Name: 성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 성인 쥐 간세포 혼합 1차 배양에서 대식세포를 분리하는 간단한 방법을. 콜라게나제 관류와 선택적 부착을 통해 고순도 대식세포를 반복적으로 수확할 수 있습니다.

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이 작품은 연구 그랜트 그랜트 - - 에이드 일본의 농림 수산 장관의 식품 나노기술 프로젝트에서.에 의해 투자되었다

1. 간의 재관류 <ol><li> 나트륨 pentobarbital 용액 (50 MG 나트륨 pentobarbital / kg 체중)의 intraperitoneal 주사로, 성인 남자 스프 라그 - 돌리 쥐 (몸 무게 1백50-2백그램 주 된 10-15에서) 마취. </li><li> 스테인리스 냄비에 동물을 장소와 복부 및 흉부에 70 % 에탄올을 스프레이. </li><li> 피부에서 작은 잘라 껍질을 확인하십시오. 가위로 절단하여 복부를 엽니다. </li><li> 포털 정맥의 위치를​​ 확인 포탈 정맥과 느슨하게 클럼프 아래 수술 스레드를 전달합니다. </li><li> 클럼프 하부 베나의 정맥과 간으로 혈액 역류를 방지하기 위해 정맥 mesenteric의 말초 부분을. 가위로 다이어프램을 절단하여 흉강을 열고 심장을 노출. </li><li> 포털 정맥에 플라스틱 카테 테르 (2mm 직경)를 삽입하고 단단히 카테터 주변의 스레드를 조입니다. </li><li> 37 prewarmed ° C.; 세척 용액 (pH는 7.2 칼슘 2 + - MG 2 + 0.5 MM EGTA, 10 MM의 HEPES 및 4.2 MM NaHCO 3가 포함된 무료 HBSS)이 탑재되는 재관류 시스템에 카테터를 연결 </li><li> 10 ML / 분 속도로 현장에서 재관류를 시작합니다. 동시에, 오른쪽 아트리움 벽에 상처를합니다. 10 분 재관류를 계속합니다. </li><li> collagenase 솔루션 재관류 솔루션을 스위치 [유형 보충 10mM HEPES 및 4.2mM NaHCO 3가 포함된 HBSS I collagenase (0.05 %)과 트립신 억제제 (50 μg / ML), 산도 7.5] 10, 그리고 perfuse - 속도로 20 분 10 ML / 분 간 약간 부풀 및 장액의 막 아래에있는 간 구조의 붕괴에 대한 기호를 표시하기 전까지. </li></ol> 2. Parenchymal Hepatocyte 풍부한 세포 분획의 준비 <ol><li> 제거하고 신중하게 collagenase 솔루션 25 ML을 포함하는 멸균 비커에 간 전송. 가위로 작은 조각으로 말하다. </li><li> 결과 세포 현탁액에 감기 멤의 75 ML을 추가합니다. 부드러운 pipetting 후, 여과수는 셀 스트레이너 (100 μm의)를 통해 결합 조직 및 소화되지 않은 조직 파편을 제거합니다. </li><li> 4 ° C (브레이크 해제)에서 1 분 50 XG 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 여과물을 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 뜨는 폐기하십시오. 감기 멤와 펠렛을 Resuspend. </li><li> )을 세 번 2.4 반복합니다. </li></ol> 3. 간세포의 혼합 차 문화 <ol><li> DMEM가에 100 μm의 β - 메르 캅 토 에탄올, 10 μg / ML 인슐린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신과 100 U / ML 페니실린, 그리고 씨앗과 보충 10% 열을 inactivated FCS를 포함 구성된 성장 매체 2.5에서 얻어진 세포)를 일시 중지 6.7 X 10 4 세포 / cm 2 (중간 5 X 10 6 세포 / 술병 / 12 -15 ML)의 밀도에 : 5-10 조직 문화 flasks (75cm이 표면적). </li><li> 문화에게 flasksat 37 품어 ° 5% CO 2 분위기에서 C - 95 %의 공기. </li><li> 성장 매체마다 2~3일 간격을 바꾸십시오. </li></ol> 4. Macrophages의 선택적 분리 <ol><li> 문화 12 일 후에, macrophages의 세포 시트에 분아 따위에 의해 번식. 이러한 세포가 80 문화 flasks의 흔들어 상호에 의해 정지 아르 - 30 분 분당 120 스트로크를 37 ° C. </li><li> 100mm 이외의 조직 문화 학년 플라스틱 접시에 배지를 전송합니다. 한 플라스틱 접시 두개의 T75 flasks에서 매체를 풀. 성장 매체와 함께 리필 문화 flasks는 배양기로 돌아갑니다. </li><li> 37 30 분 플라스틱 요리를 품어 ° 5 % CO 2 분위기에서 C - 95 %의 공기. 다른 오염 세포 안 반면 Macrophages은 쉽게이 부화 과정에 따라 이외의 조직 문화 등급 플라스틱 요리에 첨부합니다. </li><li> 매체 대기음 부드럽게 PBS로 플라스틱 접시를 씻어. 이 단계를 세 번 반복합니다. </li><li> 그릇에 TrypLE 익스프레스 솔루션 1 ML을 추가하고 37 10 분에 대해 품어 ° 5 % CO 2 분위기에서 C - 95 %의 공기. </li><li> 성장 매체 9 ML을 추가합니다. 부드럽게 세포 스크레이퍼에 의해 연결된 macrophages를 다쳤어요. </li><li> ° C (브레이크)를 25 5 분 180 XG에 15 ML 원뿔 관과 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 성장 매체 1 ML를 추가합니다. 활발한 pipetting하여 단일 세포로 분열시키다. hemocytometer - 계산하여 휴대폰 번호를 열거합니다. </li><li> 절연 단계는 두 개 이상의 주 2~3일 간격으로 같은 문화 flasks와 반복 수 있습니다. </li><li> 절연 macrophages는 3.1에서 설명한 성장 매체 교양 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 성인 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화의 예제는 그림 2에 표시됩니다. Parenchymal hepatocytes 문화에 몇 일 이내에 상피 세포의 형태를 잃고, 타락한 또는 fibroblast 같은 세포로 변환.그렇다면, 하루 종일 6-12, 위상은 반대로 밝은 둥근 대식 세포와 같은 세포가 vigourouly fibroblastic 세포 시트에 분아 따위에 의해 번식. 문화 flasks의 흔들림으로, macrophages는 즉시 문화 매체에 정지하고 있으며, 플라스틱 요리 후속 전송과 부화는 macrophages의 선택적 유착 (그림 3)의 결과. 대식 세포와 같은 세포는 일 8로 일찍 수확하고, 숫자 12-14일에 최대한의 수준에 도달하실 수 있습니다. 이상 10 6 세포는 10 7 T75 당 문화 플라스크 (그림 3) 플라스크 당 총 세포 수율을 활성화, 2 주 이상 2 ~ 3 일 간격으로 반복 T75 문화 플라스크에서 수확 수 있습니다. 절연 macrophages의 purities은 같은 ED - 1 (그림 4), ED - 3, OX - 41 (그림 4)와 Iba1 9.로서 쥐 대식 세포 특정 항체와 flowcytometry 또는 immunocytochemistry에 의해 평가 95~99% 였는데 고립된 세포는 polystylene 비즈의 적극적인 phagocytosis (그림 5), 재조합 GM - CSF, LPS로 자극하고, multinucleated 거대한 세포 구 형성에 염증 / 안티 - 염증성 크린 시토킨의 분비에 proliferative 응답으로 macrophages의 전형적인 특성을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화에서 대식 세포와 같은 세포의 선택적 분리 및 정화를위한 계획. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 쥐의 간 세포와 대식 세포와 같은 세포의 확산의 주요 문화. 화살표 multinuclear 거대한 세포를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm의. Elsevier의 허가를 면역 방법의 논문집, Vol.360, 47-55 (2010) 9 Reprinted. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 떨고 첨부 방법으로 대식 세포와 같은 세포의 선택적 분리. 세포는 flasks를 흔들어하여 문화 매체에 정지 이후이 아닌 조직 문화 학년 플라스틱 접시에 양도하고, 37 ° C.에 incubated했다 도금 후 빠르면 10 분, 기타 오염 fibroblastic 세포가 정지 유지하면서, 접시 표면에 부착된 대식 세포와 같은 세포. PBS로 rinsing 후, 매우 정제된 세포 대식 세포의 인구는 얻은 것입니다. 이러한 세포는 문화의 40 분 이후에 전형적인 대식 세포의 형태를 얻고, 그리고 mitotic 세포는 자주 (화살표) 관찰되었다. 다른 문화의 시대에 flasks에서 발견한 세포 숫자의 후속 변경 내용이 표시됩니다. 값은 3 ~ 5 flasks에 평균 ± SD 있습니다. 실험은 세 번 반복되었으며 데이터를 다른 기호로 표시됩니다. 스케일 바 = 100 μm의. Elsevier의 허가를 면역 방법의 논문집, Vol.360, 47-55 (2010) 9 Reprinted. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 쥐의 단클론 항체에 대한 macrophages와 대식 세포와 같은 세포 Immunocytochemical 염색법. <img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 대식 세포와 같은 세포 FITC - 라벨 microbeads의 Phagocytosis.

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</ol>

모든 동물은 동물 실험에 대한 기관의위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라, 보관 및 동물 보건 국립 연구소에있는 동물 시설에서 운영되었다.

여기, 우리는 성인 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화에서 macrophages를 얻을 간단하고 효율적인 방법을보고합니다. 우리의 방법은 쥐 간 세포의 혼합 문화 macrophages의 소설 proliferative 활동에 첫번째 의존하고 macrophages 9으로서의 생물 학적 특성을 바탕으로 이러한 세포의 후속 분리 및 정화. 그것은 성인 간 세포의 혼합 차 문화의 확산 macrophages는 Kupffer 또는 parenchymal hepatocytes 분율로 오염과 관련된 세포에서 유래있을 수도 있습니다. macrophages는 혼합 차 문화에 parenchymal hepatocyte 10 기타 fibroblastic 세포의 변화로 인해 특정 환경 변화에 대응 할 수도 있습니다. 결론적으로, 우리의 방법은 정교한 장비와 기술을 사용하여 쥐의 간 cellswithout의 주요 문화 충분한 번호 및 순도의 대식 세포와 같은 세포의 격리를 제공합니다. 또한, 절연 절차는 두 개 이상의 주 같은 문화 플라스크와 반복 수 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물 종에 적용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 나트륨 pentobarbital 용액 </td><td> 교리쓰 Seiyaku </td><td> Somnopentyl 사출 </td><td></td></tr><tr><td> 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14185-052 </td><td></td></tr><tr><td> 에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> E - 4378 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 와코 순수 화학 공업 (주) </td><td> 032-10534 </td><td> 세포 분리 학년 (롯 확인 필요) </td></tr><tr><td> 트립신 억제제 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T - 9128 </td><td></td></tr><tr><td> 이글의 최소 필수 중간 (멤) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M - 4655 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco이 수정의 이글의 중간 (DMEM) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D - 6459 </td><td> 포도당 - 타입 하이 </td></tr><tr><td> 소태아 혈청 (FCS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> 열 ° C 30 분 56 inactivated. (롯 확인 필요) </td></tr><tr><td> TrypLE 익스프레스 </td><td> Invitrogen </td><td> 12,605 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산염은 버퍼링 호수 (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14,190 </td><td> CA 2 + - MG 2 + 무료 </td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M - 7522 </td><td> 주식 : 증류수 100 MM </td></tr><tr><td> 인슐린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> I - 5500 </td><td> 주식 : 0.1N HCL 10 MG / ML </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,070 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> 메쉬 크기 : 100 μm의 </td></tr><tr><td> 조직 문화 플라스크 </td><td> 스미토모 Bakelite (주) </td><td> MS - 21250 </td><td> 표면적 : 75cm 2 </td></tr><tr><td> 비 - 조직 문화 플라스틱 요리 </td><td> BD Biosciences </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스크레이퍼 </td><td> 코닝 주식 회사 </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> 상호 흔드는 </td><td> TAITEC </td><td> NR - 1 </td><td></td></tr></tbody></table>

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer 세포가 간 특정 주민 macrophages이며, 1-3 간의 생리와 병리 학적 기능에 중요한 역할을한다. 간 macrophages의 절연 방법 4-6 잘 설명하고 있지만, 이러한 방법의 대부분은 이러한 원심 elutriator 및 기술 능력 등 정교한 장비가 필요합니다. 여기, 우리는 간략하게 구조 그림 1에 설명된 성인 쥐의 간 세포의 혼합 차 문화에서 충분한 번호 및 순도에 간 macrophages을 얻기 위해 소설 방법을 제공합니다. 2 단계 재관류 방법 7,8하여 간 세포의 분리 후, 대부분 parenchymal hepatocytes 구성된 분수가 준비하고 DMEM와 10 %의 FCS.Parenchymal hepatocytes 구성된 문화 매체와 T75 조직 문화 flasks에 씨앗을 품고 것은 상피 세포의 형태를 잃게 문화의 몇 일 이내에, 타락한 또는 fibroblast 같은 세포 (그림 2)로 변환. 로 문화의 날 6 주위 진행, 위상 대조 - 밝고 둥근 대식 세포와 같은 세포 (그림 2) fibroblastic 세포 시트에 분아 따위에 의해 번식을 시작합니다. 대식 세포와 같은 세포의 성장은 술병의 표면에있는 세포 시트를 덮고, 계속 일 1,200 최대 수준에 도달. 문화 flasks의 흔들림으로, macrophages는 즉시 문화 매체로 중단됩니다. 와 같은 다른 오염 세포가 정지 상태 macrophages의 선택 접착에 플라스틱 접시 결과의 후속 전송 및 짧은 부화 (그림 3). PBS 여러 rinses 후, 첨부된 macrophages은 수확하고 있습니다. 이상 10 6 세포는 두 개 이상의 주 (그림 3) 2-3일 간격으로 동일한 T75 조직 문화 플라스크에서 반복적으로 수확 수 있습니다.하거나 유동세포계측법에 의해 평가로 격리 macrophages의 purities은 95~99%되었습니다 쥐 대식 세포 특정 항체 (그림 4)와 immunocytochemistry가. 고립된 세포는 LPS로 자극하고, 형성시 polystylene 비즈의 적극적인 phagocytosis (그림 5), 재조합 GM - CSF에 proliferative 반응, 염증 / 안티 - 염증성 크린 시토킨의 분비를 보여 multinucleated 거대 세포 9. 결론적으로, 우리는 방법이 다른 포유 동물 종에 적용있을 복잡한 장비 및 skills.This없이 충분한 번호 및 순도에 간 macrophages를 얻을 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

쥐의 간 세포의 주요 문화 macrophages를 얻을 소설 방법을 설명합니다. 이 방법은 플라스틱 요리 선택적 첨부하여 문화 flasks 및 정화의 흔들림 다음 문화 macrophages의 확산을 활용합니다. 이 기술은 효율적으로 복잡한 장비와 기술없이 간 macrophages을 제공합니다.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

쿠퍼 세포(Kupffer cells)는 간 특이적 상주 대식세포이며 간의 생리적 및 병리적 기능에서 중요한 역할을 합니다1-3. 비록 ...

다음 실험의 전반적인 목적은 복잡한 장비나 기술 없이도 쥐 간 세포의 혼합 일차 배양물로부터 다수의 대식세포 배양물을 얻는 것입니다. 이는 먼저 콜라게나아제 관류를 통해 성체 쥐의 간 세포를 해리한 후, 실질 간세포 분획을 분리함으로써 이루어집니다. 그다음, 세포를 성장 배지가 담긴 T 75 조직 배양 플라스크에서 배양하여 간 세포의 혼합 일차 배양물을 수립합니다.그 후 10~12일간 배양한 뒤, 배양 플라스크를 흔들어 대식세포를 플라스틱 접시로 옮깁니다. 이후 짧은 배양 기간 동안 선택적 접착을 통해 대식세포를 수확합니다. 최종적으로, 하나의 T 75 조직 배양 플라스크에서 2~3일 간격으로 2주 이상 반복해서 10개 이상의 6-cell을 수확할 수 있습니다. 간 대식세포의 분리 방법은 이미 잘 기술되어 있습니다.하지만 기존의 대부분의 방법들은 원심분리기로 대표되는 정밀 장비와 숙련된 기술적 능력을 필요로 합니다. 본 영상에서는 특별한 장비나 고도의 실험실 기술 없이도 성체 쥐의 간 세포 혼합 일차 배양액으로부터 충분한 수와 순도의 간 대식세포를 얻을 수 있는 간단하고 새로운 방법을 제시합니다. 동물 해부, 간 관류 및 세포 준비 과정은 국립동물건강연구소의 Norco, Yamanaka, Miko yoshioka 박사가 시연할 예정입니다.이어서 국립 농생명과학 연구소의 Taketo Takeno 박사가 배양 환경에서의 간 대식세포 분리 및 정제 방법을 보여주겠습니다. 그럼 시작하겠습니다. 쥐 간의 관류를 준비하기 위해, 세척액 한 병과 콜라게나제(collagenase) 용액 한 병을 미리 데워둡니다.그 다음 피부 꼬집기 시험으로 진정 상태를 확인한 후, 마취된 성체 수컷 쥐를 스테인리스 팬에 놓고 복부와 흉부에 70% ethanol을 분무합니다. 이어서 해부 가위를 사용하여 복부 중앙에 작은 절개를 가하고 피부를 젖힙니다. 그 다음 가위로 복부를 절개하여 문맥의 위치를 확인합니다.다음으로, 수술용 실을 문맥 아래로 통과시킨 후 느슨하게 묶습니다. 그 후, 간으로 혈액이 역류하는 것을 방지하기 위해 모스키토 클램프(mosquito clamp)로 하대정맥의 말단부와 장간막정맥을 집습니다. 가위로 횡격막을 절개하여 흉강을 열고, 안과용 가위로 문맥에 작은 절개창을 낸 후 심장을 노출시킵니다. 정맥에 2 mm 플라스틱 카테터를 삽입하고 카테터 주변의 실을 단단히 묶습니다.사전 가온된 세척액을 퍼퓨전 시스템에 채운 후 카테터에 연결합니다. 분당 10 milliliters의 속도로 C two에서 퍼퓨전을 시작합니다. 동시에 해부 가위를 사용하여 우심방 벽을 절개합니다.10분 동안 관류를 계속한 다음, 관류액을 콜라게나아제 용액으로 교체하여 10분에서 20분 동안 관류합니다. 분당 10mL의 속도로 멸균 비커에 콜라게나아제 용액 25mL를 채웁니다. 그다지 관류된 간을 꺼내어 비커에 조심스럽게 넣습니다.가위로 간을 작은 조각으로 다집니다. 생성된 세포 현탁액에 75 milliliters의 차가운 MEM을 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅한 후, 100 micrometer 세포 스트레이너로 현탁액을 여과합니다.소화되지 않은 조직 파편에서 결합 조직을 제거하려면 여과액을 50 milliliter conical tube에 수집하십시오. 여과액을 50 milliliter conical tube로 옮기고, 먼저 4 °C에서 50 Gs로 1분 동안 원심 분리하여 세포를 4회 세척하십시오. 원심 분리가 멈춘 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 차가운 MEM에 재현탁시키며, 마지막 세척 후 세포를 다시 원심 분리하십시오.간 세포를 성장 배지에 다시 현탁합니다. 이제 세포를 6.7 × 10⁴ cells/cm²의 밀도로 5~10개의 T 75 조직 배양 플라스크에 분주합니다. 배양 플라스크를 인큐베이터에 넣고 2~3일마다 성장 배지를 교체합니다.1일간의 배양 후, 실질 간세포는 플라스크 표면에 퍼지며 하나 또는 두 개의 둥근 핵을 가진 전형적인 다각형의 고팔스톤(copal stone) 모양의 형태를 보입니다. 배양 후 며칠 이내에 실질 간세포는 상피세포의 형태를 잃고 더 납작한 섬유아세포 모양의 세포로 변형됩니다. 6일째 무렵, 위상차 현미경 관찰 시 밝고 둥근 대식세포 유사 세포들이 섬유아세포 세포층 위에서 증식하기 시작합니다. 대식세포 유사 세포의 성장은 12일째 무렵 최대 수준에 도달합니다.섬유아세포 세포 시트가 퇴행하기 시작하는 19일경에 대식세포 유사 세포의 수가 감소합니다. 따라서 배양 7~10일경에, 대식세포가 재현탁된 후 배양 플라스크를 30분 동안 상호 흔들어 세포 시트 위에서 증식한 대식세포를 배양액 내로 부유시킵니다. 100 밀리미터 비조직 배양 등급 플라스틱 디쉬 각각에 T 75 플라스크 2개분에서 얻은 배양액을 넣습니다.배양 플라스크에 성장 배지를 다시 채우고 인큐베이터로 옮깁니다. 배양 기간 후 플라스틱 디시를 30분 동안 인큐베이션하고, 배지를 흡입하여 제거한 뒤 PBS로 플라스틱 디시를 부드럽게 헹구는 과정을 3회 반복하여 세척합니다. 여기에서 보시는 것처럼, 세포 도말 후 10분만 지나도 대식세포 유사 세포는 디시 표면에 부착되는 반면, 오염된 다른 섬유아세포들은 부유 상태로 유지됩니다. PBS 세척 후, 고도로 정제된 대식세포 집단을 얻을 수 있습니다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 세포들은 40분간의 배양 후 전형적인 대식세포 형태를 갖추게 되며, 화살표로 표시된 바와 같이 분열 중인 세포들이 빈번하게 관찰됩니다. 이렇게 새롭게 정제된 고순도의 대식세포 집단을 수집하려면, 세척된 세포에 1 mL의 Tryp LE Express 용액을 가하고 디쉬를 인큐베이터에 다시 넣어 10분 동안 추가로 배양합니다. 이 배양 기간이 끝나면 9 mL의 성장 배지를 추가하고, 셀 스크래퍼를 사용하여 부착된 대식세포를 부드럽게 긁어내어 15 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮긴 후 원심분리하여 상층액을 제거합니다.성장 배지 1 mL를 첨가하고, 격렬하게 피펫팅하여 재현탁된 세포 뭉치를 단일 세포로 분리합니다. 이 그래프에 표시된 것처럼 혈구계수기로 세포 수를 측정하며, T 75 배양 플라스크에서 2~3일 간격으로 2주 이상 반복적으로 10^6개 이상의 세포를 수확할 수 있어, T 75 배양 플라스크당 총 10^7개의 세포 수율을 확보할 수 있습니다. 이 이미지들에서 볼 수 있듯이, 분리된 세포는 CD 68 또는 ED 1 및 CD 1 72 A 또는 OX 41과 같은 쥐 대식세포 항원에 대한 단일클론 항체로 면역 염색되었습니다. 이 세포들은 FITC 표지 마이크로비드의 활발한 식세포 작용과 같은 대식세포의 기능적 특성을 나타냈습니다.본 영상에서는 성체 붉은 간 세포(red liver cells)의 혼합 일차 배양물로부터 대식세포를 얻는 간단하고 효율적인 방법을 제시하였습니다. 본 절차는 복잡한 장비나 기술을 필요로 하지 않으며, 동일한 배양물에서 반복적으로 수확 가능한 충분한 수의 순수 대식세포를 제공합니다. 이 방법은 다른 포유류 종에도 적용할 수 있습니다.영상을 시청해 주셔서 감사하며, 앞으로의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 감사합니다.

a-simple-efficient-method-to-isolate-macrophages-from-mixed-primary

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

간 손상은 이종 세포 인구를 나타내는 전구 세포의 확장을 동반한다. 이 세포 구획의 소설 분류는 여러 부분 집합의 구별이 가능합니다. 여기에 설명 된 방법은 추가 분석 및 분석에 사용될 수있는 다양한 서브 세트의 고순도 분리 계측법 흐름을 도시한다.

분리 및 소설 표면 마커 조합에 의해 확인 된 간 전구 부분 집합의 농축

여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

이 프로토콜은 살아있는, 성인, 인간의 뇌 조직에서 기본 microglia를 격리하는 효율적이고 비용 효율적이며 강력한 방법입니다. 고립 된 1 차적인 인간 microglia는 항상성 및 질병에 있는 세포 프로세스를 공부하기 위한 공구역할을 할 수 있습니다.

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

본 프로토콜은 마우스에서 골수 유래 대식세포의 분리 및 배양을 설명합니다.

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

여기에서는 3차원(3D) 콜라겐 I 매트릭스에서 1차 인간 단핵구 유래 대식세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 조사하기 위한 프로토콜을 제시하며, 미세환경의 용해성 및 물리적 특성이 세포 침입에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

배우세요 성인 쥐 간세포 혼합 1차 배양에서 대식세포를 분리하는 간단한 방법을. 콜라게나제 관류와 선택적 부착을 통해 고순도 대식세포를 반복적으로 수확할 수 있습니다.

성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

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