인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

이 실험 절차의 전반적인 목표는 NK T 세포의 증식을 위해 CD 1D 기반의 인공 항원 제시 세포(A APC)를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 단백질을 추가하여 자성 비드를 기능화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 말초 혈액으로부터 초기 NK T 세포 집단을 농축합니다.

다음으로, 농축된 T 세포를 A A PC와 공배양합니다. 마지막 단계에서는 A A PC 세포군의 표현형과 기능을 평가합니다. 최종적으로, 확장된 T 세포 서브셋의 순도는 유세포 분석으로 결정할 수 있습니다. 수지상 세포를 이용하는 기존 방법보다 APC를 사용할 때의 주요 장점은 수지상 세포의 경우 공여자 간 변동성이 클 수 있다는 점입니다.

인공 항원 제시 세포(APCs)는 NK T 세포 확장을 위해 재현 가능하며 기성품 형태의 표준화된 방법을 제공합니다. 제가 Johns Hopkins에서 Dr. Schneck 및 oaky와 함께 연구할 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻게 되었습니다. 그들은 전형적인 CD8 T 세포 서브셋의 확장을 위해 인공 항원 제시 복합체를 사용하는 분야를 개척했습니다.

시연은 박사후 연구원인 Dr.James East와 제 실험실의 연구원인 Dr.Wendy의 아들이 진행하겠습니다. 우선 dyna bead M four 50 epoxy beads 1 mL를 5 mL 투명 붕규산 유리 나사캡 바이알에 옮깁니다. 그다음 별도의 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 멸균된 bore eight buffer 3 mL로 비즈를 세척합니다.

100 µg의 human CD 1D IG dimer와 20 µg의 원하는 공동 자극 분자를 1 mL의 칼슘 및 마그네슘 제거 PBS에 첨가합니다. 다음으로, 비드가 들어 있는 유리 바이알을 자석 위에 놓고 붕산염 완충액을 흡입하여 제거합니다. 그 후 단백질 혼합물을 유리 바이알에 넣고 캡을 다시 닫습니다.

바이알을 뒤집어 용액을 즉시 혼합한 다음, 캡을 파라필름으로 덮고 4°C의 로테이터에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 유리 바이알을 다시 자석 위에 놓고 비드를 피해 단백질 혼합물을 조심스럽게 제거하십시오. 비드 세척 완충액 3 mL를 첨가하고 4°C의 로테이터에서 5분 동안 배양하는 과정을 세 번 반복하여 비드를 세척하십시오.

단백질이 비드에 안정적으로 로딩되었는지 확인하기 위해, 비드의 일부를 항체로 염색하고 유세포 분석기(flow cytometric analysis)로 분석합니다. 이제 5 × 10⁷개의 비드를 1.5 mL 소형 유리 바이알로 옮기고 1 mL의 멸균 PBS로 비드를 세척합니다. 그 후 사용 48~72시간 전에 준비하십시오.

비즈에 항원을 로딩하는 동안, 1 mL의 멸균 PBS 내에서 세척된 비즈에 항원을 로딩합니다. 먼저 헤파린 처리된 공여자 혈액을 실온에서 동일한 부피의 PBS로 희석하여 PBMC를 수집합니다. 그 후, 50 mL 원추형 튜브에 실온의 PHI 15 mL를 넣고, 희석된 혈액 혼합물 25 mL를 PHI 위에 천천히 층분리하여 올립니다.

샘플을 700 ×g, 상온에서 브레이크를 끈 상태로 30분 동안 원심분리합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 림프구 층(interface)을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 다음으로, 50 mL의 PBS로 림프구를 세척하고 상층액을 제거하며, 단일 공여자로부터 얻은 튜브들을 하나의 튜브로 합칩니다.

PBMC를 20 mL의 PBS로 다시 세척한 후, 세포 수를 측정하고 max buffer를 사용하여 5 × 10⁷ cells/mL 농도로 재현탁합니다. T-세포 분획을 분리하기 위해, EP human T-cell enrichment kit의 PAN T-cell enrichment solution 100 µL를 PBMC 2 mL와 함께 실온에서 10분 동안 반응시킵니다. 그 다음, 해당 용액을 마그네틱 비드 100 µL와 함께 실온에서 다시 10분 동안 반응시킵니다.

용매의 최종 부피를 2.5 milliliters로 맞춘 다음 튜브를 자석에 놓습니다. 5분 후, CD3 양성 분획을 15 milliliter 원뿔형 튜브에 빠르게 붓습니다. 이제 5 milliliters의 차가운 max 버퍼로 세포를 세척하고, 생존 세포 수를 측정합니다.

먼저 CD 1 61 양성 세포를 선택하기 위해 염색용으로 일부 분량을 덜어냅니다. 농축된 T 세포를 980 µL의 차가운 max buffer에 재현탁시킨 후, 10 µg의 anti CD 1 61 단일클론 항체와 함께 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 세척한 후, 펠릿을 800 µL의 max buffer와 200 µL의 anti-US IgG one microbeads에 재구성합니다.

이 용액을 4 °C에서 10분 동안 더 배양합니다. 세포를 마이크로비즈와 함께 배양하는 동안, LS 컬럼을 평형화하기 위해 max buffer 3 mL를 첨가합니다. 이 세포 분획을 세척한 후, max buffer 3 mL에 현탁된 세포를 컬럼에 천천히 파이펫으로 분주합니다.

이제 컬럼을 3 mL의 신선한 max buffer로 세 번 헹굽니다. 그런 다음 신선한 max buffer 3 mL를 컬럼에 추가하고 컬럼을 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 정제된 CD161 양성 CD3 양성 세포를 밀어내어 수집한 후, NKT 세포가 농축된 분획의 수를 측정합니다.

농축된 CD161 양성 CD3 양성 T 세포 10⁶개와 AAPC 10⁶개를 16 mL의 완전 배지가 담긴 플레이트에서 공동 배양하며 이 단계를 시작합니다. 공동 배양액 160 µL를 저증발 덮개가 있는 조직 배양 처리된 폴리스티렌 U-bottom 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 12~14일 차에 세포를 수확하고 수를 측정합니다. 유세포 분석으로 세포 집단을 분석한 후 다시 공동 배양합니다.

방금 시연한 것처럼 확장된 NKT 세포 중 추가분은 냉동 보관합니다. A APC 세포의 기능성을 테스트하기 위해, 먼저 96-웰 U-바닥 플레이트에 완전 배지 200 µL의 최종 부피로 웰당 5×10⁴개의 NKT 세포와 5×10⁵개의 A APC를 함께 공배양합니다. 24~48시간 후, ELISA 분석을 위해 세포 배양 상청액을 수집합니다. 첫 번째 그림은 여기에서 보는 바와 같이 CD1D IG 단백질이 자성 비드의 표면에 안정적으로 고정되었음을 보여줍니다.

이 그래프에서 나타난 바와 같이, CD 1D IG와 anti CD 28 항체 모두 자기 비드 표면에 발현되어 있습니다. V alpha 14 양성 마우스 NK T 세포 하이브리도마 DN 30 2D three를 medium soluble alpha galera 항원이 적재되지 않은 A A PC 또는 alpha gal이 적재된 A A PC와 함께 공배양하였습니다. 이후 배양 상층액을 수확하고, Eliza를 통해 IL two 생성을 측정하여 각 항원 제시 세포 배치를 테스트하는 간단한 방법을 제공하였습니다. 본 실험에서는 자기 비드 분리법을 통해 인간 CD 1 61 양성 CD three 양성 말초혈액 T 세포를 농축하였습니다.

그 후 세포를 14일 동안 일주일에 한 번 alpha galera가 로딩된 A A PC로 자극하고 V alpha 24 및 V beta 11 발현을 분석하였습니다. 중요한 점은, 초기 NKT 세포 집단이 0.03%로 비교적 낮았음에도 불구하고, 세포를 약 67%의 V alpha 24 양성 V beta 11 양성 집단으로 확장할 수 있었다는 것입니다. 여기서는 C one R CD 1D 세포를 Alpha Gal SER 항원의 존재 또는 부재 하에 표시된 비율로 NKT 세포와 함께 96-well U-bottom 플레이트에서 20~24시간 동안 배양하였습니다.

B 세포 림프종 세포주의 NKT 세포 매개 세포 용해능을 크롬 방출 분석법으로 평가하였습니다. PC에서 확장된 NKT 세포는 해당 림프종 세포주를 용해할 수 있었습니다. 알파 갈락토세라마이드의 존재 여부에 따라, 건강한 자원봉사자와 암 환자 모두의 PBMC로부터 NKT 세포를 확장하였으며, 알파 갈락토세라마이드를 로딩하였습니다.

PC를 통해 두 그룹 모두에서 NKT 세포 군집을 확장할 수 있었습니다. 200만 개의 CD161 양성 CD3 양성 T 세포를 시작 군집으로 사용할 때, 2회의 확장 과정을 거쳐 10⁷개 이상의 세포를 얻을 수 있습니다. 이렇게 확장된 NKT 세포는 본 실험에서 입증한 바와 같이 기능 연구에 사용할 수 있습니다.

ex vivo로 확장된 NKT 세포는 Alpha GAL 자극에 계속 반응하며 IL 17 A, TNF alpha 및 interferon gamma를 강력하게 생성합니다. 초기 T-세포 농축군이 적어 두 번째 CD 1 61 농축 단계를 수행할 수 없는 경우, A A PC 매개 확장이 예상한 결과를 얻지 못할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 하지만 순환 NKT 세포의 비율이 0.1%보다 높다면 invariant NKT 세포의 유의미한 확장을 여전히 얻을 수 있을 것입니다.

종합적으로, 이러한 데이터는 CD 1D 기반 A A PC가 일차 인간 NK T 세포를 효과적으로 증식시키고 자극하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이 절차 이후에는, NK T 세포 활성화의 역학이 어떻게 되는지와 같은 추가적인 의문에 답하기 위해 QPCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 간질환 분야의 연구자들이 지방간 질환에서 NKT 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.