Name: 효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내 확장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 학습하세요 HLA A2-Ig 기반 인공 항원 제시 세포를 이용한 인간 세포독성 T 림프구의 효율적인 체외 확장 방법입니다. 이 기술은 채용 면역요법을 위한 항원 특이적 T 세포 생성에 활용됩니다.

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우리는 도움이 토론을 위해 아론 Selya 감사하고 싶습니다. 이 작품은 JS, MO 수있는 존스 홉킨스 말라리아 연구소에서 시험 부여 및 국방 부여 PC 040,972학과에 NIH 부여 AI29575, CA108835, AI077097 지원했습니다

1. 만들기, HLA - A2 - IG 기반 aAPC <ol><li> 무균 borate 버퍼 준비 <ol><li> 0.1M를 만들기 위해 물에 붕산을 디졸브. 7.0 산도를 조정합니다. </li><li> 4 0.22μm 멸균 필터와 매장을 통해 필터 ° C. </li></ol></li><li> 무균 비드 와시 버퍼 준비 <ol><li> 956ml PBS w / O 마그네슘 또는 칼슘을 가져가라. </li><li> 30ml 인간 AB 혈청을 추가합니다. </li><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 2mM 최종 농도를 추가합니다. </li><li> 0.1gsodium azide를 추가합니다. </li><li> 4 0.22 μm의 살균 필터와 매장을 통해 필터 ° C. </li></ol></li><li> , 주식에서 약 400,000,000 구슬을 (비즈는 hemocytometer로 계산 가능) Invitrogen M - 450 에폭시 비즈의 1ml을 가지고, 살균, 스크류 최고 유리관에 넣어. </li><li> 비즈가 유리병의 측면을 준수하면서, Dynal 자석 MPC - 1에 대한 병을 넣어, 열망하여 뜨는을 제거하십시오. borate 버퍼의 1ml로 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 1ml borate 버퍼와 HLA - A2 - IG 이합체 및 안티 인간 CD28 mAb (클론 9.3) 20 μg 20 μg의 혼합물에 Resuspend 구슬. </li><li> 비드 활용하는 단백질 : 회전에 유리관을 넣고 4 회전 ° C를 24 시간 동안. </li><li> MPC - 1 자석에 튜브를 삽입하고 모든 borate 버퍼를 제거합니다. </li><li> 1ml 비드 와시 버퍼와 함께 두 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 1ml 비드 와시 버퍼에 비즈를 품어, 4 회전 ° C를 24 시간 동안. 비드 와시 버퍼 인간 AB 혈청가 포함되어 있기 때문에, 그것은 구슬의 모든 잔류 단백질 바인딩 사이트를 차단합니다. </li><li> 유리관에서 뜨는 제거 1ml 신선한 비드 와시 버퍼로 바꿉니다. </li></ol> 2. aAPC 및 펩티드 로딩, 저장 품질 관리 <ol><li> 외과 튜브의 버퍼를 세탁 100μl 외과에 ~ 5 × 10 5 구슬을 추가하고, 안티 - 마우스 IgG1 - PE의 1μl (HLA - A2 - IG의 FC 부분을 인식) 및 안티 마우스 IgG2a - FITC의 1μl (인식과 얼룩 안티 CD28 mAb의 FC 부분). 버퍼를 세척 외과에 20 분 얼룩 후, 흐름 cytometer (그림 4)에 의해 즉시 얼룩 결과를 다시 씻고 읽어보십시오. </li><li> 비즈에 펩타이드 로딩 : 1ml 멸균 PBS로 유리관에 두 구슬을 씻으십시오. 1ml 멸균 PBS로 Resuspend 다음 CMV 펩타이드 (1mg/ml)의 10μl 추가 </li><li> hemocytometer로 비즈를 카운트하고, 날짜와 농도로 병을 라벨. </li><li> aAPC는 HLA - A2 - IG 이합체에 펩티드 결합의 충분한 시간을 허용하는 4 최소 3 일 펩타이드 부화 ° C, 후 사용할 준비가되어 있습니다. 구슬이 4 저장할 수 있습니다 ° C와 적어도 6 달 동안 기능 남아있다. </li></ol> 3. 인간 CTL 절연 <ol><li> 10 BD 나트륨 헤파린의 Vacutainer 튜브로 건강한 HLA - A2 긍정적인 기증자 신선한 주변의 피 ~ 100ml를 수집합니다. 21 게이지 바늘 또는 용혈을 방지하기 위해 대형을 사용합니다. </li><li> 실온에서 10 분 300xg에서 원심 분리기 </li><li> 조심스럽게 흡인하여 최고 플라즈마 레이어를 제거합니다. 플라즈마는 문화 매체에 대한 보충으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 멸균 PBS로 수집 플라즈마를 교체하고 살균 T75 문화 플라스크 또는 50ml 원뿔 튜브에 혈액을 전송합니다. 물론 최대 pipetting 아래로 PBS로 피를 섞는다. </li><li> 일단 모든 혈액 수집, 4 개의 추가 50ml 원뿔 튜브를 준비하고 Ficoll - Paque 플러스의 15ml를 추가합니다. </li><li> 천천히 오버레이 각 튜브의 Ficoll 위에 혈액 세포의 30 35ml. Ficoll과 혈액 세포 사이의 인터페이스는 별도. </li><li> 실온에서 20 분 500xg에서 원심 분리기. 브레이크 "OFF"와 레이어 사이에 명확한 인터페이스를 유지하기 위해 가능한 한 낮은 가속을 켭니다. </li><li> seriological 피펫을 사용하여 조심스럽게 PBMC 층을 기음과 신선한 50ml 원뿔 관에 PBMC를 수집합니다. 모든 PBMC 10 분 400xg에서 PBS와 스핀의 30ml 추가 수확하는 경우. 뜨는을 취소하고 모든 잔류 Ficoll을 제거 30ml PBS로 한 번 더 씻는다. </li><li> Miltenyi 인간의 CD8 + 제조 업체의 프로토콜에 따라 T 세포 격리 키트를 사용하여 CD8 + T 세포 격리로 진행합니다. 세포 -이 키트는 매우 (보통&gt; 95%) CD8을 파괴하여 CD8 + 세포에 대한 풍요롭게. </li><li> CD8 + T 세포를 계산합니다. 예상 순도는 95 %보다 커야한다. 이 사용 2x10 5 세포를 확인하고 CD4/3/8 외과 분석을 수행합니다. 나머지 CTL은 어느 항원 특정 aAPC 자극에 바로 사용할 수있는 또는 그들은 나중에 사용하기 위해 냉동 수 있습니다. </li></ol> 4. 체외 aAPC 기반의 문화 시스템에서 <ol><li> 문화 매체 준비 <ol><li> TF (국가 실험실 4 만들어진 T 세포 성장 인자) 2X 문화 매체 : 전체 RPMI 미디어 플러스 플라즈마 및 8% T 세포 성장 인자 autologous 5 % 기증자. </li><li autologous inactivated ab></ol></li><li> 전체 RPMI 매체의 TF 2X 문화 매체 플러스 8ml의 8ml에 Resuspend 1,000,000 CTL은 추가 1 × 10 6 aAPC은 잘 섞는다. </li><li> 물론 96 U 바닥 조직 배양 플레이트에 플레이트 세포에 멀티 채널 pipetter을 사용합니다. (사람마다 물론 160 μl) </li><li> 37 문화 세포 ° C, 7 일 동안 5 % CO 2 incubater. 80 μl / 잘 TF 2X 매체와 일 4 세포를 공급. </li><li> 세포는 하루에 7 수확 될 준비가 된 것입니다. 수확 후, 자석에 대한 세포를 배치하고 기존 aAPC를 제거합니다. </li><li> 항원 특이성은 제조 업체의 프로토콜에 따라 tetramer의 얼룩에 의해 결정하실 수 있습니다. 표현형의 얼룩 및 세포내 시토킨 얼룩은 우리의 이전 연구 3에 따라 수행됩니다. </li><li> 수확 세포는 동일한 조건에서 다시 aAPC와 replated 수 있습니다. 휴대폰 번호 및 항원 특이성은 반복 자극 후 증가 예정입니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : HLA A2 - IG 및 안티 CD28 활용 이후 aAPC의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 성공적인 단백질 결합에 해당하는 항체 얼룩의 명확한 변화가 분명하다. 주변 혈액에서 CMV 특정 CTL의 빈도가 aAPC - 중재 자극의 단일 주 후, 일반적으로 0.5-1 %이지만, 특이성은 55 도달할 수 - 93% (그림 2 및 3). 항원 특정 CTL의 확장은 다른 기증자 사이에 가변 수 있지만 결과가 동일한 기증자 내에서 재현할 수 있습니다. 추정함으로써, CMV 특정 세포의 확장 전구체 수준을 직접 예 생체내 (데이터가 표시되지 않음)에 비해 배 수천 수 있습니다. 세포내 시토킨 얼룩 (그림 3) 이러한 확장 CTL은 polyfunctional보다는 지친 있으며, 연장 세포 배양과 상당한 확산 후. 것을 보여줍니다 <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. allogeneic HSCT의 입양 immunotherapy에 대한 인간의 CTL의 aAPC 기반 전직의 생체내 확장의 대표 플로우 차트 <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 문화 일주일 뒤에 aAPC에 의해 생성된 특정 CMV CTL의 그림 2. 대표 tetramer의 염색법 결과 <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. aAPC에 의해 생성된 특정 CMV CTL 대표 세포 시토킨 얼룩 결과 (CMV의 특이성 61 %입니다) <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. M - 450 에폭시 비즈 대표 얼룩 결과 반 마우스 IgG1 - PE 및 안티 마우스 IgG2 - FITC 물들일 단백질 활용 이후

<ol><li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li>
<li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer%3A+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li>
<li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+antigen-presenting+cells%3A+artificial+solution+for+real+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리가 여기서 설명 aAPC 시스템은 항원의 다양한 인간에 대한 CTL의 전직 생체내 확장을위한 효율적인 시스템입니다. 특별한주의가 96 - 웰 플레이트 문화 단백질 결합의 품질과 aAPC과 CTL의 균등과 관련하여 이동해야합니다. 우리는 백만 배 4 항원 특정 CTL을 확장하는 동안, 이상 8 주 CTL을 확대할 수있다이 방법을 사용합니다. 셀 라인 또는 기타 acellular 플랫폼 5 활용한 다양한 인공 APC 시스템이되었습니다 있지만, 모든 시스템 확장 및 특이성에 대해서는 서로 다른 애플 리케이션을 지원과 함께 독특한 프로필을 가진 게시된 데이터에 따르면. CTL의 품질 수량만큼이나 중요되기 때문에 중요한 것은, 우리의 시스템에서 발생하는 CMV 특정 CTL의 polyfunctionality이 우수한 안티 바이러스 효율성을 부여 것으로 예상된다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Vacutainer 튜브 (헤파린을 포함) </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> 인간의 CD8 + T 세포 격리 키트 </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads M - 450의 에폭시 </td><td> Invitrogen </td><td> 140.11 </td></tr><tr><td> Dynal MPC - 1 자석 </td><td> Invitrogen </td><td> 120 01D </td></tr><tr><td> Ficoll - Paque 플러스 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RPMI 배지 1,640 </td><td> Gibco </td><td> 11,875 </td></tr><tr><td> HLA - A2 - IG 이합체 X </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC tetramer (HLA - A2 - CMV) PE </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> 팰컨 분명 96 - 웰 플레이트 Microtest </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> 쥐 반대 마우스 IgG2a - FITC </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> 염소 방지 마우스 IgG1 - PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> 인간 혈청 타입 AB </td><td> 애틀랜타 생체 </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 - 인간 CD8a - FITC </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 - 인간 CD8a - APC </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 - 인간 IFNγ - FITC </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> 마우스 안티 - 인간 TNFα - PE </td><td> 백톤 디킨슨 </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

효율에 대한 hla - ig 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 ctl의> 확장

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

최적의 효과기 기능 CTL은 다양한 세포 내 감염 및 암에 대한 보호를 중재에 중요한 역할을 재생합니다. 그러나, 개인은 진압 면역 microenvironment을 전시 수 있으며, 활성화 CTL과는 달리 그들의 autologous 항원 제시 세포 tolerize하는 경향이 있거나 특정 항원 CTL을 anergize. 그 결과, 아직 실험 단계에 있지만, CTL 기반 입양 immunotherapy는 암 및 바이러스 감염 등 다양한 질환에 대한 유망한 치료되기 발전했습니다. 초기 실험에서 전 생체내 확대 CMV (사이토 메갈로 바이러스) 특정 CTL은 immunocompromised allogeneic 골수 이식 환자에서 CMV 감염의 치료에 사용되었습니다. 그것이 환자의 생명을 위협하는 CMV viremia의를하는 것이 일반적입니다받을 환자의 없음 CTL은 안티 CMV 내성이 adoptively 전송 CTL 1 설립 뜻, CMV와 관련된 질병을 개발 확대했습니다. 있지만 유망 결과는 흑색증에 대한 관찰되었으며 암이 다른 종류의 연장 수 있습니다. 인간의 CTL을 자극하고 확장 예 생체내 여러 가지가 있지만, 현재 방법은 비용과 기술적 한계에 의해 제한됩니다. 예를 들어, 현재의 금 본위 제도는 autologous DC의 사용에 따라 달라집니다. 이것은 각각의 환자가 leukocytes의 상당수를 기부 필요하며 비용도 아주 많이하고 힘드는입니다. 또한, DC 확장 CTL의 체외 특성화에 설명된이 단지 suboptimal 효과기 기능 3했다고 밝혔다. 우리가 입양 immunotherapy (그림 1) 인간 CMV CTL의 구체적인 예 생체내 확장을위한 고효율 aAPC 기반 시스템을 제시한다. aAPC 인간의 HLA - A2 - IG 이합체 및 안티 CD28mAb 4 셀 크기의 자석 구슬을 결합하여 만들어졌다. aAPC가 만들어진 후에는, 그들은 관심의 다양한 펩티드와 함께로드하고, 몇 달 동안 기능 유지하실 수 있습니다. 이 보고서에서는 aAPC는 CMV, pp65 (NLVPMVATV)에서 지배적인 펩타이드와 함께로드되었습니다. 일주일 동안 aAPC있는 건강한 기증자로부터 인간의 CD8 + CTL 투석을 culturing 후 CMV CTL은 특정 98% (그림 2) 특이성에 극적으로 증가하고 10,000 명이 넘는 배 증폭하실 수 있습니다. 더 CMV 특정 CTL이 필요한 경우, 추가 확장이 쉽게 aAPC과 반복적인 자극에 의​​해 얻을 수 있습니다. Phenotypic 및 기능 특성이 확장 세포 효과기 메모리 표현형을 가지고 있고 (그림 3) TNFα와 IFNγ 모두 상당한 금액을 보여줍니다.

유도 및 항원에 특정한 T 세포의 확장을위한 새로운 DC 독립적인 방법을 설명합니다. HLA A2 - IG 기반의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)을 효율적으로 다양한 항원 특이성의 CTL 확장 HLA - A2 제한 펩티드와 함께로드됩니다. 이 기술은 CTL 기반 입양 immunotherapy에 대한 잠재력을 보유하고 있습니다.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내</em인간 CTL의> 확장

최적의 작동 기능을 갖춘 세포독성 T 림프구(CTL)는 다양한 세포 내 감염 및 암에 대한 보호 작용을 매개하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 개인에 따라...

이 절차의 전반적인 목표는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하여 입양 면역 요법에 잠재적으로 활용 가능한 인간 항원 특이적 CTL을 ex vivo로 증식시키는 것입니다. 이는 먼저 HLA-A2 IgG와 항-인간 CD28 단클론 항체를 자기 다이나비드(dynabeads)에 접합하여 aAPC를 제작함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 aAPC의 품질 관리 및 펩타이드 로딩을 수행하는 것입니다. 세 번째 단계는 인간 말초혈액에서 CD8 양성 T 세포를 분리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 CD8 양성 T 세포를 aAPC와 함께 일주일 동안 배양하는 것입니다.그 후 CTL을 회수하고 특성을 분석하며, 이를 그대로 사용하거나 원하는 수준의 특이성과 증식도를 달성하기 위해 일주일 더 재자극합니다. 최종적으로, AAPC 존재 하에 증식된 CTL이 항원 특이성이 증가했음을 보여주는 분석 또는 염색 결과를 얻을 수 있습니다. 오늘은 HI IgG 기반의 AAPC 시스템과, 기존의 다른 방법들과 비교하여 이 시스템을 이용해 CMV 특이적 인간 CTL을 ex vivo에서 효율적으로 증식시키는 방법을 보여드리겠습니다.당사의 A A PC 기술은 여러 가지 중요한 장점을 제공합니다. 기성품으로 즉시 사용 가능하며, 수량에 제한이 없고, A A PC는 모든 HRAA two 양성 공여자에 사용할 수 있습니다. 이제 시작해 보겠습니다. 약 400 million beads가 포함된 스톡에서 M four 50 epoxy beads 1 mL를 멸균된 스크류 캡 유리 바이알로 옮기십시오.boid buffer 1 mL를 첨가한 후, 비즈가 바이알 벽면에 부착된 상태에서 유리 바이알을 dyin all magnet NBC one에 밀착시켜 비즈를 1회 세척합니다. 흡입법으로 상층액을 제거합니다. boid buffer, HLA A two IG dimer 및 anti-human CD 28 단일클론 항체 혼합액에 비즈를 재현탁합니다.그 다음, 단백질과 비드의 결합을 촉진하기 위해 글라스 바이알을 로테이터에 넣고 4 °C에서 24시간 동안 회전시킵니다. 이어서, 튜브를 MPC 마그넷에 배치하고 보레이트 완충액을 모두 제거합니다. 완충액을 제거한 후, 1 mL의 비드 세척 완충액으로 비드를 두 번 세척합니다.이제 비드를 1 mL의 비드 세척 버퍼에 넣고 4 °C에서 24시간 동안 추가로 회전시켜 비드의 잔류 단백질 결합 부위를 블로킹합니다. 그런 다음 유리 바이알에서 버퍼를 제거하고 1 mL의 신선한 비드 세척 버퍼로 교체합니다. FAX 세척 버퍼 100 µL를 FAX 튜브로 옮긴 후, 5 × 10⁵개의 비드를 추가합니다.비즈에 anti muse IgG 1 µL, PE 1 µL 및 anti muse IgG 2 1 µL를 첨가하여 4 °C에서 20분간 염색합니다. 각 염색 시료에 FACS 세척 완충액 3 mL를 추가합니다. 그 후, 4 °C에서 300 ×g로 5분간 원심분리하여 A A PC를 펠렛화합니다.A A PC를 신선한 fax 버퍼에 다시 현탁하고, 유세포 분석기로 염색 결과를 즉시 측정합니다. 이전과 같이 멸균된 PBS로 비드를 두 번 세척합니다. 다음으로, 비드에 CMV 펩타이드 10 µL를 로딩합니다.혈구계수기(hemo cytometer)로 비드의 수를 센 다음, 날짜와 비드 농도를 표시하십시오. 단위는 mL당 비드 수로 표기합니다. A A PC를 펩타이드와 함께 4 °C에서 최소 3일 동안 배양하십시오. HLA A two 양성 공여자의 신선한 말초혈액 약 100 mL를 10개의 소듐 헤파린 vacutainer 튜브에 나누어 담아 300 Gs에서 10분 동안 원심분리하십시오.실온에서 흡입법을 통해 상층의 혈장층을 조심스럽게 제거합니다. 수집한 혈장만큼 멸균 PBS로 채운 후, 혈액을 멸균 T 75 배양 플라스크로 옮깁니다. 15 mL fial pack 플러스 4개의 50 mL 원추형 튜브에 모든 혈액을 수집한 후, 피펫팅을 통해 혈액과 PBS를 잘 섞어줍니다.각 튜브의 fial 위에 혈구 30~35 milliliters를 천천히 층을 이루어 얹습니다. fial과 혈구 사이의 경계면이 뚜렷하게 유지되도록, 브레이크를 끄고 가속도를 최대한 낮게 설정하여 혈액과 fial 구배를 실온에서 500 GS로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝난 후 층 사이의 경계면이 명확하게 유지된 상태에서 상단의 혈장층을 흡입하여 제거한 다음, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 PBMC 층을 조심스럽게 흡입합니다. 흡입한 PBMC를 새로운 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 모든 PBMC를 수집한 후, 세포에 30 milliliters의 PBS를 가하고 원심분리합니다.다음으로, 상층액을 버리고 펠릿을 세척합니다. 잔류 피브리노겐을 제거하기 위해 30 milliliters의 PBS로 한 번 더 세척한 후, Milton Human CD eight positive T-cell isolation kit를 사용하여 CD eight 양성 T세포 집단을 농축합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 CD eight 양성 T세포의 수를 측정하고, FACS 분석을 통해 순도를 확인합니다.1 x 10⁶개의 CTL을 8 mL의 T-cell growth factor 2x 배양 배지와 8 mL의 완전 RPMI 배지에 현탁한 후, 1 x 10⁶ AP C mix를 첨가합니다. 그다지 멀티채널 파이펫을 사용하여 96웰 U-bottom 조직 배양 플레이트의 웰당 160 µL의 세포를 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 7일 동안 배양합니다.4일 차에 웰당 80 µL의 T-cell growth Factor 2 배양액을 세포에 공급합니다. 7일 차에 세포를 수확한 후, 모든 비드가 바이알 벽면에 부착될 때까지 자석에 대어 기존의 A A PC를 제거합니다.세포를 수확하여 다른 50 milliliter 원뿔형 튜브로 옮긴 후 세포 수를 측정합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 테트라머 염색을 통해 A A PC의 항원 특이성을 결정합니다. 동일한 조건에서 수확한 세포를 새로운 A A PC로 다시 배양하여 항원 특이성을 가진 세포 수를 증식시킵니다.다음은 1주일간 배양 후 A A PC에 의해 생성된 CMV 특이적 CTL의 대표적인 테트라머 염색 결과입니다. 여기에 제시된 것은 A-A-P-C-C-M-V에 의해 생성된 CMV 특이적 CTL의 대표적인 세포내 사이토카인 염색 결과이며, 테트라머 염색을 통한 특이성은 61%였습니다. 이 방법은 최적의 배양 조건과 T 세포 기능 조절을 위한 요구 사항을 어떻게 확인할 수 있는지와 같은 T 세포 분야의 핵심 질문에 답하는 데 사용될 수 있습니다.Lowly 방법은 바이러스성 질환 치료에 대한 통찰을 제공했습니다. 이는 암과 같은 다른 분야에도 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

여기가 첫 번째 좋은 생산 관행 (GMP)을 준수하는 탯줄 혈액, 주로 나이브 T 세포의 소스에서 바이러스 특정 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 생산 방법을 설명합니다.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

지침을 제시 세포 킬러 인공 항원의 생성을 위해 제시되고, KaAPC 인간 항원 특이적인 T 세포의 생체 외 고갈과 항원에 T 세포 - 매개자가 면역 질환의 치료를위한 세포 면역 요법에 대한 대안을위한 효율적인 도구 나머지 면역 체계를 손상시키지 않고 특정 패션.

효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC) 체외 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

이 논문은 정의된 동종항원에 특이적으로 반응하는 인간 T 세포 클론의 생성 및 증식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 펩타이드-MHC 리간드에 특이적인 인간 T 세포를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

여기서 우리는, 기존 TCR의 TCRα 또는 TCRβ 페어링 말초 T 세포 수용체 레퍼토리 상보 hemichain으로 관심 항원 특이성을 보유하여 항원 특이 적 T 세포 수용체 (TCR도)을 생성하는 신규 한 방법을 설명한다. 드 노보 생성 TCR도 선호도 변화와 항원 특이성을 유지한다.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

여기, 우리는 빨리 그리고 reproducibly 생물학적 영감, 생 분해성 유일 항 원 제시 세포 (aAPC) 가변 크기, 모양, 및 T 셀 확장 비보 전 또는 vivo에서 표면 단백질 프레 젠 테이 션을 생성 하는 프로토콜을 제시 .

이방성 고분자 인공 항 원 제시 세포 CD8 + T 세포 활성화의 제조

항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

이 프로토콜 사용을 설명 합니다 단일 체인의 MHC 종류 I 인간 CD8 + T 세포 활성화의 분자 상호 작용을 조사 하기 위해 단지: 조작된 항 단일 체인을 표현 하는 세포의 생성, 인간 CD8 + T 세포 복제의 문화 그리고 T 세포 활성화 실험입니다.

공동-agonism 인간 CD8 + T 세포 활성화에 조사를 단일 체인 MHC 기술의 사용

이 문서에서는 OP9/DLL1 공동 배양 시스템을 사용하여 기능성 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 CD8αβ+ 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 설명한다.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

제시된 감마델타(γδ) T 세포 약품의 확장을 위한 프로토콜이다. 림프구는 졸레드로닉산 및 인터류신-2로 농축된 용류 및 γδ에 의해 분리된다. 알파 베타 T 세포는 임상 급 자기 분리 장치를 사용하여 고갈된다. γδ 세포는 K562 유래, 인공 항원 제시 세포와 공동 배양되고 확장된다.

감마 델타(γδ) T 세포의 확장 및 농축

학습하세요 HLA A2-Ig 기반 인공 항원 제시 세포를 이용한 인간 세포독성 T 림프구의 효율적인 체외 확장 방법입니다. 이 기술은 채용 면역요법을 위한 항원 특이적 T 세포 생성에 활용됩니다.

효율에 대한 HLA - IG 기반 인공 항원 제시 세포 예 생체내 확장

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