인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 표준 실험실 장비를 사용하여 대량과 품질의 인간 대식세포를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 FI 호출 구배에서 Buffy coats의 혈액을 원심분리하여 P BMC cs를 수집함으로써 달성됩니다. 다음으로 호출당 그래디언트(per call gradient)에서 단핵구(monocyte)는 림프구(lymphocyte)에서 분리됩니다.

그런 다음 단핵구를 테프론으로 코팅된 세포 배양 백에 파종하고 분화합니다. 6일 또는 7일 후, 대식세포를 채취하여 후속 연구를 위해 파종합니다. 얻어진 세포는 성숙한 대식세포의 전형적인 마커를 발현하고 종양세포를 이용한 공동배양 또는 LPS를 이용한 자극과 같은 다양한 자극에 반응해야 하며, 역류, 원심분리 또는 자기 활성화 세포 분류와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 값비싼 시약이나 기구 없이 표준 립 장비로 인간 대식세포를 생성할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 수행하기 쉽지만 이 방법을 처음 사용하는 개인은 밀도 구배에서 다른 세포 집단을 시각화하고 분리하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 이러한 단계를 시각적으로 시연하면 이러한 어려움을 극복하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 로터의 균형을 더 쉽게 맞추기 위해 중복으로 수행됩니다.

층상 혈액에서 버피 코트 분획 두 봉지를 소독하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 Buffy coats를 각 buffy coat에 대해 두 개의 50ml 튜브로 옮깁니다. 15ml의 실온 FI 호출 용액이 있는 50ml 튜브 3개를 밀리리터당 1.077g으로 준비합니다.

이제 천천히 그리고 조심스럽게, FI 호출의 각 튜브에 30-35 밀리리터의 푹신한 코트를 겹쳐 놓습니다. 층은 400G에서 30 분 동안 끊어지지 않고 이러한 튜브를 원심분리해서는 안됩니다. 두 단계 사이의 실온에서 말초 혈액 단핵 세포의 흰색 고리가 형성됩니다.

플라스틱 피펫으로 이러한 층을 제거하십시오. 각 기증자로부터 받은 3개의 튜브 층을 기증자당 2개의 50ml 튜브로 결합합니다. 수집된 세포를 40ml 라인까지 1밀리몰 P-B-S-E-D-T-A를 첨가하여 세척한 후 실온에서 깨지지 않고 300G에서 10분간 원심분리합니다.

이제 상층액을 흡인하고 버리십시오. 그런 다음 세척을 반복하고 P-B-S-C-D-T-A를 재현탁탁하고 각 공여체의 펠릿과 페놀 레드가 없는 20ml의 RPMI와 FCS를 풀링합니다. 이제 기증자당 하나의 세포 튜브가 있어야 합니다.

이제 50ml 튜브에 23.13ml의 실온 용액과 1.87ml의 10 XPBS를 혼합한 두 번째 밀도 구배를 준비합니다. 샘플 2개당 혼합물 튜브 1개를 준비합니다. 다음으로, 23ml의 혼합물을 새 50ml 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 페놀 레드가 함유된 27ml의 RPMI와 FCS를 추가합니다. 그 결과 콜당 46%의 ISO 삼투압 솔루션이 생성됩니다. 이제 각 기증자가 46% 용액 중 25ml를 50ml 튜브에 이식하고 세포 혼합물을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.

두 단계는 중단 없이 색상으로 구별할 수 있어야 합니다. 실온에서 30분 동안 세포를 원심분리하고 550G에서 단핵구의 흰색 고리가 두 얼굴 사이에 고일 것입니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 이 세포를 50ml 튜브에 모으십시오.

50ml 표시까지 채워진 1밀리몰 P-B-S-E-D-T-A로 단핵구를 세척합니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 깨지지 않고 400G에서 원심분리하고 상층액을 버리고 펠렛화된 단핵구를 20ml의 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 다음 섹션을 진행합니다.

이 프로토콜은 FEP 테플론 코팅된 배양 백을 배양 챔버로 사용합니다. 수집된 단핵구의 수를 추정하는 것으로 시작합니다. 단핵구는 크고 종종 불규칙한 모양을 합니다.

더 작은 림프구는 세지 마십시오. 한 명의 공여자의 세포가 1억에서 1억 5천만 개까지 사용할 수 있는 경우, 180ml의 RPMI를 보충할 수 있습니다. 세포 수가 더 적으면 30-5,000만 개의 세포마다 30ml 용량의 배지를 준비합니다.

20ml 분취액에서 세포를 180ml의 준비된 배지에 조심스럽게 혼합합니다. 그런 다음 배양 백의 플러그에 부착된 50mL perfu 주사기를 배양 백에 세포와 함께 로드합니다. 주사기를 제거하고 남은 공기를 밀어낸 다음 플러그를 원뿔로 덮습니다.

이제 5%의 이산화탄소로 6-7일 동안 가방을 배양하십시오. 6-7일의 배양 후 배양 백을 얼음으로 옮겨 세포를 수확하고 백을 얼음에 완전히 담근 다음 1시간에서 3시간 동안 냉각시켜 세포를 분리합니다. 그런 다음 가방을 가장자리 위로 약 10회 부드럽게 당깁니다.

그런 다음 가방 외부를 철저히 소독하십시오. 플러그 콘을 50ml 주사기로 교체합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 꺼내 50ml 튜브로 옮깁니다.

모든 튜브가 수집되면 실온에서 400G에서 10분 동안 스핀다운하여 이제 상층액을 흡인하고 모든 세포를 10ml의 RPMI와 FCS로 모읍니다. 그런 다음 이전과 같이 셀을 계산합니다. 잔류 림프구가 존재할 수 있으므로 대식세포만 계수하십시오.

그런 다음 배양 백을 재사용하기 위해 관심 응용 분야에 세포를 사용합니다. 70% 에탄올로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 50 밀리리터의 70 % 에탄올을 채우고 다음날 실온에서 밤새 배양하고 멸균 PBS로 백을 세 번 헹굽니다.

그런 다음 살균 종이로 싸서 오토클레이브합니다. 가방은 밀도 구배의 10배까지 쉽게 재사용할 수 있습니다. 원심분리는 림프구와 단핵구를 포함하는 흰색 계면을 생성합니다.

여기서 우리는 첫 번째 밀도 구배를 조사합니다. 메이 그룬발트. 이러한 세포를 염색하면 림프구의 전형적인 높은 핵 세포질 비율과 단핵구의 전형적인 콩 또는 고리 모양의 핵이 모두 나타납니다.

이러한 염색은 두 번째 그라데이션의 결과를 보여줍니다. 각 버피 피는 약 1억 5천만 개의 단핵구를 생성하며, 이는 약 7천만 개의 대식세포로 분화될 수 있습니다. 20개의 제제에서, 단핵구의 47%가 대식세포가 되었습니다.

정제된 대식세포는 플라스틱 표면에 부착함으로써 더욱 풍부해질 수 있으며, 이는 오염된 세포가 공유하지 않는 특징입니다. 일단 플레이트가 형성되면 대부분의 대식세포는 달걀 후라이 형태를 보이는 반면 다른 대식세포는 표현형과 같이 늘어난 방추체를 가지고 있습니다. 세포는 여러 마커의 발현을 특징으로합니다.

성숙한 대식세포에 일반적입니다. CD 11 B의 발현은 CD 2 0 9 발현의 부족과 마찬가지로 수지상 분화에 반대합니다. 분화 후 세포는 5-7일 동안 기능적, 신진대사적으로 활성화된 상태를 유지합니다.

생존 가능한 세포의 칼슘 염색은 종양 세포에서 벗겨진 적색 표지된 세포외 소포체를 흡수하는 능력을 보여줍니다. 또한, 대식세포는 활성화될 수 있는데, 예를 들어, 지질다당류를 사용한 자극은 여러 전염증성 유전자의 발현을 초래합니다. 이 절차에 따라, 분리된 대식세포는 건강 및 질병의 대식세포 생물학에 대한 기본적인 질문에 답하기 위해 광범위한 기능 분석을 수행할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 많은 수의 인간 대식세포를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 그러나 잠재적으로 감염될 수 있는 인간 혈액 샘플로 작업하고 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.