Name: 인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 배우세요 이중 밀도 그라데이션 원심 분리법을 사용하여 버피 코트에서 단핵구를 분리하고 테프론 코팅 배양 가방에서 대식세포로 분화시키는 방법을. 표준 실험 장비로 고품질의 인간 대식세포를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

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저자는 지난 몇 년 동안 그녀는 항상 우수한 기술 지원을 부인 Meike Schaffrinski에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 공동 연구 그룹 942 (FOR942) 내에서 독일 연구 협회 (DFG)를 통해 의학 학부, 게오르그 8 월 - 대학 괴팅겐의 연구 프로그램에 의해 투자되었다.

무균 인간 AB 혈청의 1 준비 <ol><li> 신선한 냉동 혈장 (FFP)의 4-5 가방을 수집합니다. -20 ° C에서 보관 가방은 충분한 부대가 수집 될 때까지. </li><li> 가방을 해동 및 보완을 비활성화하고 섬유소를 제거하기 위해 물을 욕조에 56 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 철저하게 가방의 외부를 소독하고 50 ml의 튜브에 플라즈마를 전송합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기 침전물 및 잔여 혈소판을 제거 얻을 수 있습니다. </li><li> 모든 상층 액을 풀과 알약을 폐기합니다. </li><li> 나누어지는 혈청 15 ㎖의 튜브 샘플 및 저장 온도 -20 ° C에서. NOTE : 대안 적으로, 시판되는 열 - 불 활성화 된 정상 인간 AB 혈청을 사용할 수있다. </li></ol> 단핵구의 2 절연 원심 분리기의 분산을 용이하게하기 위해, 병렬로 두 버피 코트를 처리 할 것을 권장한다. 그러나, 캘리포니아을세포를 혼합하여 각각에 대해 별도의 도너 재료를 사용하지 재. 경우에 버피 코트를 쉽게 얻을 수없고, 헤파린 말초 혈액 400ml를 대신 사용할 수있다. <ol><li> 조심스럽게 버피 코트가 들어있는 비닐 봉지를 소독이 50 ml의 튜브에 각 버피 코트의 내용을 전송합니다. </li><li> 각 버피 코트의 경우 15 ㎖의 피콜 용액 (1.077 g / ml)로 세 50 ml의 튜브를 입력합니다. 피콜 조제 실온에서해야한다. </li><li> 제 층 밀도 구배 용 피콜 용액 위에 버피 코트 혈액 ML 30-35. 두 레이어를 혼합 방지하기 위해 천천히 조심스럽게 이렇게주의하십시오. </li><li> 실온에서 30 분 동안 브레이크없이 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 각 구배를 들면 50 ㎖의 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전사와 두 단계 사이에 위치 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 흰색 환을 모은다. </li><li> 총 40 mL로 PBS-EDTA (1 mM)을 각각 튜브를 입력합니다. </li><li> 실온에서 브레이크없이 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 기음 뜨는 및 40 ml의 PBS-EDTA (1 mM)을 다시 펠렛을 씻는다. </li><li> 각 기증자 풀의 페놀 10 + 빨간색 %의 FCS없이 20 ㎖의 RPMI-1640의 펠렛. </li><li> 초 밀도 구배에 대한 ISO 삼투 퍼콜 솔루션을 준비 :이 기증자 23.13 ml의 퍼콜 솔루션 믹스 (밀도 : 1.131 g / ㎖) 50 ㎖의 튜브와 1.87 ml의 10 배 PBS를. 이어서 50 ㎖의 새로운 튜브에 상기 용액 23 mL로 전송하고 46 % 이소 삼투 퍼콜 용액을 얻었다 페놀 레드 10 + %의 FCS와 함께 27 ml의 RPMI-1640을 추가한다. 퍼콜는 자료 실온에 있어야합니다. </li><li> 50 ML 튜브로 제조 된 퍼콜 용액 25 ㎖의 각 기증자 전송 및 퍼콜 솔루션의 상단에 2.9에서 제조 된 PBMC 솔루션을) 층. 매우 느리게 이렇게 조심d를 조심스럽게 두 층이 쉽게 혼합하는 경향이있다. 정확하게하는 경우이 단계로 인해 색상들의 차이를 구별 할 수있다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 브레이크없이 550 XG에 원심 분리기. </li><li> 각 그라데이션의 경우 50 ML 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전송로 두 단계 사이에 위치 단핵구의 흰색 반지를 수집합니다. </li><li> 총 50 mL로 PBS-EDTA (1 mM)을 각각 튜브를 입력합니다. </li><li> 실온에서 브레이크없이 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 기음 페놀 10 + 빨간색 %의 FCS와 함께 20 ml의 RPMI-1640에 알약을 재현 탁. </li></ol> 대 식세포에 단핵구의 3 분화 <ol><li> 트리 판 블루시 10 분 희석에 격리 된 단핵 세포의 수를 결정합니다. 만 단핵구 아르 큰 종종 불규칙 모양의 세포를 계산합니다. 림프구 수있는 작고 둥근 모양의 세포를 계산하지 마십시오. NOTE : 단핵구 숫자들은 단지 세포의 분화에 사용될 얼마나 많은 그리고 FEP 테프론 코팅 된 (소형 또는 대형) 잡화에 관한 힌트를 제공하기 때문에 너무 정확하게 결정될 필요가 없다. </li><li> 한 기증자로부터 1.0-1.5 × 10 8 단핵구 들어 대규모 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 물 주머니에 세포를 시드. 각 부대 174 ㎖의 RPMI-1640 (섹션 1에서 제조 된 바와 같이) 2 % 인간 AB 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2.5 NG / ㎖ M-CSF (180 ml의 총 부피)로 구성된 배양 배지를 준비한다. <ol><li> 한 기증자로부터 3.0-5.0 × 10 7 단핵구를 들어 작은 테프론 코팅 된 세포 배양 용기에 세포를 시드. 각 봉지 배지 285 ㎖의 RPMI-1640 (섹션 1에서 제조 된 바와 같이) 2 % 인간 AB 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2.5 NG / ㎖ M-CSF (30 ㎖의 총 부피)으로 이루어진 준비. 참고 : 예를 들어, 8.0 × 10 7 단핵 세포를 얻을 경우, 우리는 TW에서 그들을 시드 추천4.0 × 10 7 세포 각각 O를 작은 부피 가방. 대신, M-CSF에, 단구 대안 동일한 농도 (2.5 NG / ㎖)에서 과립구 대 식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF)와 구별 될 수있다. </li></ol></li><li> 준비된 배지에 세포 현탁액 (20 ml)에 조심스럽게 첨가하고 혼합한다. 이 백은 한 기증자로부터 제조하는 경우, 세포 현탁액에 20 ml의 RPMI-1640을 추가 한 다음 각 배지에 현탁 제제의 절반을 추가한다. </li><li> 선택 사항 : 단핵구 준비가 무균 상태로있게되면 결정 혈액 한천 접시에 세포 현탁액 한 방울을 찢고 37 ° C에서 밤새 배양합니다. </li><li> FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 가방의 플러그에 주사기 perfusor 50 ML의 외피를 조 준비된 세포 현탁액으로 채운다. </li><li> 주사기를 분리하고 가방에 남아있는 공기를 밀어 넣습니다. 폐쇄 콘 가방을 닫습니다. </li><li> 37 6-7일에 가방을 품어76, 5 % CO 2와 C. </li></ol> 4 대 식세포 수확 <ol><li> 세포의 분리 (최대 3 시간 수의 배양을) 용이하게하기 위해 적어도 1 시간 동안 얼음에 차별화 된 대 식세포와 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 가방을 놓습니다. 가방의 표면 전체가 얼음으로 덮여 있는지 확인합니다. </li><li> 책상 / 보드의 모서리에 살짝 배와 가방을 당기십시오. </li><li> 조심스럽게 가방의 외부를 소독하고 폐쇄 콘을 제거합니다. </li><li> 가방의 플러그에 50 ML의 주사기를 조, 세포 현탁액을 제거하고 50 ML 튜브로 전송. </li><li> 세포를 스핀 다운, 실온에서 10 분 동안 400 XG에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 대기음 총 10 ml의 RPMI-1640 + 10 % FCS에 한 가방에서 알약을 풀. </li><li> 혈구의 세포 수를 결정 (1 : 4-1 : 트리 판 블루 10 희석). 만 대형 원형 셀을 계산합니다. NOTE : FEP 테플론 코팅 가방 식세포를 미분 한 후, 잔여 도너 세포와 단핵구 분리의 품질에 따라, 예를 들어 림프구가있을 수있다. </li><li> FEP 테플론 코팅 된 가방을 다시 사용하려면 잔여 세포를 제거하기 위해 70 % 에탄올로 두 번 씻어. 50 ㎖의 70 % 에탄올로 채우고 하룻밤 배양한다. 가방, 멸균 PBS로 3 배 살균 종이에서 그들을 포장하고, 표준 절차를 사용하여 오토 클레이브 소독 세척 할 것. 주 : 세포 배양 가방 식세포 금리 손실없이 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그러나 우리는 그들이 누출을 시작하기 전에 10 사용 후 가방을 폐기하기로 결정했다. </li><li> RPMI-1640 + 10 % FCS 후속 실험 문화 대 식세포하십시오. 낮은 혈청 농도가 필요한 경우, 1 % FCS와 RPMI-1640에서 배양이 가능하다. 종자 3 ~ 4 시간 동안 배양 세포. 이 기간 후에는, 대 식세포가 세포 배양 접시 동안의 표면에 부착 유의어떤 오염 세포 (즉, 적혈구, 림프구, 수지상 세포) 서스펜션에있어. 비 부착 세포를 제거하는 PBS로 두 배 이상 세포를 씻으십시오. </li><li> 상기 실험을위한 세포 배양 접시에서 배양 한 대 식세포를 분리, 신중 표면들을 긁어. 또한, 얼음에 20 분 동안 요리를 배양 배지를 흡인하고, 1 ml의 효소가없는 세포 분리 버퍼를 추가합니다. 37 ° C에서 5 분 배양 한 후, 아래로 최소 3 분 동안 4 ml의 PBS를 추가하고, 피펫 팅하여 세포를 분리합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 이해 관계의 충돌이 존재하지 않기 때문에 공개하는 게 없다.

대 식세포는 선천성 면역 시스템의 중요한 이펙터 세포 아르와 면역, 항원 제시 및 조직의 항상성에 중요한 기능을 표시합니다. 인해 현저한 소성하여, 그들의 표현형의 변화와 다른 자극에 반응 할 수있다. 대 식세포 편광 마커의 단지 약 50 %가 인체에 직접 16에 마우스 번역 될 수 있음을 보여주는 보고서가 있지만 그러나, 대 식세포의 편광에 관한 데이터의 지금까지 많은, 쥐의 시스템에서 얻을 수있다. 따라서 고가의 재료, 예를 들면 MACS 마그네틱 비드 또는 향류 원심 elutriation 장치에 대한 필요없이 충분한 수 및 여기 순도 차 인간 대 식세포를 얻는 방법을 제시한다. 우리의 방법은 한 PBMC에서 단핵 세포의 분리 및 FEP에서 대 식세포에 대한 그들의 이후의 차별화를 기반으로 낮은 conce의 존재 세포 배양 가방을 테프론 코팅M-CSF 11 ~ 13 ntrations. 단핵구를 자극시 인간에서 5 미만 말초 혈액 백혈구 ~ 10 %를 구성하는 동안 그들은 상주 조직 대 식세포 또는 수지상 세포로 분화 17 주연 사이트로 보충된다. 사이토 카인 M-CSF는 단핵 세포의 생존을 위해 중요하며, 대 식세포 (18, 19)로 분화를 구동한다. 지금까지, 단핵구의 분화에 선정되었다 M-CSF 농도는하지만, 우리의 프로토콜에 우리는 단지 2.5 NG / ML (12)의 M-CSF 농도 성숙한 대식 세포의 충분한 수를 얻을 수 있으며, 100 겨 / ㎖까지였다 20. 또한, 세포는 대 식세포의 박리 정의 세포 수에서의 후속 시드를 용이 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 백에서 배양한다. 잡화 여러 번 재사용 될 수 있기 때문에 상기 분리 공정에 대한 비용을 감소시킨다. 이 절차에 의해 수득 식세포CD45, CD14, CD11b를,의 CD11c에 매우 긍정적이며, 순수, 성숙한 대식 세포 (21, 22)의 인구에 대한 주장 만노스 수용체 CD206의 발현을 보여줍니다. 특히 높은 CD14 발현은 M-CSF (23)의 존재하에 분화 된 대 식세포에 대한 전형적인 것이다. 다른 사람이 기름에 튀긴 된 계란 표현형을 전시하면서 세포의 파종 후, 그들은 일반적인 스핀들과 같은 형태를 보여주는 몇 가지 세포와 플라스틱 표면 빠르고 준수를 표시합니다. 이것은 다른 저자 18,22,24에서 관측에 따라입니다. 그것은 M-CSF의 존재 하에서 단핵구 분화 M2 편광 식세포 16,25 리드 것으로보고되었다. 그러나, 우리의 프로토콜에 의해 단리 식세포는 그들이 프로 유도와 반응 정지 종양 세포 26,27 또는 LPS에 노출 종양 세포 유래 마이크로 소포와 공동 배양에의 노출을 포함하여 자극의 넓은 범위에 응답 할 수있다 이러한 IL-1과 같은 염증성 유전자# 946 ;, TNFα, Wnt5a, 또는 M1-편광 식세포 3,5,28에 대한 일반적인 고려되는 다양한 매트릭스 메탈로. 결론적으로, 기술적으로 어렵거나 비싼 절차 없이도 이중 밀도 구배 원심 분리 및 대 식세포의 높은 숫자 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 백 결과 식세포 향해 후속 분화에 의해 단핵구의 분리. 수득 식세포는 종양 세포와 함께 공 배양하여 LPS를 통해 고전 활성화에서부터 후속 분석을 위해 이용 될 수있다.

대 식세포 - - 단핵구 혈통과 말기 차별화 된 파생 상품에서 세포 개발, 조직 복구, 면역 일 등 다양한 공정에서의 참여로 이어지는, 자신의 생물학적 기능과 관련하여 눈에 띄는 가소성을 나타낸다. 후자는 자신의 식세포 및 선천성 및 후천성 면역 반응이 사이의 교차로에 대 식세포를 배치 항원 제시 능력 때문이다. 그러나, 그들의 능력이 사이토 카인, 케모카인, 성장 인자 및 다른 시그널링 분자가 분비 한 그들의 면역 조절 성 기능을 증대뿐만 아니라, 자신의 부가 기능에 대한 기초 역할뿐만 아니라. M1과 M2 카테고리 3 이어질 아닌 미생물 매개 조건의 맥락에서 이러한 다양한 활성화 단계를 반영하려고 시도합니다. 이러한 분류가 완료되지 않은 반면, 대식 세포 생물학의 기본적인 이해를 위해 허용한다. 이러한 다각적 인 기능으로 인해이 대 식세포가 어떤 방식으로 조직을 리모델링하거나 염증을 포함하는 많은 조건과 연관되어 있다는 것은 놀라운 일이. 침입하는 병원균 4-6의 인식 및 통관에서의 기본적인 역할에 다음 대 식세포는 점점 동맥 경화증, 섬유증, 비만, 암 7-10의 초점이있다. 인간 대 식세포의 생성을위한 재현성있는 방식은 이러한 병리의 이해에 따라서 중요하다. 여기에서 우리는 이전에 설명한 바와 같이 11 배 밀도 구배 원심 분리 기술에 의해 건강한 기증자의 말초 혈액 단핵 세포에서 인간의 분리에 기반 방법을 제시한다. 식세포쪽으로 분화를 촉진하기 위하여, 절연 단핵 세포는 M-CSF 및 정상적인 인간 혈청 (12)의 낮은 농도의 존재 하에서 배양 하였다. 추가 처리 및 세포 수확을 쉽게하기 위해, 차별화 가스 투과 FEP에서 수행된다소수성 표면에 12 ~ 15 테프론 코팅 된 세포 배양 가방. 그들은 여전히​​ 어느 M1 또는 M2 유사한 방식으로 응답 할 수있는 바와 같이 얻어진 쉬고 식세포 분석의 다양한 실시 할 수있다. 자기 활성 셀 정렬 (MACS) 또는 원심 elutriation (CCE)를 역류 등의 단핵 세포 분리 및 후속 차별화의 다른 방법이 필요 수율, 비용 및 시간에 관한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본원에 기재된 프로토콜은 특수 시약 (예, 자성 비드를 MACS) 또는 장치 (예, CCE 장치)의 필요없이 표준 실험실 장비로 수행하고 세포의 대량의 처리를 허용 할 수있는 이점을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>면역표현형 분석을 위한 항체</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>예: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td></tr><tr><td></td><td>BioLegends</td><td></td><td>, 예: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td></tr><tr><td>Axiovert 200M microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>AnaSpec</td><td>89201</td><td></td></tr><tr><td>콤비 스토퍼 클로징 콘</td><td>Braun</td><td>4495101</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, Ca 및 Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td>PBS-EDTA (1 mM) PBS 500 ml PBS 10x PBS당 1 ml 0.5 M EDTA 추가</td></tr><tr><td>, Ca 및 Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1084211000</td><td>H2O에서 0.5 M 용액을 준비합니다. 멸균 필터 사용</td></tr><tr><td>세포 해리 완충액 (효소 없음, PBS 기반)</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>heat-inactivated</td></tr><tr><td>Ficoll (density 1.077 g/ml)</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse FITC</td><td>santa cruz</td><td>sc-2010</td><td></td></tr><tr><td>E.coli</td><td>Sigma</td><td>L8274</td> 최종 농도의 LPS<td>: 100ng/ml</td></tr><tr><td>Multifuge 3 LR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom AG</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (밀도 1.131 g/ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>퍼퓨저 주사기 50 ml</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>메탄올 (c = 0.1 mg / ml)</td></tr><tr>에 재현탁<td colspan = "4"> [header]</td></tr> <tr><td>플라스틱 일회용 파스퇴르 피펫</td><td>LVL 기술</td><td>2655181</td><td></td></tr><tr><td>rh M-CSF</td><td>ImmunoTools</td><td>11343117</td><td>500 &micro에 재현탁; l 멸균 H2O (c = 100 ng/&micro; l), 분취</td></tr><tr><td>RPMI-1640 with phenol red</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 without phenol red</td><td>Gibco</td><td>11835-063</td><td></td></tr><tr><td>Sterilization paper</td><td>VP group</td><td>3KFKFS230116</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain (0.4% w/v)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>FEP 테플론 코팅 세포 배양 백, 소형</td><td>CellGenix</td><td>72-C</td><td></td></tr><tr><td>FEP 테플론 코팅 세포 배양 백, 대형</td><td>CellGenix</td><td>197-C</td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

인간 대 식세포는 감염성 질환에서 암에 이르기까지 병리학 적 과정의 과다에 참여하고 있습니다. 따라서 그들은 이러한 질병의 기본 메커니즘을 이해하는 유용한 도구 포즈. 따라서 우리는 높은 대식 세포 수율 결과 차별화 절차에 의해 다음 버피 코트에서 인간 단핵 세포의 분리를 위해 간단한 프로토콜을 제시한다. 기법은 일반적으로 사용할 실험 장비에 주로 의존하며, 따라서 인간 대 식세포 다량 수득 비용 및 시간 효율적인 방법을 제공한다. 간단히, 건강한 혈액 기증자 버피 코트는 말초 혈액에서 단핵구를 수확하는 이중 밀도 구배 원심 분리된다. 이러한 단핵구는 대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)의 존재하에 플루오르 화 에틸렌 프로필렌 (FEP) 테프론 코팅 된 세포 배양 주머니에 배양한다. 차별화 된 대 식세포 쉽게 수확 및 후속 연구와 같은 기능을 사용할 수 있습니다말했다. 품질 관리 및 격리과 분화 단계의 검증하기위한 중요한 방법은 프로토콜 내에서 강조 표시됩니다. 요약하면, 여기에 설명 된 프로토콜은 일상적 재현성 비용 집약적 도구 없이도 인간 대 식세포를 분리 과학자들 수있다. 또한, 질환 모델은 뮤린 대 식세포의 사용을 회피 동계 인간 시스템에서 연구 될 수있다.

피콜을 사용하여 제 밀도 구배 원심 분리 한 PBMC (도 1a), 즉 림프구 및 단핵구를 포함하는 백색 간기를 산출한다. 이는 월 Gruenwald 염색 (림프구의 일반) 높은 핵 / 세포질 비율을 모두 보여줍니다 수집 된 세포 (그림 1B 및 C)를 통해 확인 및 (단핵 세포의 전형) bean- 또는 고리 모양의 핵이 될 수있다. 이들 세포를 사용하여 다음 퍼콜 초 밀도 구배에로드 될 때, 단핵구는 림프구로부터 더욱 분리 될 다시 백색 상간 (도 1D-F)로 표시 할 수있다. 각 버피 코트를 들어 설명 이중 밀도 기울기 원심 분리 정기적으로 버피 코트 70 ± 30 × 10 6 대 식세포 (그림 2)로 구분됩니다 150 ± 40 × 10 6 단핵 세포를 얻을 수 있습니다. 에서 평균 식세포 수익률20 독립적 인 준비는 총 격리 된 단핵구의 47 ± 14 %였다. 퍼콜 구배 원심 분리 후 여전히 헌혈에뿐만 아니라 분리 공정의 정확도에 의존하는 제조에서 본 일부 잔류 비 단핵 세포가있을 수있다. 그러나 6-7일의 분화 단계 후, 준비는 주로 추가로 인해 플라스틱 표면에 자신의 준수, 임의의 오염 세포에 의해 공유되지 않는 기능 (그림 4A에 농축 될 수있다 성숙한 대식 세포 (그림 3)으로 구성 및 B). 뻗어 스핀들 같은 표현형 (그림 4C와 D)와 세포도 있습니다 동안 한 번 식세포의 대부분은 고전적인 &quot;기름에 튀긴 된 계란&quot;형태를 보여, 도금. 이 세포질과 접착 클러스터 내에서의 F-액틴 분포 미러링됩니다. 분화 된 세포성숙한 대식 세포 (그림 5)에 대한 일반적인 지표 인 CD45, CD14, CD16, CD206 (만노스 수용체), CD11b를 발현과의 CD11c을 특징으로한다. 는 CD11b의 존재는 세포가 수상 세포 마커 CD209 (DC-SIGN)에 대한 부정적인 있다는 사실에 의해지지된다 주로 수지상 분화 대해 주장한다. 분화 과정 후 세포가 기능적는 AM 염색 및 종양 세포에서 창고 외 소포를 취할 수있는 능력을 칼 세인으로 시각화 할 수있는 약 5-7일 (그림 6)에 대한 대사 적으로 활성 상태로 유지됩니다. 또한, 세포는 여전히 몇몇 염증성 유전자 (도 7)의 발현을 초래 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)와 함께 자극, 예를 들면 도시 한 바와 같이 활성화 될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 51,554 / 51554fig1highres.jpg&quot;너비 = &quot;500&quot;/&gt; 이중 밀도 구배 원심 분리 후도 1 모양 및 PBMC-의 조성 및 단핵구 층. 이소 삼투 퍼콜 원심 후 피콜 구배 및 (D) 단핵구 단계 이후 (A) PBMC 대역을 나타낸 사진. cytospin의 (B, C) ​​PBMC 분획 제제 및 나머지 (E, F) 단핵구의 월 - Gruenwald 시약 염색. 200 B와 E의 μm의는, C와 F에서 50 μm의 = = 스케일 바 <img alt="그림이" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> 단핵 세포와 대 식세포의 그림 2 수율. 대표 세포 격리 된 단핵구의 countings 20 버피 코트 홍보의 대 식세포eparations. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> 현미경 사진도 3 (A) 및 후 (B) 대 식세포 및 단핵구 분화 이전 식세포. 단핵 세포 현탁액의 위상차 현미경의 셀 크기 측정. 단구 (C) 및 대 식세포 (D)의 셀 크기 히스토그램 대응. 스케일 바 = 100 μm의. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> 그림 4 형태와 부착 대 식세포의 세포 골격 조직. (A) 전에 식세포의 위상차 현미경 및 비 adheren의 후 (B) 제거t 세포. 부착 성, 비 자극 된 대 식세포에서의 사상의 액틴 (C, D) Phalloidin TRITC-염색. 스케일 바의 AC = 100 μm의, D. 20 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 차별화 된 대 식세포의 면역 표현형 5. FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 가방에 분화 육일 후 대 식세포의 유동 세포 계측법 분석 (빨간색으로 표시). 해당 이소 컨트롤이 회색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 대 식세포에 의한 종양 세포의 마이크로 소포도 6 통풍. PKH26로 표지 (적색 형광) 종양 세포 유래 마이크로 소포에 박람회 후 부착 식세포의 현미경 사진. 이미지는 생존의 염료 칼 세인 AM을 해당 (A) 시야 또는 (B) 세포질 염색에 오버레이됩니다. 스케일 바는 100 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> 그림 7 IL-1 β의 상향 조절, Wnt5a, TNFα, IL-6, MMP-2, MMP-7 및 MT1-MMP stimu 후24 시간. 유전자 발현을위한 LPS (100 ng의 / ㎖)와 대 식세포 만큼은 전체 RNA 샘플 (A) 및 HPRT1 GNB2L1 및 발현에 정규화에서 정량적 RT-PCR에 의해 측정 하였다. 도시 된 값은 미처리 컨트롤에 비해 배 변화되어하는 (N, ± SD 수단 = 5 * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). LPS 자극 하에서 TNFα 및 IL-6 유도는 또한 (± SD 수단 * p &lt;0.05), ELISA (B)에 의해 확인되었다.

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

이 절차의 전반적인 목표는 표준 실험실 장비를 사용하여 고품질의 인간 대식세포를 대량으로 생성하는 것입니다. 이는 먼저 Ficoll gradient를 사용하여 Buffy coat의 혈액을 원심분리함으로써 PBMC를 수집함으로써 달성됩니다. 그 다음, Percoll gradient를 사용하여 단핵구를 림프구로부터 분리합니다.그런 다음 단핵구를 테플론 코팅된 세포 배양 백에 파종하고 분화시킵니다. 6~7일 후, 대식세포를 수확하여 후속 연구를 위해 파종합니다. 이렇게 얻은 세포는 성숙한 대식세포의 전형적인 마커를 발현해야 하며, 종양 세포와의 공동 배양 또는 LPS 자극과 같은 다양한 자극에 반응해야 합니다. 역류, 원심분리 또는 자기 활성 세포 분류와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 고가의 시약이나 장비 없이 표준 실험실 장비만으로 인간 대식세포를 생성할 수 있다는 점입니다.이 방법은 수행하기 쉽지만, 이 방법이 처음인 사람은 밀도 구배 내에서 서로 다른 세포군을 시각화하고 분리하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 이러한 단계들을 시각적으로 시연하는 것이 이러한 어려움을 극복하는 데 도움이 될 것입니다. 로터의 균형을 더 쉽게 맞추기 위해 이 프로토콜은 두 개의 샘플로 중복 수행합니다.층 분리된 혈액에서 얻은 buffy coat 분획 두 봉지를 소독하는 것으로 시작합니다. 그런 다음, 각 buffy coat를 50 milliliter 튜브 두 개에 옮깁니다. 1.077 grams per milliliter 농도의 상온 FI call solution 15 milliliters를 담은 50 milliliter 튜브 세 개를 준비합니다.이제 천천히 주의하여, FI call의 각 튜브에 puffy coat 30 to 35 milliliters를 층지게 쌓습니다. 층이 섞이지 않도록 주의하며, 이 튜브들을 제동 없이 400 G에서 30분 동안 원심분리합니다. 실온에서 두 층 사이에 말초혈액 단핵세포의 흰색 띠가 형성될 것입니다.플라스틱 피펫을 사용하여 이 층들을 제거합니다. 각 공여자의 튜브 3개에 있는 층들을 공여자당 두 개의 50 milliliter 튜브에 합칩니다. 40 milliliter 표시선까지 1 millimolar P-B-S-E-D-T-A를 추가하여 수집된 세포를 세척한 후, 상온에서 300 G로 10분 동안 원심분리합니다.이제 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 세척 과정을 반복하고, 각 공여자로부터 얻은 펠렛을 P-B-S-C-D-T-A로 재현탁한 뒤 하나로 모으고, 페놀 레드(phenol red)가 포함되지 않은 20 milliliters의 RPMI 및 FCS를 추가합니다. 이제 공여자당 하나의 세포 튜브가 준비되어야 합니다.이제 50 mL 튜브에 실온의 Percoll 용액 23.13 mL와 10X PBS 1.87 mL를 섞어 두 번째 밀도 구배 혼합액을 준비합니다. 샘플 2개당 하나의 혼합액 튜브를 준비하십시오. 그다음, 혼합액 23 mL를 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다.그 다음 phenol red가 포함된 FCS 첨가 RPMI 27 milliliters를 추가합니다. 결과적으로 세포당 46%ISO 삼투압 용액이 됩니다. 이제 각 공여체 이식을 위해, 46% 용액 25 milliliters를 50 milliliter 튜브에 옮기고 그 위에 세포 혼합물을 조심스럽게 층을 이루어 쌓습니다.두 층은 경계면의 끊어짐 없이 색상으로 구분되어야 합니다. 상온에서 550 G로 30분 동안 세포를 원심분리합니다. 두 층 사이에 단핵구의 흰색 링이 형성됩니다. 플라스틱 피펫을 사용하여 이 세포들을 50 milliliter 튜브에 수집합니다.50 mL 표시선까지 채운 1 mM PBS-EDTA로 단핵구를 세척합니다. 그다음 실온에서 400 G로 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 뒤 펠렛 형태의 단핵구를 20 mL의 배지에 다시 현탁합니다. 그런 다음 다음 섹션으로 진행하십시오.본 프로토콜에서는 FEP Teflon 코팅 배양 백을 배양 챔버로 사용합니다. 먼저 수집된 단핵구의 수를 추정하는 것으로 시작하십시오. 단핵구는 크기가 크고 종종 불규칙한 모양을 띱니다.크기가 작은 림프구는 계산하지 마십시오. 한 명의 공여자로부터 100~150 million 개의 세포를 확보할 수 있는 경우, 보충제가 첨가된 RPMI 180 milliliters를 준비합니다. 세포 수가 이보다 적은 경우, 30~50 million 개의 세포당 30 milliliter 부피의 배지를 준비하십시오.20 mL 분주액에서 준비된 배지 180 mL에 세포를 조심스럽게 혼합합니다. 그런 다음 배양 백의 플러그에 50 mL perfu 주사기를 연결하여 세포를 배양 백에 주입합니다. 주사기를 제거하고 남은 공기를 밀어낸 후, 원추형 캡으로 플러그를 밀봉합니다.이제 백을 5% carbon dioxide 조건에서 6~7일 동안 배양합니다. 6~7일간의 배양 후, 세포를 수확하기 위해 배양 백을 얼음으로 옮깁니다. 백을 얼음에 완전히 담가 1~3시간 동안 냉각시켜 세포를 분리합니다. 다음으로, 백을 가장자리에 대고 부드럽게 약 10회 정도 당겨줍니다.그런 다음 백의 외부를 철저히 소독합니다. 플러그 콘을 50 milliliter 주사기로 교체합니다. 이어서 세포 현탁액을 뽑아내어 50 milliliter 튜브로 옮깁니다.모든 튜브를 수집한 후, 상온에서 400 G로 10분 동안 원심 분리합니다. 이제 상층액을 흡입하여 제거하고 모든 세포를 10 milliliters의 RPMI 및 FCS 혼합액에 모읍니다. 그런 다음 이전과 동일하게 세포 수를 측정합니다. 잔류 림프구가 존재할 수 있으므로 대식세포만 측정하십시오.그 후 배양 백을 재사용하기 위해 원하는 용도의 세포를 사용하십시오. 70% ethanol로 두 번 세척합니다. 그런 다음 70% ethanol 50 milliliters를 채우고 실온에서 하룻밤 동안 배양한 뒤, 다음 날 멸균 PBS로 백을 세 번 헹굽니다.그런 다음 멸균지로 감싸 오토클레이브로 멸균합니다. 백은 밀도 구배 원심분리를 최대 10회까지 쉽게 재사용할 수 있습니다. 원심분리를 수행하면 림프구와 단핵구가 포함된 흰색 인터페이스 층이 형성됩니다.여기에서는 첫 번째 밀도 구배를 살펴봅니다. May Grunwald 염색을 통해 이 세포들이 림프구의 전형적인 특징인 높은 핵-질 비율과 단핵구의 전형적인 특징인 강낭콩 모양 또는 고리 모양의 핵을 모두 가지고 있음을 확인할 수 있습니다.이 염색 결과는 두 번째 밀도 구배 원심분리의 결과를 보여줍니다. 각 버피 코트(buffy coat)에서는 약 150 million 개의 단핵구가 얻어지며, 이는 약 70 million 개의 대식세포로 분화될 수 있습니다. 20건의 준비 과정에서 단핵구의 47%가 대식세포가 되었습니다.정제된 대식세포는 플라스틱 표면에 부착되는 성질을 이용해 추가로 농축할 수 있으며, 이는 오염 세포들이 가지고 있지 않은 특성입니다. 플레이팅 후 대부분의 대식세포는 달걀 프라이 모양의 형태를 보이며, 일부는 길게 늘어난 방추형 표현형을 나타냅니다. 이 세포들은 여러 마커의 발현으로 특징지어집니다.성숙한 대식세포의 전형적인 특징입니다. CD 11 B의 발현과 CD 2 0 9 발현의 부재는 수지상세포로의 분화가 아님을 나타냅니다. 분화 후, 세포들은 5~7일 동안 기능적 및 대사적으로 활성 상태를 유지합니다.생존 세포의 칼슘 염색을 통해 종양 세포에서 방출된 적색 표지 extracellular vesicles를 흡수하는 능력을 확인할 수 있습니다. 또한, 대식세포를 활성화할 수 있으며, 예를 들어 lipopolysaccharide 자극은 여러 염증성 유전자의 발현을 유도합니다. 이 절차를 거친 후, 분리된 대식세포를 활용해 광범위한 기능 분석을 수행함으로써 건강 및 질병 상태에서의 대식세포 생물학에 관한 기초적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면 다량의 인간 대식세포를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 다만, 잠재적으로 감염성이 있을 수 있는 인간 혈액 샘플을 다루고 있다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 면역자기 음성 분리를 통해 전인의 혈액에서 단핵구를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 단핵구는 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

면역자기 음성 선택에 의한 전혈에서 단핵구의 분리

이 비디오는 일차 단핵구를 대식세포로 프라이밍하는 방법을 보여줍니다. 1차 인간 단핵구는 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF)를 사용하여 M1-like 전염증성 표현형으로 분리 및 분화할 수 있으며, 대식세포 집락자극인자(M-CSF)를 사용하여 M2-like 항염증성 표현형으로 분화할 수 있습니다.

In Vitro Culture and Differentiation of Primary Monocytes into Macrophages

이 비디오에서는 말초 혈액 유래 단핵구를 M1 또는 M2 대식세포로 분화 및 분극을 유도하는 절차를 보여줍니다. 과립구-대식세포 집락자극인자, 지질다당류, 인터페론-감마를 이용한 배양은 전염증성 M1 대식세포를 생성하고, 대식세포 집락자극인자와 인터루킨-4를 사용한 배양은 항염증성 M2 대식세포 생산을 유도합니다.

Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운...

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

M2 와 같은 종양 관련 대식세포 (TAM)는 암에서 종양 진행 및 가난한 예후와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 THP-1 단핵세포와 같은 세포를 14일 이내에 M2와 같은 대식세포로 재현가능하게 분화하고 편광하는 상세한 가이드의 역할을 합니다. 이 모델은 종양 미세 환경 내에서 TAM의 항염증 효과를 조사하는 기초가 된다.

인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

여기에서는 현재 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 개선하고 추가 연구를 촉진하는 것을 목표로 in vitro 임플란트 표면의 면역 조절 가능성을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 분비 사이토카인 프로파일, mRNA 발현 및 세포 표면 마커는 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하여 모니터링하여 티타늄에서 배양된 대식세포 분극을 조사했습니다.

임플란트 표면의 M1 및 M2 인간 단핵구 유래 대식세포의 분극 및 특성화 

여기에서는 3차원(3D) 콜라겐 I 매트릭스에서 1차 인간 단핵구 유래 대식세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 조사하기 위한 프로토콜을 제시하며, 미세환경의 용해성 및 물리적 특성이 세포 침입에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

배우세요 이중 밀도 그라데이션 원심 분리법을 사용하여 버피 코트에서 단핵구를 분리하고 테프론 코팅 배양 가방에서 대식세포로 분화시키는 방법을. 표준 실험 장비로 고품질의 인간 대식세포를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

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