효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내 확장

이 절차의 전반적인 목표는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하여 입양 면역 요법에 잠재적으로 활용 가능한 인간 항원 특이적 CTL을 ex vivo로 증식시키는 것입니다. 이는 먼저 HLA-A2 IgG와 항-인간 CD28 단클론 항체를 자기 다이나비드(dynabeads)에 접합하여 aAPC를 제작함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 aAPC의 품질 관리 및 펩타이드 로딩을 수행하는 것입니다. 세 번째 단계는 인간 말초혈액에서 CD8 양성 T 세포를 분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 CD8 양성 T 세포를 aAPC와 함께 일주일 동안 배양하는 것입니다.

그 후 CTL을 회수하고 특성을 분석하며, 이를 그대로 사용하거나 원하는 수준의 특이성과 증식도를 달성하기 위해 일주일 더 재자극합니다. 최종적으로, AAPC 존재 하에 증식된 CTL이 항원 특이성이 증가했음을 보여주는 분석 또는 염색 결과를 얻을 수 있습니다. 오늘은 HI IgG 기반의 AAPC 시스템과, 기존의 다른 방법들과 비교하여 이 시스템을 이용해 CMV 특이적 인간 CTL을 ex vivo에서 효율적으로 증식시키는 방법을 보여드리겠습니다.

당사의 A A PC 기술은 여러 가지 중요한 장점을 제공합니다. 기성품으로 즉시 사용 가능하며, 수량에 제한이 없고, A A PC는 모든 HRAA two 양성 공여자에 사용할 수 있습니다. 이제 시작해 보겠습니다. 약 400 million beads가 포함된 스톡에서 M four 50 epoxy beads 1 mL를 멸균된 스크류 캡 유리 바이알로 옮기십시오.

boid buffer 1 mL를 첨가한 후, 비즈가 바이알 벽면에 부착된 상태에서 유리 바이알을 dyin all magnet NBC one에 밀착시켜 비즈를 1회 세척합니다. 흡입법으로 상층액을 제거합니다. boid buffer, HLA A two IG dimer 및 anti-human CD 28 단일클론 항체 혼합액에 비즈를 재현탁합니다.

그 다음, 단백질과 비드의 결합을 촉진하기 위해 글라스 바이알을 로테이터에 넣고 4 °C에서 24시간 동안 회전시킵니다. 이어서, 튜브를 MPC 마그넷에 배치하고 보레이트 완충액을 모두 제거합니다. 완충액을 제거한 후, 1 mL의 비드 세척 완충액으로 비드를 두 번 세척합니다.

이제 비드를 1 mL의 비드 세척 버퍼에 넣고 4 °C에서 24시간 동안 추가로 회전시켜 비드의 잔류 단백질 결합 부위를 블로킹합니다. 그런 다음 유리 바이알에서 버퍼를 제거하고 1 mL의 신선한 비드 세척 버퍼로 교체합니다. FAX 세척 버퍼 100 µL를 FAX 튜브로 옮긴 후, 5 × 10⁵개의 비드를 추가합니다.

비즈에 anti muse IgG 1 µL, PE 1 µL 및 anti muse IgG 2 1 µL를 첨가하여 4 °C에서 20분간 염색합니다. 각 염색 시료에 FACS 세척 완충액 3 mL를 추가합니다. 그 후, 4 °C에서 300 ×g로 5분간 원심분리하여 A A PC를 펠렛화합니다.

A A PC를 신선한 fax 버퍼에 다시 현탁하고, 유세포 분석기로 염색 결과를 즉시 측정합니다. 이전과 같이 멸균된 PBS로 비드를 두 번 세척합니다. 다음으로, 비드에 CMV 펩타이드 10 µL를 로딩합니다.

혈구계수기(hemo cytometer)로 비드의 수를 센 다음, 날짜와 비드 농도를 표시하십시오. 단위는 mL당 비드 수로 표기합니다. A A PC를 펩타이드와 함께 4 °C에서 최소 3일 동안 배양하십시오. HLA A two 양성 공여자의 신선한 말초혈액 약 100 mL를 10개의 소듐 헤파린 vacutainer 튜브에 나누어 담아 300 Gs에서 10분 동안 원심분리하십시오.

실온에서 흡입법을 통해 상층의 혈장층을 조심스럽게 제거합니다. 수집한 혈장만큼 멸균 PBS로 채운 후, 혈액을 멸균 T 75 배양 플라스크로 옮깁니다. 15 mL fial pack 플러스 4개의 50 mL 원추형 튜브에 모든 혈액을 수집한 후, 피펫팅을 통해 혈액과 PBS를 잘 섞어줍니다.

각 튜브의 fial 위에 혈구 30~35 milliliters를 천천히 층을 이루어 얹습니다. fial과 혈구 사이의 경계면이 뚜렷하게 유지되도록, 브레이크를 끄고 가속도를 최대한 낮게 설정하여 혈액과 fial 구배를 실온에서 500 GS로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝난 후 층 사이의 경계면이 명확하게 유지된 상태에서 상단의 혈장층을 흡입하여 제거한 다음, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 PBMC 층을 조심스럽게 흡입합니다. 흡입한 PBMC를 새로운 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 모든 PBMC를 수집한 후, 세포에 30 milliliters의 PBS를 가하고 원심분리합니다.

다음으로, 상층액을 버리고 펠릿을 세척합니다. 잔류 피브리노겐을 제거하기 위해 30 milliliters의 PBS로 한 번 더 세척한 후, Milton Human CD eight positive T-cell isolation kit를 사용하여 CD eight 양성 T세포 집단을 농축합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 CD eight 양성 T세포의 수를 측정하고, FACS 분석을 통해 순도를 확인합니다.

1 x 10⁶개의 CTL을 8 mL의 T-cell growth factor 2x 배양 배지와 8 mL의 완전 RPMI 배지에 현탁한 후, 1 x 10⁶ AP C mix를 첨가합니다. 그다지 멀티채널 파이펫을 사용하여 96웰 U-bottom 조직 배양 플레이트의 웰당 160 µL의 세포를 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 7일 동안 배양합니다.

4일 차에 웰당 80 µL의 T-cell growth Factor 2 배양액을 세포에 공급합니다. 7일 차에 세포를 수확한 후, 모든 비드가 바이알 벽면에 부착될 때까지 자석에 대어 기존의 A A PC를 제거합니다.

세포를 수확하여 다른 50 milliliter 원뿔형 튜브로 옮긴 후 세포 수를 측정합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 테트라머 염색을 통해 A A PC의 항원 특이성을 결정합니다. 동일한 조건에서 수확한 세포를 새로운 A A PC로 다시 배양하여 항원 특이성을 가진 세포 수를 증식시킵니다.

다음은 1주일간 배양 후 A A PC에 의해 생성된 CMV 특이적 CTL의 대표적인 테트라머 염색 결과입니다. 여기에 제시된 것은 A-A-P-C-C-M-V에 의해 생성된 CMV 특이적 CTL의 대표적인 세포내 사이토카인 염색 결과이며, 테트라머 염색을 통한 특이성은 61%였습니다. 이 방법은 최적의 배양 조건과 T 세포 기능 조절을 위한 요구 사항을 어떻게 확인할 수 있는지와 같은 T 세포 분야의 핵심 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다.

Lowly 방법은 바이러스성 질환 치료에 대한 통찰을 제공했습니다. 이는 암과 같은 다른 분야에도 적용될 수 있습니다.