Name: 인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 학습하세요 CD1d 기반 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 이용한 NKT 세포 확장 방법을. 말초혈액에서 NKT 세포를 활성화하고 고순도로 확장하여 면역치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 도움이 토론을 Priyanka Subrahmanyam 감사드립니다. 저자는 금융 관심을 경쟁 없습니다. 이 작품은 미국 암 학회, NIH / NCI K01 CA131487, R21 CA162273, R21 CA162277 및 P30 종양 면역학과 TJ 웹에 Immunotherapy 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 국립 암 연구소, 건강의 국립 연구소의 공식 전망을 대표하지 않습니다.

1. aAPC의 생성 <ol><li> 구슬에 단백질을 추가하기 전에 모든 시약 및 버퍼 준비 : 0.1M Borate 버퍼를, 1X D-PBS (NO 칼슘 2 +와 MG 2 +), 비드 워시 버퍼 (1X PBS 5% 인간 AB 혈청 + 0.02 % 나트륨 azide) , 전체 매체 (RPMI 매체 100 MM 나트륨 pyruvate, 10 MM 중요하지 않은 비타민 솔루션, 100 MM 가상 비타민 솔루션, 1 % 2 - 메르 캅토 에탄올, 10 μM의 * 시프로플록사신, 5 % 인간 AB 혈청), 맥 버퍼 (1 L PBS 무료 칼슘 2 +와 MG 2 +, 5g BSA, 2 mmol EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). </li><li> 5 ML 명확한 붕규산 유리 스레드 유리 병 3 ML 멸균 0.1 M Borate 버퍼 (붕산과 물, 산도 7.0-7.4) 1 개 ML Dynabeads M-450 에폭시 구슬을 씻어. </li><li> 1 ML PBS w / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 + : 별도의 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 100 μg hCD1d-IG 이량 체 및 20 μg의 costimulatory 분자 (안티 - CD28mAb 예를 들어)을 추가합니다. </li> &lt;리&gt; 장소 구슬 구슬의 자석 및 기음 borate 버퍼에 유리 병을 포함. 단계 1.2에서 유리관에 단백질 혼합물을 추가하고 캡을 교체하십시오. 반전 유리 병에 의해 즉시 혼합, 회전하는 것에 parafilm과 캡, 및 장소를 커버와 4 ° C.에서 하루 아침에 품다 </li><li> 조심스럽게 구슬을 피하면서 다음 날, 장소 유리 자석에 약병하고, 단백질 혼합물을 제거합니다. 3 ML 비드 세척 버퍼를 (PBS와 5퍼센트 AB 혈청 0.02 %의 나트륨 azide)을 추가, 5 분의 회선 근에 ° C 4에 잠복기로 구슬을 씻으십시오. 두 번 반복합니다. </li><li> 구슬이 구슬 세탁 혼합물에 저장 할 수 있습니다. 기능 aAPC을 만들려면, 작은 나누어지는를 제거하고 hemacytometer를 사용하여 구슬을 계산합니다. 단백질이 안정적으로 항체 (예 : PE-복합 안티 - 마우스 IgG1)으로 얼룩 및 흐름 cytometric 분석을 수행하여 구슬에로드되어 있는지 확인합니다. </li><li> 항원과 구슬을로드하려면, 5 X 10 7 구슬을 제거하고 작은 1.5 ML의 유리관에 추가, 1 ML 멸균 PBS로 구슬을 씻어. Resuspend 1 ML 멸균 PBS로 구슬을 씻고 및 항원 추가, 예 : α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml)을로드합니다. * 참고 : 우리는 지질 용해도 또는 마이셀 형성에 문제를 발견하지 않은 있지만, 지질은 제조업체의 권장 사항에 따라 처리해야합니다. 특히, KRN7000은 이러한 연구에 DMSO (1mg/ml)에서 재구성되었습니다. KRN7000 및 기타 glycolipid 항원은 0.2 MG / ML PBS는 0.5 %를 포함에 용해 될 수 십대 초반 - 2​​0 (2 시간을 sonicate. 37 ° C에서). 중요 - aAPC는 사용하기 전에 적어도 48-72 시간에로드해야합니다. </li></ol> 2. CD161 + 3 번 CD + 세포의 분리 <ol><li> 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMC)를 수집합니다. 버피 코트 나 leukopheresis 팩에서 림프구의 Ficoll 밀도 기울기 원심 분리 분리를 들어, 첫 번째 방 온도에서 1X PBS의 동일한 볼륨으로 heparinized 혈액을 희석. </li><li> Ficoll 15 ML (객실 온도로 예열) 50 ML 원뿔 튜브에 추가합니다. 천천히 오버레이25 Ficoll 상단에 희석 혈액 혼합물의 ML. 브레이크 해제로 실온에서 30 분에 2,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 파스퇴르 피펫으로 림프구 인터페이스 (미디어 및 Ficoll 사이에 하얀 링)을 제거하고 새로운 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> PBS로 50 ML에 튜브를 작성하고 5 분에 1,500 rpm으로 centrifuging하여 세포를 씻으십시오. 표면에 뜨는을 취소하고 단일 관에 한 개인의 튜브를 결합, 20 ML PBS로 다시 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMC)를 씻는다. 그런 다음 PBMC를 계산 5 X 10 7 세포 / 맥 버퍼에 ML의 농도에 resuspend (CA 2 단계 중 1 L PBS 무료 +와 MG 2 +, 5g BSA, 2 mmol EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). </li><li> T 세포 분획을 분리하기 위해, PBMC (10 8 셀) 2 ML로 시작하고 EasySep 인간 T 세포 농축 키트의 팬 T 세포 농축 솔루션 100 μl를 추가합니다. 10 분 동안 실온에서 알을 품다. </lI&gt; <li> 또 다른 10 분 동안 실온에서 솔루션과 부화 자기 입자의 100 μl를 추가합니다. 2.5 용매 ML의 최종 볼륨을 데려와 5 분의 보라색 자석에 튜브를 놓습니다. 빠르게 15 ML 원뿔 튜브에 3 번 CD + 일부를 부어. </li><li> 5 ML 추위 맥 버퍼를 추가하여 세포를 씻으, 가능한 세포의 수를 계산하고, FACS의 착색에 나누어지는을 제거합니다. </li><li> 980 μl 얼음 차가운 맥 버퍼에 CD161 + 세포 먼저 resuspend 농축 T 세포를 선택하려면, 10 μg 항 CD161적인 mAb를 추가하고 10 분 동안 냉장고에 품다. </li><li> 5 분에 대해 4 ° C에서 1,500 rpm으로 세포를 원심 분리기. 맥 버퍼 800 μl의 다음 reconstitute 세포 펠릿. 안티 - 마우스 IgG1 microbeads 200 μl를 추가하고 4시 10 분에 대한 솔루션을 품다 ° C. </li><li> 이 부화 단계에서, 3 ML 맥 버퍼를 추가하여 LS 열을 평형. </li><li> 다음 5 분에 대해 4 ° C에서 1,500 rpm을 centrifuging하여 세포를 씻어. 열매3 ML 맥 버퍼에 셀을 보냅니다. 그런 다음 LS 맥 분리 칼럼으로 세포를 피펫. 천천히 pipetting하여 거품을 발생하지 않도록해야합니다. 맥 버퍼 3 ML을 추가하여 열을 씻어. 두 번 반복합니다. </li><li> 3 ML 신선한 맥 버퍼를 추가하고 자석의 열을 제거합니다. 15 ML 원뿔 튜브에 장소 열. 플런저를 삽입하고 정화 CD161 + 3 번 CD + 세포를 얻기 위해 내용을 밀어. 카운트 NKT 세포에는 소수점으로 값진 경험을했습니다. 당신은 2-4000000 세포가 있어야합니다. </li></ol> 3. aAPC로 인한 NKT 세포 확장 <ol><li> 16 ML 전체 매체 (전체 중간 + IL-2, 100 U / ML)에서 10 6 강화 CD161 + 3 번 CD + T 세포와 10 6 aAPC을 추가하여 공동 문화를 설정합니다. , 96 잘 조직 문화 취급 폴리스티렌으로 낮은 증발 뚜껑이있는 U-바닥 판을 160도 최종 / μl 볼륨을 추가하여 판이 혼합합니다. 신선한 매체의 80 μl를 추가하여 매 7 일 하루 매체 교환을 수행합니다. </li><li> 수확세포는, 계산하고, 일 12-14에 FACS의 착색을 수행합니다. </li><li> 확장 NKT 세포는 특히 16 ML 완전한 매체에 10 6 확장 된 T 세포와 10 6 aAPC을 resuspend, 위의 단계 3.1에 설명 된대로 replated 할 수 있습니다. μl / 잘 96도 U-바닥 판 160를 추가하여 판이 혼합합니다. 신선한 매체의 80 μl를 추가하여 매 7 일 일 coculture 매체를 새로 고침 계속합니다. </li><li> 이 확장의 두 번째 라운드에 따라 추가 NKT 세포를 동결하는 것이 가장 좋습니다 (1 ML-5퍼센트 DMSO / 95% FBS 1 X10 6 / cryovial.) </li></ol> 4. 기능 테스트 : NKT 세포 aAPC로 인한 자극 <ol><li> 5x10 4 NKT 세포를 설정 / 잘 96도 U-바닥 판 200 μl 최종 볼륨 (전체 매체)에 5x10 5 aAPC을 갖추고 있습니다. </li><li> 24-48 시간 후 엘리사에 대한 수확 세포 배양 표면에 뜨는. </li></ol>

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</ol>

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aAPC는 NKT 세포 활성화를위한 기본 요구 사항을 연구하는 데 사용하며 입양 immunotherapy에 대한 NK T 세포의 전 생체 확장에 대한 잠재적 인 임상 적 가치를 가지고 할 수 있습니다. Mescher 외이 있습니다. 라텍스 마이크로 14, 15의 표면에 biotinylated costimulatory 분자 streptavidin을 통해 B7.1와 B7.2와 결합 된 최초의 구슬 기반 시스템 중 하나 인 biotinylated 손쥐 MHC 클래스 I-펩타이드 단일 사슬 구조를 설명했다. 이러한 접근 방식이 성공적으로 형질 전환 생쥐에서 항원에 특정한 T 세포를 자극하는 데 사용되었습니다. 이 접근법은 MHC 분자의 균일 한로드을 보장하기 위해 단일 ​​체인 MHC-펩타이드 복합를 사용하고 있기 때문에 또한, 각 대상 펩타이드 항원 따라서의 일반성을 제한, 원하는 단일 체인 MHC-펩타이드 복잡한 표현을위한 새로운 transfection를 요구 접근. 중요한 것은, 박사 Schneck의 그룹은 또 다른 비 세포 비드 기반 aAPC를 개발하여, 비드 기반 aAPC을 개척, 자기 구슬에 HLA-IG, 신호 1, 항 CD28, 신호 2, 커플 링으로했습니다. HLA-IG, 면역 글로불린 분자 골격 16, 17 융합 HLA의 고유 한 multimeric 양식은 자신의 그룹에 의해 개발되었다. 그 후, 그들은 효과적으로 CMV와 마트-1 특정 CTL 18 확대 표시 한 MHC-IG 기반 aAPC을 개발했습니다. 여기, 우리는 CD1d-IG 기반 aAPC가 작동 NKT 세포를 확장하는 데 사용할 수있는 증명하고있다. 한 연구는 CD1d 19과 NK 세포의 물리적 상호 작용을 조사하기 위해 비슷한 시스템을 사용하고 있습니다. 특히, 우리는 최적의 NKT 세포 증식에​​ 필요한 찾을 수 요구 사항에 적용 할 수 있습니다 인공 항원 제시 세포를 설계했습니다. aAPC 확장 방법은 인간의 NKT 세포를 확대하고 풍부하게하는 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 우리 aAPC는 체계적으로 잠재적 인 costimulatory 분자의 패널의 역할을 평가하고 NKT 세포 prolifera에서 자신의 역할을 평가하기 위해 수정할 수 있습니다기 및 기능. 따라서, aAPC는 NKT 세포를 유도하고 확장에 유용한 강력한 다목적 기술을 나타냅니다. aAPCs의 세대 미만의 주 소요 구슬의 대량 생산에 적합합니다. 그러나 aAPC을 생성에 중요한 단계는 CD1d-IG는 안정적 구슬의 표면에 고정되어 있는지 확인하고 일괄 배치에 일관성을 보장하기 위해 자신의 기능을 평가하는 것입니다. 시스템의 잠재적 인 제한은 구슬의 기계적 제거 이외의 자극을 해제하는 장소에서 메커니즘이 없을 것입니다. 특히, 항원과 T 세포 수용체 (TCR)의 참여 : CD1d/MHC 단지는 일반적으로 T 세포와 모두에서 억제 또는 진압 요인의 유도 될 수 있습니다 액세서리 / 접착 분자와 협력의 면역 시냅스를 생성 항원이 세포를 제시. aAPC 시스템에서 이러한 요소는 T 세포에 의해 upregulated 될 수도 있지만 구슬은 같은 종류의 리간드를 표현하지 않습니다이 수용체에. 또한 CD4 + NKT 세포는 마우스와 인간의 antitumor 응답을 억제하기 위해 표시되었습니다, 따라서 모든 NKT 세포 (α-GalCer있는 즉, 글로벌 자극) 또는 잘못된 부분 집합의 활성화 nonselective 활성화가 원치 않는 면역이 발생할 수 가능성이 있습니다 결과. 따라서, 하나는 phenotypically하고 기능적으로 aAPC 확장 된 NKT 세포 인구를 특성화해야합니다. 그림 4에 도시 된 바와 같이, 우리는 안티 CD28을 표현 α-GalCer -로드 aAPC과 자극이 Th2 Th1을 생산하는 NKT 세포, 그리고 Th17 형 크린 시토 킨을 발생할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 손쥐 연구 IL-33, 최근에 확인 시토 킨과 도전 이러한 IL-5 및 IL-13 등의 염증성 크린 시토 킨을 순환의 증가 수준으로 이어진보고했습니다. IL-33와 NKT 세포 치료는 시토 킨 생산 20 강화했습니다. IL-33은 ST2에 대한 특정 리간드이며, 그 용해 ST2 CA 보여왔다N 블록 IL-33 신호. 따라서, 미래의 응용 프로그램의 예를 들어, aAPC 표현 ST2가 생성 및 NKT 세포의 Th1 시토 킨 분비를 유도하면서 하나가 선택적으로 Th2 크린 시토 킨의 생산을 억제 할 수 있는지 확인하기 위해 사용될 수있다. 또한보고되었습니다 그 IV 주입 KB - 표현 C57BL에 aAPC을 / 6 쥐가 종양이 21 감소 폐 전이있었습니다. 중요한 것은, 이러한 데이터는 폐에 해당 aAPC 트래픽을 입증하고 효과기 T 세포 하위 집합을 활성화 할 수 있습니다. 따라서, 하나는 aAPC의 여러 유형을 생성하고 항원 특정 T 세포의 하위 집합 사이의 상호 작용을 조사 수 있습니다. 요약하면,이 연구 CD1d-IG 기반 aAPC은 정상적인 세포 APC를 대체하는 데 사용할 수 있다는 것을 입증하고, NKT 세포 기반 입양 immunotherapy에 대한 현재 임상 접근법을 향상 할 수있는 잠재력이 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> GE 생명 과학 </td><td> 17-1440 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 인간 T 세포 농축 키트 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 19,051 </td><td></td></tr><tr><td> Allophycocyanin CD161 인간적인 mAb </td><td> Pharmingen </td><td> 550968 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep 자석 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 18,002 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 IgG1 Microbeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-047-101 </td><td></td></tr><tr><td> 이량 체 XI 재조합 가용성식이 Dimeric 마우스 CD1d : IG의 융합 단백질 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557599 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 안티 CD28적인 mAb </td><td> Biolegend </td><td> 302914 </td><td></td></tr><tr><td> M-450 에폭시 구슬 </td><td> 생명 기술 </td><td> 150-11 </td><td></td></tr><tr><td> 알파 galactosylceramide (KRN7000) </td><td> Axxora, LLC </td><td> BML-SL232-0100 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 매체 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> R 0883 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td><td></td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 비타민 솔루션 </td><td> Gibco </td><td> 11120-052 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅토 에탄올 </td><td> Gibco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> * 시프로플록사신 </td><td> 알렉시스의 Biochemicals </td><td> 380-288 - G025 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24Jα18 </td><td> Biolegend </td><td> 342904 </td><td></td></tr><tr><td> PE-Vα24 (복제 C15) </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A66907 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-Vβ11 (복제 C21) </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A66905 </td><td></td></tr><tr><td> PE-CD1d </td><td> Biolegend </td><td> 123510 </td><td></td></tr><tr><td> PE 방지 마우스 IgG1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 556650 </td><td></td></tr><tr><td> FITC 안티 - 마우스 IgG2a </td><td> Biolegend </td><td> 407105 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS, 아니 칼슘, 마그네슘 없음 </td><td> 생명 기술 </td><td> 14190250 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 Azide </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB00440-00100 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 431788 </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 (Proleukin) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354043 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 AB 세럼 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Labquake 튜브 회전하는 것 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 13-687 - 10Q </td><td></td></tr><tr><td> BD 매 5 ML의 폴리스티렌 내내 아래로 튜브 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-959 - 1A </td><td></td></tr><tr><td> 모자와 Wheaton의 유리 샘플 병 </td><td> 피셔 과학 </td><td> (03-343 - 6E) 대형 (03-343 - 6A) 소형 </td><td></td></tr></tbody></table>

인공 항원은 세포 (aapc) 중재의 활성화와 자연 킬러 t 세포의 확장을 제시

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

자연 킬러 T (NKT) 세포는 자연 킬러 (NK) 세포와 T 세포 하나 둘의 특성 마커를 표시 T 세포의 고유 한 하위 집합입니다. 고전 T 세포와는 달리 NKT 세포는 CD1 분자 2의 맥락에서 지질 항원을 인식하고 있습니다. 쥐 Vα14Jα18 및 제한된 다양성 3-6의 Vβ 체인과 관련된 인간에 Vα24Jα18, 그리고 표준 또는 불변 NKT (I NKT) 세포라고합니다 : NKT 세포는 불변 TCRα 체인 다시 정리하기를 표현한다. 기존의 T 세포와 마찬가지로, NKT 세포는 CD1d에 7 적절한 신호에 따라 CD4 - CD8-thymic 전구체 T 세포에서 개발할 수 있습니다. 치료 목적으로 NKT 세포를 활용 할 수있는 가능성이 크게 α-Galactosylceramide (α-GalCer)과 크린 시토 킨 8 다양한 인간의 NKT 세포를 자극하고 확장 할 수있는 능력 증가했다. 중요한 것은, 이러한 세포는 원래 phenotyp을 유지E, 분비의 크린 시토 킨, 그리고 종양 세포 라인에 대한 표시 세포 독성 기능입니다. 따라서, 예 생체 확장 NKT 세포는 기능 유지와 입양 immunotherapy에 사용할 수 있습니다. 그러나, NKT 세포 기반 immunotherapy는 autologous 항원 제시 세포의 사용에 의해 제한되어 이러한 stimulator 세포의 수량 및 품질이 실질적으로 다를 수 있습니다. 암 환자의 단핵 세포 - 파생 DC는 costimulatory 분자의 감소 수준을 표현하고 9,10 이하 염증성 크린 시토 킨을 생산하는 것으로보고되었습니다. 사실, 오히려 autologous APC보다 손쥐 DC는 CML 환자 11 일부터 NKT 세포의 기능을 테스트하는 데 사용되었습니다. NKT 세포는 손쥐 DC에 의해 확장하고 입양 immunotherapy 사용할 수 없습니다 수 있기 때문에 그러나,이 시스템은 체외 테스트에 사용할 수 있습니다. 따라서, 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 의존 표준화 된 시스템은여 또는 xenogeneic CE의 함정없이 DC의 자극 효과를 생산할 수재편 12, 13. 여기, 우리는 CD1d 기반 aAPC을 생성하는 방법을 설명합니다. CD1d-IG 단지는 신뢰할 수있는 방법 격리 활성화하고, 이펙터 NKT 세포 인구를 확장 할 수를 제공합니다 CD1d-항원 단지로 T 세포 수용체 (TCR)의 참여는 NKT 세포의 활성화, 항원의 기본 요구 사항 때문입니다.

여기에 우리는 NKT 세포 (그림 1)의 전파를위한 표준화 된 방법으로 NKT 세포를 자극하는 자기 구슬로 CD1d-IG 및 안티 CD28적인 mAb의 공유 결합 커플 링에 의한 CD1d-IG 기반 aAPC를 생성하는 방법을 설명합니다. 첫째, 하나는 CD1d-IG 융합 단백질이 안정적으로 자기 구슬의 표면에 고정되어 있는지 입증해야합니다. 그림 2A, CD1d-IG 및 안티 CD28에 표시된 항체는 자기 구슬의 표면에 표현 된 두. aAPC의 stimulatory 용량을 조사하기 위해, aAPC 밤, 수확 문화 supernatants와 엘리사에 의해 측정 IL-2 생산과 우리가 공동 교양 NKT 세포 hybridomas. 우리는 CD1d-IG 기반 aAPC는 (그림 3, 데이터가 표시되지 않음)와 같거나 자신의 휴대 전화 대응보다 높은 수준에서 NKT 세포 hybridomas을 자극 할 수 사실을 발견했습니다. 흥미롭게도, 우리는 마우스 NKT 세포 hybridomas은 인간 CD1d 기반 aAPC (FI에 의해 자극 것을 발견aAPC의 각 배치 테스트를위한 간단한 방법을 제공합니다 gure 2B). 다음, 우리는 aAPC의 전파 가능성을 보여 모색, 따라서 인간의 T 세포는 말초 혈액에서 분리되었습니다. 먼저 CD161 + 3 번 CD + T 세포 비율은 자기 비드 분리하여 풍부하게되었다. 그런 다음, T 세포는 α-GalCer -로드 aAPC과 함께 격주 자극했다. 중요한 것은, 우리는 상대적으로 낮은 초기 NKT 세포 인구 (0.03 %)로, 우리는 ~ 67% Vα24 + Vβ11 + (그림 3)에 셀을 확장 할 수 사실을 발견했습니다. 우리는 건강한 자원 봉사자와 암 환자의 PBMC에서 NKT 세포를 확대하고 α-GalCer로드 aAPC가 모두 그룹에서 NKT 세포 인구를 확장 할 수있었습니다 것으로 나타났습니다. 특히, 확장 속도는 매우 기증자가 의존했다. 예상 Vα24 + 세포의 높은 초기 인구, 확장의 큰 비율입니다. 또한,2,000,000 셀의 시작 인구를 사용하는 경우 CD161 + 3 번 CD + T 세포는 하나가 확장의 두 발 (표 1) 후&gt; 10 7 세포를 얻을 수 있습니다. 확장 된 NKT 세포의 약 80~90%는 +, ~ 5% CD8는 +, 나머지는 아마 CD4 - CD8 더블 부정적인 NKT 세포 아르 CD4 있습니다. 그림 4A-C와 같이 이러한 확장 된 NKT 세포는 기능 연구에 사용할 수 있습니다. 우리는 우리의 전 생체는 NKT 세포는 α-GalCer의 자극에 반응 유지하고 IL-17A, TNF-α와 IFN-γ의 강력한 PD가 확대 것으로 나타났습니다. 그것은 초기 T 세포 농축 인구가 낮은 한 두 번째 CD161 농축 단계를 수행 할 수없는 경우 aAPC로 인한 확장이 예상 결과를 (그림 4D, 기부자 1 참조) 포기하지 않을 수 있다는 것을 알아야한다. 순환 NKT 세포의 비율이 0.1 %보다 높은 경우에는, 하나는 여전히 상당한 확장을 얻을 수 있어야합니다내가 NKT 세포. 이하,이 데이터는 CD1d 기반 aAPC이 효과적으로 확장하고 기본 인간의 NKT 세포를 자극하는 데 사용할 수있는 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig1.jpg" /> 1 그림. CD1d의 개략도 : IG 기반 aAPCs CD1d 분자의 세포 부분은 짧은 아미노산 링커로 구분하여 면역 글로불린 중쇄 단백질의 일정한 영역에 융합되어 있습니다. 이 분자는 쉽게 간단 관심 지질의 과잉으로 그들을 잠복기에 의해, 이러한 α-GalCer와 같은 지질 항원과로드 할 수 있습니다. aAPC는 자기 구슬로 CD1d-IG 및 안티 CD 배에 힘을 결합하여 만들어졌다. 이 시스템에서 CD1d-IG는적인 mAb는 costimulatory 신호를 제공하는 TCR 및 안티 CD28을 통해 같은 종류의 항원에 특정한 신호를 제공하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="4.25in" fO : SRC = SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4333/4333fig2.jpg&quot;/ &quot;를 / files/ftp_upload/4333/4333fig2highres.jpg&quot;&gt; 그림 2. . IgG 이량 체 (PE-복합 안티 - 마우스 IgG1과 착색을 통해)뿐만 아니라 안티 CD28 항체 (FITC-복합 항 마우스 IgG2a를 사용하여) : aAPCs에 표면 단백질의 FACS의 착색 A) aAPCs은 CD1d의 존재에 대해 테스트되었습니다 . 오픈 histograms는 isotype 제어를 나타냅니다, 채워진 histograms에 표시된 항체를 나타냅니다. CD1d-IG 표현 aAPC는 NKT 세포가 IL-2 생산을 자극 할 수 있습니다. B) Vα14 + 마우스 NKT 세포 하이 브리 도마, DN32.D3은 어느 매체, 가용성 항원 (α-GalCer), aAPC 또는 α-GalCer -로드 aAPC 하역과 cocultured되었습니다. 문화 supernatants는 수확 된 표준 샌드위치 엘리사는 IL-2 생산을 측정하기 위해 사용되었다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig3.jpg" /> 그림 3. CD1d-IG 코팅 인공 항원 제시 세포에 의한 NKT 세포의 확장. (A) 기본 3 번 CD + CD161 + 더블 긍정적 인 세포가 자기 분리를 사용하여 PBMCs으로부터 격리되었다. 정렬 세포는 α-GalCer로드, 14 일 동안 CD1d-IG 코팅 aAPC을 자극했다. 세포는 Vα24와 Vβ11 다음 aAPC 자극에 얼룩이했다. (B) 기본 인간의 NKT 세포는 B 세포 림프종 라인의 용해를 중재. 항원의 유무, 20-24 시간에 96도 U-바닥 판에-GalCer (100 NG / ML)에 지정된 비율에서 NKT 세포와 incubated C1R - CD1d 세포. NKT 세포 매개 세포 용해가 표준 51Cr 릴리스 분석에 의해에 의해 평가되었다. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4333/4333fig4.jpg" /> 4 그림. aAPC 확장 된 NKT 세포의 시토 킨 프로파일. </strong&gt; 두 주 동안 α GalCer로드 aAPC, 확장 된 NKT 세포 (1 × 10 5 / 잘)이 용해 α-GalCer, PMA / Ionomycin, anti-CD3/28 microbeads, 또는 α-GalCer로드 aAPC과 cocultured 했나요 자극 후 (2 × 10 5도 /) 48 시간 용. (A) IL-17A, (B) TNF-α, 그리고 (C) IFN-γ 생산 표준 시토 킨 엘리사에 의해 측정되었다. 데이터가 표시 부정적인 컨트롤 (미디어 및 빈 구슬) 차감 후 순 시토 킨 생산합니다. (D) 기본 T 세포는 PBMC는 자기 구슬 분리를 사용하여 분리되었습니다. 정렬 셀 - GalCer로드 - aAPC 표시와 함께 두 주 동안 자극했다. 세포가 Vα24에 대한 특정 애비를 사용하여 얼룩 져 있었다 +와 Vβ11 + 및 유동 세포 계측법에 의해 분석했다.

여기 인공 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용하여 대량 T 세포 인구에서 인간의 NKT 세포를 활성화하고 확장하는 방법을 설명합니다. CD1d 기반 aAPC의 사용은 기능 NKT 세포의 높은 숫자를 생성하기위한 표준화 된 방법을 제공한다.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

자연 살해 T (NKT) 세포는 자연 살해 (NK) 세포와 T 세포 모두의 특성 마커를 나타내는 T 세포의 독특한 하위 집합입니다1. ...와 달리

본 절차의 전체적인 목표는 NK T 세포의 확장을 위한 CD 1D 기반 인공 항원 제시 세포(AAPC)를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 자성 비드에 단백질을 첨가하여 기능화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 말초혈액으로부터 초기 NK T 세포 집단을 농축합니다.다음으로, 농축된 T 세포를 A A PC와 공동 배양합니다. 마지막 단계에서는 A A PC 세포 집단의 표현형과 기능을 평가합니다. 최종적으로, 확장된 T 세포 서브셋의 순도는 유세포 분석법을 통해 결정할 수 있습니다. 수지상 세포를 사용하는 기존 방법보다 APC를 사용할 때의 주요 장점은 수지상 세포의 경우 공여자에 따른 변동성이 클 수 있다는 점입니다.APCs는 NK T 세포의 증식을 위한 재현 가능한 기성품 형태의 표준화된 방법을 제공합니다. 저는 존스 홉킨스 대학의 Dr. Schneck 및 oaky와 함께 연구하던 중 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 그들은 고전적인 CD8 T-세포 하위 집합의 증식을 위해 인공 항원 제시 복합체를 사용하는 분야를 개척했습니다.시연은 박사후 연구원인 Dr. James East와 제 실험실의 연구원인 Dr. Wendy의 아들이 진행하겠습니다. 먼저 1 mL의 dyna bead M four 50 epoxy beads를 5 mL 투명 붕규산 유리 나사 캡 바이알에 옮깁니다. 그런 다음 별도의 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 3 mL의 멸균 bore eight buffer로 비드를 헹굽니다.100 µg의 인간 CD 1D IG dimer와 20 µg의 원하는 공자극 분자를 1 mL의 칼슘 및 마그네슘 제거 PBS에 추가합니다. 다음으로, 비드가 들어 있는 유리 바이알을 자석 위에 놓고 붕산 완충액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 단백질 혼합물을 유리 바이알에 넣고 캡을 닫습니다.바이알을 뒤집어 즉시 용액을 혼합한 후, 캡을 파라필름으로 덮고 4 °C의 로테이터에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, 유리 바이알을 다시 자석 위에 올리고 비즈가 섞이지 않도록 주의하며 단백질 혼합물을 제거합니다. 비즈 세척 버퍼 3 mL를 추가하고 4 °C의 로테이터에서 5분 동안 인큐베이션하는 과정을 통해 비즈를 3회 세척합니다.단백질이 비드에 안정적으로 로딩되었는지 확인하기 위해, 비드 일부를 항체로 염색한 후 유세포 분석법으로 분석합니다. 이제 5 × 10⁷ 개의 비드를 1.5 mL 소형 유리 바이알로 옮기고 1 mL의 멸균 PBS로 비드를 세척합니다. 그 후 사용 48~72시간 전에 처리합니다.비드가 항원으로 로딩되는 동안, 1 mL의 멸균 PBS 내에서 세척된 비드에 항원을 로딩합니다. 먼저 헤파린 처리된 공여자의 혈액을 실온에서 동일한 부피의 PBS로 희석하여 PBMC를 수집합니다. 그 다음, 실온의 PHI 15 mL를 50 mL 원추형 튜브에 넣고, 희석된 혈액 혼합물 25 mL를 PHI 층 위에 천천히 층분리하여 얹습니다.그 후 브레이크를 끈 상태에서 실온, 700 ×g로 30분간 샘플을 원심분리합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 림프구 인터페이스 층을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로 50 mL의 PBS로 림프구를 세척하고 상층액을 제거하며, 동일한 공여자의 튜브들을 하나의 튜브로 합칩니다.PBMC를 20 milliliters의 PBS로 다시 세척한 후, 세포 수를 측정하고 max buffer를 사용하여 5 × 10⁷ cells/milliliter 농도로 재부유시킵니다. T세포 분획을 분리하기 위해, EP human T-cell enrichment kit의 PAN T-cell enrichment solution 100 microliters를 PBMC 2 milliliters와 함께 상온에서 10분 동안 배양합니다. 그 다음, 해당 용액을 자성 비드(magnetic beads) 100 microliters와 함께 상온에서 10분 더 배양합니다.용매의 최종 부피를 2.5 milliliters로 맞춘 다음 튜브를 자석에 놓습니다. 5분 후, CD3 양성 분획을 15 milliliter 원뿔형 튜브에 빠르게 붓습니다. 이제 5 milliliters의 차가운 max buffer로 세포를 세척하고, 생존 세포 수를 측정합니다.먼저 CD 1 61 양성 세포를 선택하기 위해 염색용 분주액을 제거합니다. 농축된 T 세포를 980 µL의 얼음처럼 차가운 max buffer에 재부유시킨 후, 10 µg의 anti CD 1 61 단클론 항체와 함께 4 °C에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 세척한 후 펠릿을 800 µL의 max buffer와 200 µL의 anti-US IgG one microbeads로 재구성합니다.이 용액을 4°C에서 10분 동안 더 배양합니다. 세포를 마이크로비즈와 함께 배양하는 동안, LS 컬럼을 평형화하기 위해 3mL의 max buffer를 첨가합니다. 해당 세포 분획을 세척한 후, 3mL의 max buffer에 든 세포를 컬럼에 천천히 피펫으로 분주합니다.이제 컬럼을 3 mL의 신선한 max buffer로 세 번 헹굽니다. 그런 다음 신선한 max buffer 3 mL를 컬럼에 더 추가하고, 컬럼을 15 mL 원심 분리 튜브(conical tube)로 옮깁니다. 정제된 CD161 양성 CD3 양성 세포를 밀어내어 회수하고, NKT 세포가 농축된 분획의 수를 측정합니다.농축된 10⁶개의 CD161 양성 CD3 양성 T 세포와 10⁶개의 APC를 16 mL의 완전 배지가 담긴 플레이트에서 공동 배양함으로써 이 단계를 시작합니다. 공동 배양액 160 µL를 저증발 덮개가 있는 조직 배양 처리된 폴리스티렌 U-바닥 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 12~14일째에 세포를 회수하고 수를 측정합니다. 유세포 분석으로 세포 집단을 분석한 후, 다시 분주하여 공동 배양합니다.방금 시연한 바와 같이, 2차 확장에 따른 추가 NKT 세포는 동결 보존합니다. AAPC 세포의 기능을 테스트하려면, 먼저 96-well U-bottom 플레이트의 well당 5×10⁴개의 NKT 세포와 5×10⁵개의 AAPC를 최종 부피 200 µL의 완전 배지에 넣고 공동 배양합니다. 24~48시간 후, ELISA 분석을 위해 세포 배양 상층액을 수집합니다. 이 첫 번째 그림은 여기에서 보는 바와 같이 CD1D IG 단백질이 자기 비드 표면에 안정적으로 고정되었음을 보여줍니다.이 그래프에서 나타난 바와 같이, CD 1D IG와 anti CD 28 항체는 모두 자성 비드의 표면에 발현되어 있습니다. V α14 양성 마우스 NK T 세포 하이브리도마 DN 30 2D 3을 매질에 용해된 α-galera 항원이 적재되지 않은 APC 또는 α-gal이 적재된 APC와 함께 공배양하였습니다. 이후 배양 상층액을 수확하고, ELISA로 IL-2 생산량을 측정하여 각 항원 제시 세포 배치를 테스트하는 간단한 방법을 제공하였습니다. 본 실험에서는 자성 비드 분리법을 통해 인간 CD 1 61 양성 CD 3 양성 말초혈액 T 세포를 농축하였습니다.그 후 세포를 alpha galera가 탑재된 A A PC로 14일 동안 일주일에 한 번씩 자극하고, V alpha 24 및 V beta 11 발현을 분석하였습니다. 중요한 점은, 초기 NKT 세포 집단이 0.03%로 비교적 낮았음에도 불구하고, 세포를 약 67%의 V alpha 24 양성 V beta 11 양성 집단으로 증식시킬 수 있었다는 것입니다. 여기서는 96-well U-bottom 플레이트에서 Alpha Gal SER 항원의 존재 또는 부재 하에 C one R CD 1D 세포를 표시된 비율의 NKT 세포와 함께 20~24시간 동안 배양하였습니다.B 세포 림프종 세포주의 NKT 세포 매개 세포 용해는 크롬 방출 분석법으로 평가하였습니다. PC 확장 NKT 세포는 이 림프종 세포주를 용해할 수 있었습니다. 알파 갈렉토세라마이드(alpha galactosylceramide)의 존재 또는 부재 하에, 건강한 자원봉사자와 암 환자 모두의 PBMC로부터 NKT 세포를 확장하였으며, 알파 갈렉토세라마이드를 처리하였습니다.A PC를 통해 두 그룹 모두에서 NKT 세포 집단을 확장할 수 있었습니다. 200만 개의 CD161 양성 CD3 양성 T 세포를 초기 집단으로 사용했을 때, 두 차례의 확장 과정을 거쳐 10⁷개 이상의 세포를 얻을 수 있었습니다. 이렇게 확장된 NKT 세포는 본 실험에서 보여준 바와 같이 기능 연구에 활용될 수 있습니다.ex vivo로 증식된 NKT 세포는 Alpha GAL 자극에 계속 반응하며 IL 17 A, TNF alpha 및 interferon gamma를 강력하게 생성합니다. 초기 T 세포 농축 집단이 적고 두 번째 CD 1 61 농축 단계를 수행할 수 없는 경우, A A PC 매개 증식이 예상된 결과를 얻지 못할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 하지만 순환 NKT 세포의 비율이 0.1%보다 높다면, invariant NKT 세포를 충분히 증식시킬 수 있을 것입니다.종합적으로, 이러한 데이터는 CD 1D 기반 A A PC가 일차 인간 NK T 세포를 효과적으로 증식시키고 자극하는 데 사용될 수 있음을 입증합니다. 이 절차 이후에는 NK T 세포 활성화의 역학은 어떠한가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 QPCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 간 질환 분야의 연구자들이 지방간 질환에서 NKT 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

artificial-antigen-presenting-cell-aapc-mediated-activation-expansion

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

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효율적인위한 킬러 인공 항원 제시 세포 (KaAPC) 체외 인간의 항원 특이 T 세포의 고갈

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항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

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여기에서는 말초혈액자연살해(PBNK), 간 조직으로부터 NK세포, 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 제대혈(CB)에서 유래한 키메라 항원 수용체(CAR)-NK세포를 확장시키는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 확장된 NK 세포의 최적화된 순도 외에도 221-mIL-21 영양세포를 사용하는 NK 및 CAR-NK 세포의 확장을 보여줍니다.

멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

여기에서는 다양한 악성 종양에 대한 사멸을 개선하여 인간 iPSC 유래 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 자연 살해 세포를 분화하고 확장하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 자연살해(NK)에 최적화된 iPSC 유래 CAR-NK 세포의 분화 및 증식과 다양한 종양 세포주에 대한 항종양 활성의 측정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 키메라 항원 수용체 발현 자연 살해 세포의 발전

학습하세요 CD1d 기반 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 이용한 NKT 세포 확장 방법을. 말초혈액에서 NKT 세포를 활성화하고 고순도로 확장하여 면역치료 연구에 활용할 수 있습니다.

인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

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