효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내 확장

이 절차의 전반적인 목표는 인공 항원 제시 세포 또는 A PC를 사용하여 양자 면역 요법에 잠재적으로 사용할 수 있도록 인간 항원 특이적 CTL의 생체 외 확장을 위해 사용하는 것입니다. 이는 먼저 HLA A, 2 IG 및 anti-human CD 28 단클론 항체를 자기 dyna bead에 접합하여 A A PC를 만드는 방식으로 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 A PC의 품질 관리 및 펩타이드 로딩을 수행하는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 인간 말초 혈액 CD 8개의 양성 T 세포를 분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 CD 8개의 양성 T 세포를 일주일 동안 A PC와 함께 배양하는 것입니다.

그런 다음 CTL을 수확하고 특성화한 후 사용하거나 원하는 수준의 특이성 및 확장을 달성하기 위해 일주일 동안 다시 자극합니다. 궁극적으로, A A PC의 존재 하에서 팽창된 CTL이 항원 특이성이 증가한다는 것을 보여주는 teum 또는 staining 결과를 얻을 수 있습니다. 오늘은 HI IG 기반의 A A PC 시스템에 대해 알아보고, 이 시스템을 사용하여 CMV specific human CTL exvivo를 기존의 다른 방법과 비교하여 효율적으로 확장하는 방법을 보여드리겠습니다.

당사의 A A PC 기술은 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 그것은 사용 가능한 기성품이며, 수량에 제한이 없으며, A A PC는 모든 HRAA 두 명의 긍정적 인 기부자에 사용할 수 있습니다. 자, 이제 약 4억 개의 비드에서 M 4개의 50 에폭시 비드 1ml를 멸균 스크류업 유리 파일로 옮기는 것부터 시작하겠습니다.

1ml의 보이드 버퍼를 첨가하여 비드를 한 번 세척한 다음 비드가 바이알 측면에 부착된 상태에서 유리 바이알을 모든 자석 NBC 1의 염료에 놓습니다. 흡인 Resus에 의해 스내트를 제거합니다. boid buffer HLA A two IG dimer 및 anti-human CD 28 monoclonal antibody의 혼합물에 비드를 현탁시킵니다.

그런 다음 단백질에서 비드 접합을 촉진하기 위해 섭씨 4도의 회전체에서 유리 바이알을 24시간 동안 회전시킵니다. 다음으로, MPC one 자석에 튜브를 넣고 붕산염 완충액을 모두 제거합니다. 버퍼를 제거한 후 1ml의 비드 세척 버퍼로 비드를 두 번 세척합니다.

이제 1ml의 비드 세척 완충액에 비드를 배양하고 바이알을 섭씨 4도에서 24시간 동안 회전시켜 비드의 잔류 단백질 결합 부위를 차단합니다. 그런 다음 유리 바이알에서 버퍼를 제거하고 1ml의 새 비드 세척 버퍼로 교체합니다. 100마이크로리터의 팩스 세척 버퍼를 팩스 튜브에 옮긴 다음 다섯 번째 비드에 10을 5곱하기 추가합니다.

섭씨 4도에서 20분 동안 염색한 후 1마이크로리터의 안티 뮤즈 IgG, 1마이크로리터의 안티 뮤즈 IgG로 비드를 염색합니다. 3 밀리리터의 팩스 세척 버퍼에서 각 염색 샘플에 대한 버퍼. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 300Gs를 소비하여 AA PC를 펠릿화합니다.

Reus는 새로운 팩스 버퍼에 A A PC를 현탁시키고 유세포 분석기로 염색 결과를 즉시 읽습니다. 이전과 같이 멸균 PBS로 비드를 두 번 세척합니다. 다음으로, 비드에 10마이크로리터의 CMV 펩타이드를 로드합니다.

혈구 분석기로 구슬을 세고 구슬의 날짜와 농도를 표시하십시오. 밀리리터당 구슬로. 최소 3일 동안 펩타이드와 함께 A A PC를 섭씨 4도 원심분리에서 HLA A 2 양성 기증자로부터 약 100밀리리터의 신선한 말초 혈액을 300Gs로 10분 동안 배양합니다.

실온에서 흡인으로 상단 플라즈마 층을 조심스럽게 제거합니다. 수집된 혈장을 멸균 PBS로 교체하고 혈액을 멸균 T 75 배양 플라스크로 옮깁니다. 모든 혈액이 15ml의 피알 팩과 4개의 50ml 원뿔형 튜브에 모이면 피펫팅으로 혈액과 PBS를 잘 혼합합니다.

30-35 밀리리터의 혈액 세포를 각 튜브의 피알 위에 천천히 오버레이합니다. 혈관과 혈액 세포 사이의 계면을 뚜렷하게 유지하면서 실온에서 20분 동안 혈액 및 혈관 구배를 원심분리하고, 분리 및 가속도를 가능한 한 낮게 하여 층 간의 명확한 계면을 유지하기 위해 스핀 후 상단 플라즈마 층을 흡인한 다음 혈청학적 피펫을 사용하여 PBMC 층을 조심스럽게 흡인합니다. 모든 PBMC가 30ml의 PBS로 수확되어 세포로 전달되고 원심분리되면 PBMC를 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리합니다.

다음으로, supernat를 버리고 펠릿을 씻으십시오. 30 밀리리터의 PBS로 한 번 더 잔류 fi call을 제거한 다음 Milton Human CD 8 양성 T 세포 분리 키트를 사용하여 CD 8 양성 T 세포 집단을 농축합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 CD 8개의 양성 T 세포를 계수하고 팩스 분석으로 순도를 확인합니다.

8ml의 T 세포 성장 인자 2 x 배양 배지와 8ml의 완전한 RPMI 배지에 100만 CTL을 현탁시키고 6개의 A A PC 믹스 중 10을 1배로 첨가합니다. 그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 웰당 160마이크로리터의 세포를 96웰 U 하단 조직 배양 플레이트에 플레이트합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소에서 7일 동안 세포를 배양합니다.

4일째에 T 세포 성장 웰당 80마이크로리터를 세포에 공급합니다. 요인 2 x 배양 배지. 7일째에 세포를 채취한 다음 세포를 자석에 대고 모든 비드가 바이알 벽에 부착되면 오래된 A A PC를 제거합니다.

세포를 수확하여 다른 50ml 원추형 튜브로 옮기고 세포 수를 계산합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 테트라머 염색에 의한 A PC의 항원 특이성을 측정합니다. 동일한 조건에서 수확된 세포를 새로운 A A PC로 재생하여 증가된 세포 수를 항원 특이성으로 생성합니다.

다음은 일주일 배양 후 PC에서 생성된 CMV 특이적 CTL의 대표적인 테트라머 염색 결과입니다. 여기에 도시된 것은 A-A-P-C-C-M-V 특이도에 의해 생성된 CMV 특이적 CTL의 대표적인 세포 내 사이토카인 염색 결과는 tetramer staining에 의해 61%였습니다. 이 방법은 최적의 배양 조건 및 T 세포 기능 조절에 대한 요구 사항을 어떻게 식별할 수 있는지와 같은 T 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.

낮은 방법은 바이러스성 질병 치료에 대한 통찰력을 제공했습니다. 또한 암과 같은 다른 분야에도 적용될 수 있습니다.