에서 접시 표면에 부착 된 세포와 같은 대식 세포와 같은 세포를 도금 한 후 10 분 이내에 여기에서 볼 수 있듯이 플라스틱 접시를 PBS로 부드럽게 헹굽니다. PBS 헹굼 후 고도로 정제된 대식세포 집단을 얻습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이 세포는 배양 40분 후에 전형적인 대식세포 형태를 얻고 유사분열 세포는 화살표로 표시된 것처럼 자주 관찰됩니다. 이 새로운 고도로 정제된 대식세포 집단을 1ml의 트립 LE Express 용액으로 세척된 세포에 모으고 접시를 추가로 10분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이 배양 기간이 지나면 9ml의 성장 배지를 첨가한 다음 세포 스크레이퍼로 부착된 대식세포를 부드럽게 긁어내고 15ml 원추형 튜브 원심분리기로 옮기고 상등액을 버립니다.

성장 배지 1 밀리리터를 첨가하고, 활발한 피펫팅으로 재현 유탁 세포 덩어리를 단일 세포로 해리하고,이 그래프와 같이 혈구 분석기로 세포 수를 열거하고, 6 개 세포 중 10 개 이상을 2 주 이상 동안 2-3 일 간격으로 반복적으로 T 75 배양 플라스크에서 수확 할 수 있습니다. T 75 배양 플라스크당 10에서 7의 총 세포 수율을 가능하게 합니다. 이러한 이미지에서 볼 수 있듯이, 분리된 세포는 CD 68 또는 ED one 및 CD 1 72 A 또는 OX 41과 같은 랫드 대식세포 항원에 대한 단클론 항체가 있는 면역 염색입니다. 이 세포는 FITC로 표지된 마이크로비즈의 활성 식세포작용(active phagocytosis)과 같은 대식세포의 기능적 특성을 가지고 있었습니다.

이 비디오에서는 성체 적간 세포의 혼합된 1차 배양물에서 대식세포를 얻는 간단하고 효율적인 방법을 제시했습니다. 당사의 절차는 복잡한 장비나 기술을 필요로 하지 않지만 동일한 황동 배양에서 반복적으로 수확할 수 있는 충분한 수의 순수 대식세포를 제공합니다. 이 방법은 다른 포유류 종에 적용 할 수 있습니다.

비디오를 시청해 주셔서 감사드리며 향후 실험에 행운을 빕니다. 건배.