정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

이 절차의 전반적인 목표는 QPCR 기반 어레이의 빠르고 안정적인 자동 설정을 허용하는 것입니다. 이는 먼저 어레이에 대한 프라이머 세트를 준비하고 스크리닝할 샘플 마스터 믹스를 설정하여 수행됩니다. 다음으로, 자동화된 로봇 PCR 설정 또는 매트릭스 전자 피펫 시스템을 사용하여 384웰 플레이트의 각 웰에 Eloqua 샘플 마스터 믹스 및 프라이머 세트를 정확하게 주입합니다.

준비가 완료되면 384웰 PCR 반응은 광 사이클러 4개의 80 사이버 기반 PCR 프로그램으로 실행됩니다. 절차의 마지막 단계는 QPCR 데이터를 분석하고 각각 특정 mRNA를 표적으로 하는 테스트된 각 프라이머 쌍에 대한 상대적 발현 수준을 결정하는 것입니다. 궁극적으로 대규모 mRNA 세트의 발현 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

따라서 특별히 개발된 어레이는 QPCR 기반 프로파일링을 통해 바이러스 감염의 핵심이 되는 전체 pre micro RNA 프로파일, 특정 경로 또는 분자를 표적으로 할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 노스캐롤라이나 대학교 채플힐 캠퍼스 미생물학 및 면역학과의 더크 DMA입니다. 오늘은 실시간 QQPC rra를 설정하는 방법과 두 가지 방법을 보여드리겠습니다.

하나는 불규칙한 피펫을 사용하는 것이고 다른 하나는 로봇을 사용하는 것입니다. 당사는 이 기술을 사용하여 인간 종양에서 pre microRNA와 성숙한 microRNA를 측정합니다. 오늘 시연은 Pauline Chu와 Kristen bu가 할 것입니다.

시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 96에 186개의 프라이머 쌍이 포함된 프라이머 플레이트를 검색합니다. 0.5 picaMoles의 Well 형식은 섭씨 영하 20도에서 저장됩니다.

판을 실온에서 해동한 후 잠시 와류와 원심분리를 합니다. 또한 각 96웰 프라이머 플레이트를 설정하기 위해 실온에서 PCR 혼합물을 2회 해동하고 4개의 마스터 믹스 튜브가 필요합니다. 4개의 2밀리리터 einor 튜브 각각에 4마이크로리터의 사이버 그린 믹스, 3마이크로리터의 PCR 등급 물, 10-20나노그램의 샘플 DNA 또는 CDNA를 결합하여 마스터 믹스를 준비합니다.

각 튜브에는 약 100회 반응에 충분한 마스터 믹스가 함유되어 있어 피펫팅 폐기물을 과도하게 사용할 수 있어야 합니다. 혼합하기 위해 einor 튜브를 소용돌이치십시오. 로봇을 초기화하고 EVO 마모 프로그램을 로드하여 자유 Tecan EVO 로봇을 사용하여 전구체 마이크로 RNA 분석 설정을 시작합니다.

그런 다음 30ml의 시스템 액체로 로봇을 세 번 세척하여 파이펫팅 정확도를 방해하는 기포를 제거합니다. 다음으로, 384웰 플레이트와 96웰 프라이머 플레이트를 포함하도록 로봇 플랫폼을 설정합니다. 마스터는 2% 표백제가 포함된 물통, 채워진 시스템, 유체 용기 및 빈 폐기물 용기를 혼합합니다.

프로그램 끝에서 run 을 두 번 선택하여 자동화된 로봇 실행을 시작합니다. 384웰 플레이트를 제거하고 라이트 사이클러 4개의 80 천장 호일로 밀봉합니다. 그런 다음 플레이트를 원심 분리합니다.

밀봉된 384웰 플레이트를 호텔의 위치 1에 간단히 놓습니다. 그런 다음 새 마스터 믹스와 새 384웰 플레이트를 사용하여 프라이머 플레이트 2에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 결과적으로 밀봉된 384 월드 플레이트를 호텔의 위치 2에 놓습니다.

호텔에서 라이트 사이클러를 로드하기 위한 새로운 EVO 마모 프로그램을 열고 사이클링 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 실행을 두 번 선택합니다. Freedom Evo는 각 플레이트를 라이트 사이클러에 자동으로 로드하고 사이버 그린 원 HRM 사이클링 프로그램을 실행합니다.

완료되면. 로봇 사용의 대안으로 서면 프로토콜에 설명된 대로 결과를 검토하고 분석합니다. 매트릭스 전자 멀티채널 피펫을 사용하여 마스터 믹스 튜브 ONE의 내용물을 저장소에 넣기 시작할 수 있습니다.

전자 피펫을 16마이크로리터의 마스터 믹스를 2개의 8마이크로리터 분주 단계로 흡입한 후 퍼지 단계로 설정합니다. 파이펫을 설정한 후 16마이크로리터의 마스터 믹스를 흡입하고 384 휠 플레이트에 분배하기 시작합니다. 행 A에서 O를 사용하여 처음 8마이크로리터를 열 1의 다른 모든 행에 분배하고 다음 열은 비워 둡니다.

두 번째 8마이크로리터를 3열의 동일한 행에 분배합니다. 그런 다음 폐기물 용기 위로 퍼지하고 대체 행과 대체 열을 남기는 이 패턴에 따라 팁을 폐기합니다. 플레이트를 가로질러 5회 더 분주하여 마스터 믹스 2를 피펫팅합니다.

마스터 믹스 1과 동일한 행을 사용하되 2열부터 시작합니다. 마스터 믹스 3과 4에 대해이 절차를 반복하십시오., 각각 열 1과 2부터 시작, 그러나 이번에는 프라이머 플레이트의 P.Her 인용에 로즈 B를 사용하여. 전자 피펫을 설정하여 2마이크로리터를 흡입하고 퍼지 단계를 따라 2마이크로리터를 분주합니다.

96웰 프라이머 플레이트의 컬럼 1열 A에서 H까지 2마이크로리터의 프라이머를 384웰 플레이트 중 하나인 다른 모든 열 컬럼으로 옮기고 폐기물 용기를 퍼지하고 팁을 폐기합니다. 1열과 2열의 나머지 3개 마스터 믹스에 대해 쿼트 프라이머에 대해 이 패턴을 반복합니다. 그런 다음 각 프라이머 컬럼에 대해 384웰 플레이트의 2개 컬럼마다 이동하는 96웰 프라이머 플레이트의 2열에서 12열에 대해 이 프로세스를 계속합니다.

다음으로, 가벼운 사이클러 천장, 호일 및 원심 분리기로 플레이트를 밀봉합니다. 원심분리 후 짧게. 플레이트를 라이트 사이클러 four 80에 놓고 사이버 그린 원 HRM 감지 형식을 사용하여 플레이트를 순환합니다.

이전과 동일한 사이클링 조건을 사용하여 새로 준비된 마스터 믹스를 사용하여 프라이머 플레이트 2 Eloqua를 새 384웰 플레이트에 사용하여 이 절차를 반복합니다. 전구체 마이크로 RNA 서명은 새로운 QPCR 기반 어레이를 사용한 프로파일링을 통해 나타납니다. U 6으로 정규화된 평균 델타 CT를 계산하고 표준화된 값을 배열에 로드했습니다.

히트 맵으로 표시되는 세 개의 고유한 클러스터를 생성하는 사소한 소프트웨어입니다. 각 전구체 마이크로 RNA의 상대 발현은 빨간색과 파란색으로 표시되어 각각 상대 발현의 증가와 감소를 나타냅니다. 색상 강도는 표정 변화의 정도를 나타냅니다.

대부분의 전구체 microRNA는 예상대로 작고 미미한 변화를 겪었습니다. 그러나, precursor microRNAs의 작은 부분은 시간 과정 실험 전반에 걸쳐 현저하게 증가했다. 또한, 일부 전구체 microRNA의 상대적 수준은 급격히 감소했습니다.

어떤 경우에는 그렇습니다. 또한 히트 맵 해석에서 함께 클러스터링됩니다. 실험에 따라 바이러스 감염, 세포 유형, 전구체 microRNA 또는 전구체 microRNA의 특이적 발현에 의존하는 클러스터가 나타날 수 있으며, 이는 공통 분자 또는 신호 경로에 의해 조절됩니다.

Posey 육종 관련 헤르페스 바이러스 음성 샘플의 평균 주기 역치 또는 cts가 표시되어 있습니다. 중요한 것은 Kaposi의 육종 관련 헤르페스 바이러스 잠복기 관련 핵 항원 또는 KSHV Lana가 매우 민감한 QPCR 어레이에 의해 이 샘플에서 검출되지 않았다는 것입니다. 그러나, 내부 대조군 U 6 및 let 7 a 높게 발현된 인간 전구체 마이크로 RNA는 모두 검출 가능한 수준으로 발현되었다.

마지막으로, 예상대로 PCR 등급의 물의 음성 대조군은 A-Q-P-C-R 생성물을 생성하지 않았습니다. 두 개의 서로 다른 프라이머에 대한 용융 곡선 분석. 동일한 샘플링 중복을 사용하는 것이 표시됩니다.

두 프라이머 쌍의 용융 온도가 다르다는 것은 분명하지만 샘플은 각 반복에 대해 정확히 동일한 온도에서 용융됩니다. 불량하거나 오염 가능성이 있는 샘플의 징후에는 두 가지 다른 입력 소스의 존재를 암시하는 여러 용융 피크가 포함될 수 있습니다. 지금까지 로봇을 사용하여 실시간 QPCR 실험을 설정하는 방법을 보여드렸습니다.

모든 통제와 가능한 한 많은 하우스키핑 유전자를 포함하는 것이 중요하다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.