인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

이 절차의 전반적인 목표는 NK T 세포의 증식을 위한 CD 1D 기반 인공 항원 제시 세포 또는 A PC를 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 자성 비드를 기능화하기 위해 단백질을 추가함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 말초 혈액의 초기 NK T 세포 집단을 강화합니다.

다음으로, 농축된 T 세포를 AA와 공동 배양 PC.In 마지막 단계에서 AA PC 세포 집단의 표현형 및 기능을 평가합니다. 궁극적으로 확장된 T cell subset의 순도는 유세포 분석에 의해 결정될 수 있습니다. 수지상 세포를 활용하는 현재 방법에 비해 APC의 주요 장점은 수지상 세포에서 공여자 변동성이 높을 수 있다는 것입니다.

A: APC는 NK T 세포의 증식을 위한 재현 가능하고 표준화된 방법을 제공합니다. 이 방법에 대한 아이디어는 존스 홉킨스에서 Dr.Schneck 및 oaky와 함께 일할 때 처음 떠올랐습니다. 그들은 고전적인 CD 8개의 T 세포 하위 집합의 확장을 위해 인공 항원 제시 복합체를 사용하는 분야를 개척했습니다.

이 절차를 시연하는 것은 박사후 연구원이자 Dr.Wendy의 아들인 James East 박사가 맡을 것입니다. 제 연구실의 연구원 동료: 1ml의 dyna bead M 4개의 50 에폭시 비드를 5ml의 투명 규산보 유리 나사산 바이알에 옮기는 것으로 시작합니다. 그런 다음 별도의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 3ml의 멸균 보어 8개 버퍼로 비드를 헹굽니다.

100마이크로그램의 인간 CD 1D IG 이량체와 20마이크로그램의 원하는 공동 자극 분자를 1밀리리터의 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS에 추가합니다. 다음으로, 유리 바이알이 들어있는 비드를 자석에 놓고 붕산염 버퍼를 흡입합니다. 그런 다음 단백질 혼합물을 유리 바이알에 넣고 캡을 다시 닫습니다.

바이알을 뒤집어 용액을 즉시 혼합한 다음 파라폼으로 캡을 덮고 다음날 섭씨 4도의 로테이터에 밤새 놓습니다. 유리 바이알을 자석에 다시 놓고 비드를 피하면서 단백질 혼합물을 조심스럽게 제거합니다. 3ml의 비드 세척 버퍼를 넣고 섭씨 4도의 회전체에서 5분 동안 배양하여 비드를 세 번 세척합니다.

단백질이 bead에 안정적으로 적재되어 있는지 확인하려면 beads의 부분 표본을 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석합니다. 이제 5 곱하기 10부터 7번째 비드를 1.5ml의 작은 유리 바이알에 옮기고 1ml의 멸균 PBS로 비드를 헹굽니다. 그런 다음 사용 48-72 시간 전에.

세척된 비드에 항원을 1ml의 멸균 PBS에 넣고 비드에 항원을 로드하는 동안 비드에 항원을 로드합니다. 먼저 헤파린화된 기증자 혈액을 실온에서 동일한 부피의 PBS로 희석하여 PBMC를 수집합니다. 그런 다음 15ml의 실온 PHI를 추가하고 50ml 원추형 튜브를 호출한 다음 25ml의 희석된 혈액 혼합물을 phi 위에 천천히 오버레이합니다.

샘플을 700배 G와 실온에서 30분 동안 원심분리한 후 분리합니다. 목초지 피펫을 사용하여 림프구 계면을 새로운 50ml 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, 림프구를 50ml의 PBS로 세척하여 상층액을 버리고 단일 공여자의 튜브를 단일 튜브로 결합합니다.

PBMC를 PBS 20ml로 다시 세척한 후 세포를 계수한 다음 최대 완충액에서 밀리리터당 7번째 세포까지 10의 5배 농도로 재현탁합니다. T 세포 분획을 분리하려면 EP 인간 T 세포 농축 키트에서 100마이크로리터의 PAN T 세포 농축 용액을 2ml의 PBMC와 함께 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 마그네틱 비드로 용액을 실온에서 10분 더 배양합니다.

용매의 최종 부피를 2.5 밀리리터로 가져온 다음 튜브를 자석에 놓습니다. 5 분 후에, 빨리 15 밀리리터 원뿔 관으로 CD 3 긍정적인 조각을 따른다. 이제 5ml의 콜드 맥스 버퍼로 세포를 세척하고 생존 가능한 세포를 계산합니다.

사실 염색을 위한 부분 표본을 제거하여 CD 1 61 양성 세포를 먼저 선택합니다. 농축된 T 세포를 980마이크로리터의 얼음 냉장 최대 완충액에 재현탁시킨 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 10마이크로그램의 항 CD 1 61 단클론 항체에 세포를 배양합니다. 세척 후 세포를 800마이크로리터의 최대 완충액과 200마이크로리터의 항미 IgG 1마이크로비드로 펠릿을 재구성합니다.

이 용액을 섭씨 4도에서 10분 더 배양합니다. 세포가 마이크로비드와 함께 배양하는 동안 3ml의 최대 버퍼를 추가하여 LS 컬럼을 평형화합니다. 이 세포 분획을 세척한 후 최대 완충액 3ml의 세포를 천천히 피펫으로 컬럼에 넣습니다.

이제 3ml의 새로운 최대 버퍼로 컬럼을 세 번 헹굽니다. 그런 다음 컬럼에 3ml의 새로운 max 버퍼를 더 추가하고 컬럼을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 정제된 CD 1 61 양성 CD 3개의 양성 세포를 떨어뜨린 다음 NKT 세포 농축 분획을 계산합니다.

이 단계를 시작하여 농축 CD 1 61 양성 CD 3 개의 양성 T 세포 및 10 내지 6 번째, 16 밀리리터의 완전한 중간 플레이트에서 A PC를 공동 배양하여 시작합니다.12 내지 14 일에 낮은 증발 뚜껑을 가진 조직 배양 처리 폴리스티렌 U 바닥 플레이트에 96 웰의 공동 배양 웰 당 160 마이크로 리터, 세포를 수확하고 계수합니다. 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 통해 개체군을 분석한 다음 repl 및 co-culture를 수행합니다.

확장된 NKT 세포는 방금 두 번째 확장 후 여분의 NKT 세포를 동결하는 것으로 나타났습니다. A A PC 세포의 기능성을 시험하기 위해, 10 내지 5 웰 당 4 번째 NKT 세포를 5 배 10 내지 5 배양하고, 200 마이크로 리터의 완전한 배지 및 96 웰 바닥판에서 24 내지 48 시간 후에 바닥 플레이트를 사용하여 세포 배양 상층액을 수확하고, Eliza에 의한 분석을 위해 세포 배양 상층액을 수확한다. 이 첫 번째 그림은 CD 1D IG 단백질이 여기에 표시된 바와 같이 자성 비드의 표면에 안정적으로 고정되어 있음을 보여줍니다.

CD 1D IG 및 anti CD 28 항체는 모두 이 그래프에서 볼 수 있듯이 마그네틱 비드 표면에서 발현됩니다. V alpha 14 양성 마우스 NK T 세포 하이브리도마 DN 30 2D three는 매체 용해성 알파 갈레라 항원이 언로드 된 A A PC 또는 알파 갈이 로딩 된 A A PC와 공동 배양되었습니다. 그런 다음 배양 상등액을 수확하고 Eliza가 항원 제시 세포의 각 배치를 테스트하기 위한 간단한 방법을 제공하여 IL 2 생산량을 측정했습니다. 이 실험에서, 인간 CD 1 61 양성 CD 3 개의 양성 말초 혈액 T 세포는 자기 비드 분리에 의해 농축되었다.

그런 다음 14일 동안 일주일에 한 번 알파 갈레라로 세포를 자극하고 A, A, PC를 로드하고 V 알파 24 및 V 베타 11 발현을 분석했습니다. 중요한 것은 초기 NKT 세포 집단이 0.03%로 상대적으로 낮더라도 세포가 약 67%V alpha 24 positive V beta 11 양성 집단으로 확장될 수 있다는 것입니다. 여기서, Cone R CD 1D 세포는 96에서 Alpha Gal SER 항원의 유무에 관계없이 표시된 비율로 NKT 세포와 함께 배양하였으며, 음, U-바닥 플레이트에서 20 내지 24시간 동안 배양하였다.

그런 다음 B 세포 림프종 라인의 NKT 세포 매개 세포 용해를 크롬 방출 분석으로 평가했습니다. A: PC 확장 NKT 세포는 이 림프종 세포주를 생성할 수 있었습니다. 알파 갈레라의 유무에 따라 NKT 세포는 건강한 지원자와 암 환자 모두의 PBMC에서 확장되었으며 알파 갈레라가 로드되었습니다.

A: PC는 두 그룹 모두에서 NKT 세포 집단을 확장할 수 있었습니다. 200만 개의 CD 1 61 양성 CD의 시작 모집단을 사용할 때, 10 내지 7번째 세포보다 큰 3개의 양성 T 세포는 2회의 확장 확장 후에 얻을 수 있다. NK NKT 세포는 여기에서 입증된 바와 같이 기능 연구에 사용할 수 있습니다.

체외 확장 NKT 세포는 알파 GAL 자극과 IL 17 A TNF 알파 및 인터페론 감마의 강력한 생산자에 계속 반응합니다. 초기 T-세포 농축 집단이 낮고 두 번째 CD1 61 농축 단계를 수행할 수 없는 경우, A A PC 매개 확장이 예상한 결과를 산출하지 못할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 순환하는 NKT 세포의 비율이 0.1%보다 높으면 불변 NKT 세포의 상당한 증식은 여전히 얻을 수 있어야 합니다.

총체적으로, 이러한 데이터는 CD 1D 기반 A PC가 이 절차에 따라 1차 인간 NK T 세포를 효과적으로 확장하고 자극하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. NK T 세포 발달 후 활성화의 동역학은 무엇인지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 QPCR과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 간학 분야의 연구자들이 지방간 질환에서 NKT 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.