성인 간세포의 혼합 차 문화에서 Macrophages을 분리하는 간단하고 효율적인 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 복잡한 장비나 기술 없이 쥐 간세포의 혼합 일차 배양액으로부터 다수의 대식세포 배양물을 얻는 것입니다. 이는 먼저 콜라게나아제 관류를 통해 성체 쥐의 간세포를 해리한 후, 실질 간세포 분획을 분리함으로써 이루어집니다. 그 다음, 간세포의 혼합 일차 배양물을 구축하기 위해 세포를 성장 배지가 담긴 T 75 조직 배양 플라스크에서 배양합니다.

그 후 10~12일 동안 배양한 뒤, 배양 플라스크를 흔들어 대식세포를 플라스틱 접시로 옮깁니다. 이후 짧은 배양 기간을 거쳐 선택적 부착을 통해 대식세포를 수확합니다. 최종적으로, 동일한 T 75 조직 배양 플라스크에서 2~3일 간격으로 2주 이상 반복해서 10개 이상의 6개 세포를 수확할 수 있습니다. 간 대식세포의 분리 방법은 이미 잘 기술되어 있습니다.

하지만 기존 방법의 대부분은 원심분리 도식화 장치와 같은 정교한 장비와 숙련된 기술적 능력을 필요로 합니다. 본 연구에서는 특수 장비나 고도의 실험실 기술 없이도 성체 포유류 간세포의 혼합 일차 배양에서 충분한 수와 순도의 간 대식세포를 얻을 수 있는 간단하고 새로운 방법을 제시합니다. 동물 해부, 간 관류 및 세포 준비 과정은 국립동물건강연구소의 Norco, Yamanaka, Miko yoshioka 박사에 의해 시연될 것입니다.

그 다음, 국립농생명과학연구소의 Taketo Takeno 박사가 배양 조직으로부터 간 대식세포를 분리 및 정제하는 방법을 보여주겠습니다. 그럼 시작하겠습니다. 쥐 간의 관류 준비를 위해 세척액 한 병과 콜라게나아제 용액 한 병을 미리 데워둡니다.

그 후 피부 꼬집기 시험으로 진정 상태를 확인한 뒤, 마취된 성체 수컷 쥐를 스테인리스 스틸 팬에 놓고 복부와 흉부에 70% ethanol을 분무합니다. 다음으로 해부 가위로 복부 중앙을 작게 절개하고 피부를 젖힙니다. 그런 다음 가위로 복부를 열어 문맥의 위치를 확인합니다.

다음으로, 외과용 실을 간문맥 아래로 통과시킨 후 느슨하게 조입니다. 그다음 하대정맥과 장간막정맥의 원위부를 모스키토 클램프로 집어 간으로의 혈액 역류를 방지합니다. 가위로 횡격막을 절개하여 흉강을 열고, 안과용 가위로 간문맥에 작은 절개를 낸 후 2 mm 플라스틱 카테터를 정맥에 삽입하고 카테터 주변의 실을 단단히 조여 고정하여 심장을 노출시킵니다.

사전 가온된 세척액을 관류 시스템에 채운 다음 이를 카테터에 연결합니다. 분당 10 milliliters의 속도로 C two에서 관류를 시작합니다. 동시에 해부 가위로 우심방 벽을 절개합니다.

10분 동안 관류를 계속한 다음, 관류액을 콜라게나제 용액으로 교체하여 10분에서 20분 동안 관류합니다. 10 mL/min의 속도로 멸균 비커에 콜라게나제 용액 25 mL를 채웁니다. 그 다음 관류된 간을 꺼내어 비커에 조심스럽게 넣습니다.

가위를 사용하여 간을 작은 조각으로 잘게 다집니다. 생성된 세포 현탁액에 차가운 MEM 75 milliliters를 첨가합니다. 부드럽게 피펫팅한 후, 100 micrometer 세포 스트레이너로 현탁액을 여과합니다.

소화되지 않은 조직 조각에서 결합 조직을 제거하기 위해 여과액을 50 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다. 여과액을 50 milliliter 원추형 튜브로 옮기고, 먼저 4 °C에서 50 Gs로 1분간 원심분리하여 세포를 침전시킴으로써 세포를 4회 세척합니다. 브레이크를 끈 상태에서 상청액을 조심스럽게 제거한 후, 펠릿을 차가운 MEM에 재현탁하며, 마지막 세척 후 세포를 다시 원심분리하여 침전시킵니다.

간 세포를 성장 배지에 다시 현탁합니다. 이제 세포를 6.7 × 10⁴ cells/cm²의 밀도로 5~10개의 T 75 조직 배양 플라스크에 분주합니다. 배양 플라스크를 인큐베이터에 넣고 2~3일마다 성장 배지를 교체합니다.

하루 동안 배양 후, 실질 간세포는 플라스크 표면에 퍼지며 하나 또는 두 개의 둥근 핵을 가진 전형적인 다각형의 코팔 스톤(copal stone) 모양의 형태를 보입니다. 배양 후 며칠 이내에 실질 간세포는 상피세포의 형태를 잃고 더 납작한 섬유아세포성 세포로 변합니다. 6일째쯤 되면 위상차 현미경 상에서 밝고 둥근 대식세포 유사 세포들이 섬유아세포성 세포 층 위에서 증식하기 시작합니다. 대식세포 유사 세포의 성장은 12일째 무렵에 최대 수준에 도달합니다.

섬유아세포 세포 시트가 퇴화하기 시작하는 19일경에 대식세포 유사 세포의 수가 감소합니다. 따라서 배양 약 7~10일 후에, 대식세포를 재현탁시킨 뒤 배양 플라스크를 30분 동안 상하로 흔들어 세포 시트 위에서 증식한 대식세포를 배양액에 부유시킵니다. T 75 플라스크 2개 분량의 배양액을 100 mm 비조직배양용 플라스틱 디쉬 각각에 넣습니다.

배양 플라스크에 성장 배지를 다시 채우고 인큐베이터로 옮깁니다. 배양 기간 후 플라스틱 디쉬를 30분 동안 배양하고, 배지를 흡입해 제거한 뒤 PBS로 플라스틱 디쉬를 부드럽게 헹구는 과정을 3회 반복하여 세척합니다. 여기서 보는 바와 같이, 대식세포 유사 세포를 플레이팅한 후 이르면 10분 후에 세척을 수행하면, 대식세포는 디쉬 표면에 부착되는 반면 다른 오염성 섬유아세포들은 부유 상태로 남아 있게 됩니다. PBS 세척 후, 고도로 정제된 대식세포 집단을 얻을 수 있습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이, 세포는 배양 후 40분이 지나면 전형적인 대식세포 형태를 갖추게 되며, 화살표로 표시된 것처럼 분열 중인 세포가 빈번하게 관찰됩니다. 이렇게 새로 형성된 고순도 대식세포 집단을 수집하려면, 세척된 세포에 1 mL의 trip LE Express 용액을 가하고 배양 접시를 배양기에 넣어 10분간 더 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 9 mL의 성장 배지를 추가하고, 세포 스크래퍼로 부착된 대식세포를 조심스럽게 긁어내어 15 mL 원추형 튜브로 옮긴 후 원심 분리하여 상층액을 제거합니다.

성장 배지 1 mL를 첨가하고, 강하게 파이펫팅하여 재현탁된 세포 덩어리를 단일 세포로 분리하십시오. 이 그래프에 표시된 것처럼 헤모사이토미터(hemocytometer)를 사용하여 세포 수를 측정하며, T 75 배양 플라스크에서 2~3일 간격으로 2주 이상 반복적으로 10^6개 이상의 세포를 수확할 수 있어 T 75 배양 플라스크당 총 10^7개의 세포 수율을 얻을 수 있습니다. 이 이미지들에서 보듯, 분리된 세포는 CD68 또는 ED1, 그리고 CD172a 또는 OX41과 같은 쥐 대식세포 항원에 대한 단클론 항체로 면역 염색되었습니다. 이 세포들은 FITC가 표지된 마이크로비드의 활성 식세포 작용과 같은 대식세포의 기능적 특성을 가지고 있습니다.

이 영상에서는 성체 붉은 간 세포의 혼합 일차 배양물로부터 대식세포를 얻는 간단하고 효율적인 방법을 제시하였습니다. 본 절차는 복잡한 장비나 기술을 필요로 하지 않으면서도, 동일한 배양물로부터 반복적으로 수확 가능한 충분한 수의 순수 대식세포를 제공합니다. 이 방법은 다른 포유류 종에도 적용될 수 있습니다.

영상을 시청해 주셔서 감사합니다. 앞으로의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 감사합니다.