자기 공명 영상 준비, 정화하고, 명암 요원 이용 란탄족 단지의 특성화

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 거대분자를 표지하는 데 사용할 수 있는 란탄족 함유 복합체를 합성, 정제 및 특성화하는 것입니다. 이는 먼저 금속 출발 물질과 리간드를 혼합하면서 용액의 pH를 제어함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 투석을 사용하여 생성된 복합체를 정제하는 것입니다.

다음으로, 자유 금속의 부재를 확인해야 합니다. 절차의 마지막 단계는 이미징과 관련된 복합체의 특성을 특성화하는 것입니다. 궁극적으로, 합성된 복합체가 이완 활성 측정을 통해 조영제로 작용한다는 것을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 조영제의 물 배위수가 단백질에 결합할 때 변하는지 여부와 같은 이미징 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 개인은 pH를 신중하게 제어하면 LI가 생성되고 생물 교육에 쓸모가 없기 때문에 이 방법이 필요합니다. 투석 및 활동 측정을 시연하는 것은 Buda와 Sashi가 될 것입니다.

제 연구실의 대학원생들: 란탄족 염을 사용하여 측정을 시작하려면 먼저 리간드 1개를 물에 용해시켜 30-265밀리몰 용액을 생성합니다. 리간드 Paraiso Benzyl DTPA는 73 Millimolar의 농도로 여기에 사용됩니다. 다음으로, 1 몰 수산화 암모늄을 첨가하여 리간드 용액의 pH를 5.5에서 7 사이로 조정하십시오.

이 비디오에서는 0.2 밀리리터의 1 몰 수산화 암모늄 용액을 사용하여 1-2 량의 염화란탄족을 물에 용해시켜 5-1000 밀리 몰 농도의 용액을 생성합니다. 유로 비븀 클로라이드 또는 가돌리늄 클로라이드는 111 밀리몰의 농도로 사용할 수 있습니다. 종종 과도한 금속은 환기를 완료하고 결과적으로 정화를 단순화하는 데 사용됩니다.

다음으로, 교반하면서 준비된 리간드 용액에 라단 염의 각 용액을 첨가합니다. 이제 0.2 몰 수산화 암모늄을 첨가하여 생성 된 반응 혼합물의 pH를 5.5에서 7 사이로 조정하십시오. 여기서, 총 0.5 밀리리터의 0.2 몰 수산화 암모늄 용액을 사용하여 용액을 조정한다.

사용 중인 리간드에 산에 민감한 작용기가 포함되어 있는 경우 이 단계에서 pH를 여러 번 조정하십시오. 용액이 너무 염기성이 되면 이소티오시아네이트와 같은 염기에 민감한 작용기를 사용할 수 없게 되므로 pH를 조정할 때 주의하십시오. 접합의 경우 pH 측정을 통해 반응을 면밀히 모니터링하십시오.

pH가 일정하게 유지되면 반응이 완료됩니다.염기에 민감한 작용기가 없는 리간드의 경우 pH를 높이는 것과 관련된 정밀 검사도 유용할 수 있습니다. 투석 정밀 검사를 시작하려면 샘플 부피를 담을 수 있는 적절한 투석 튜브의 길이와 샘플 부피의 10%를 추가로 수용할 수 있는 추가 길이를 결정합니다. 그런 다음 제조업체 지침에 따라 튜브를 이 길이로 자릅니다.

이 비디오에서는 100-500 Dalton 분자량 차단 멤브레인을 사용했지만, 더 큰 분자량 차단 튜브를 적절하게 사용할 수 있습니다. 다음으로, 투석액 역할을 할 물을 투석 저장통에 채웁니다. 여기에는 1리터 비커가 사용됩니다.

투석액은 샘플의 약 100배여야 합니다. 이제 튜브의 한쪽 끝을 두 번 접고 접힌 부분을 투석 마개 클램프로 고정합니다. 마개 끝을 고무 밴드로 감싸 투석 중에 닫힌 상태로 유지되도록 합니다.

0.2 미크론 필터를 통해 미리 준비된 반응 혼합물을 여과합니다. 그런 다음 여과액을 튜브의 열린 끝 부분에 넣습니다. 튜브가 찢어지지 않도록 주의하십시오.

튜브를 닫을 수 있는 충분한 헤드 공간을 남겨 두십시오. 튜브의 나머지 열린 끝을 두 번 접은 다음 마개로 고정하고 고무 밴드로 마개를 감쌉니다. 다음으로, 다른 고무 밴드를 사용하여 투석 튜브의 한쪽 끝에 있는 클램프에 공기가 들어있는 유리 바이알을 부착합니다.

그런 다음 모래가 들어 있는 바이알을 다른 클램프에 부착합니다. 이 바이알은 튜브가 투석액에 잠긴 상태로 유지되도록 합니다. 이제 투석액이 들어 있는 투석 탱크에 전체 튜브를 놓습니다.

자기 교반 플레이트를 사용하여 주변 온도에서 느린 속도로 투석액을 저어줍니다. 교반 속도가 느리게 유지되고 용액이 느리지 않은지 확인하십시오. 소용돌이. 하루에 걸쳐 다이얼레이트를 세 번 변경합니다.

이 비디오에서는 다이얼레이트가 2.5, 6.5 및 11.5시간으로 변경됩니다. 총 20-28시간 동안 밤새 투석을 계속합니다. 투석이 완료되면 다이얼에서 튜브를 제거하고 마개 하나를 조심스럽게 열어 검체를 제거합니다.

투석 튜브를 물로 세 번 세척하고 세척액을 샘플과 결합합니다. 마지막으로, 여기에서 감압 하에서 샘플에서 물을 제거합니다. 이것은 동결 건조에 의해 이루어집니다.

샘플을 동결한 다음 동결 건조 장치에 놓습니다. 시료 내 유리 금속의 존재 여부를 평가하려면 먼저 물 400ml에 아세트산 1.4ml를 용해시켜 아세테이트 완충액을 준비하고 수산화암모늄 1몰로 pH를 5.8로 조정하고 물을 첨가하여 총 부피 500ml를 생성합니다. 그런 다음 0.3 밀리리터의 완충액에 0.3 밀리그램의 각 복합체를 용해시킵니다.

이제 pH 5.8 완충액에서 16마이크로몰이어야 하는 xol 주황색 지시약을 준비합니다. 이 지시 용액 3ml를 이전에 용해된 금속 착물에 첨가합니다. 표시기가 노란색에서 보라색으로 색상 변화를 관찰하여 자유 금속의 존재를 감지합니다.

원하는 경우, 검량선을 생성하여 자유 금속의 양을 정량화할 수 있습니다. 유리 금속이 남아 있는 경우 특성 분석 전에 투석 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 샘플을 추가로 정제해야 합니다. 다음으로, 아편 샘플에 대한 물 배위 수를 결정하기 위해, 물에 있는 아편 함유 복합체의 약 1밀리몰의 용액을 준비한 다음 산화중수소에서 동일한 농도의 다른 용액을 준비합니다.

분석하기 전에 중수소 산화물 용액을 증발시키고 중수소 산화물에 세 번 용해시켜 잔류 물을 제거하고, 분광 형광계를 켜고, 물 용액을 깨끗한 vete에 추가하고, vete를 분광 형광계에 넣어야 합니다. 이제 여기(excitation)와 방출(emissions)을 수행하여 각각 약 395나노미터, 595나노미터에서 각각의 최대값을 결정합니다. 다음으로, 방금 결정한 여기 파장 및 방출 파장과 여기에 표시된 매개변수를 사용하여 인광 시간 감쇠 실험을 수행합니다.

방금 얻은 발광 붕괴 데이터에서 준비된 중수소 산화물 용액, 즉 시간 대비 강도의 자연 로그로 이 단계를 반복합니다. 이 선의 기울기는 감쇠 속도입니다. 이 비디오에서는 Microsoft Excel 2007을 사용하여 원시 데이터에서 자연 로그 플롯을 생성했습니다.

여기에서 볼 수 있는 hors와 coworkers가 개발한 방정식의 감쇠율을 사용하십시오. 리간드에 금속에 배위된 OH 또는 NH 그룹이 포함되어 있는 경우 사용하기 전에 방정식을 수정해야 합니다. 먼저 샘플의 상대성 측정을 결정하려면 이완 시간 분석기에서 원하는 애플리케이션 모드(T one 또는 T two)를 선택합니다.

여기에서 T one 설정이 선택됩니다. 다음으로, 무인수 용매에서 서로 다른 농도의 란탄족 함유 복합체를 포함하는 일련의 샘플을 준비합니다. 여기서, 물은 10, 5, 2, 0.5, 1.25, 0.625 및 0의 용매 및 용액으로 사용됩니다.

밀리몰이 준비됩니다. 다른 무인수 용매 또는 완충액을 사용할 수 있지만 용매를 블랭크로 사용하는 것이 중요합니다. 샘플의 최종 부피는 사용 중인 기기에 따라 다릅니다.

기기에 샘플을 넣고 이 비디오에 사용된 장치의 경우 섭씨 37도인 기기 온도와 평형을 이루도록 5분 동안 그대로 둡니다. 이제 T 1 또는 T 2에 대한 부드러운 지수 곡선을 얻기 위해 소프트웨어의 매개변수를 조정하여 이완 시간을 초 단위로 결정합니다. 블랭크를 포함한 모든 샘플에 대해 이 작업을 반복합니다.

이제 측정된 T 1 또는 T 2 이완 값의 역을 계산하고 플롯합니다. 라단 농도 및 밀리몰 단위에 대한 이러한 값은 그래프를 직선으로 맞춥니다. 적합선의 기울기는 릴렉스 활동으로, T: 1 및 T 2에 대해 각각 R 1 또는 R 2입니다.

여기서 우리는 중재와 정화를 위한 일반적인 계획을 볼 수 있다. 이 체계는 methation에 대한 일반적인 절차와 다른 정제 뿌리를 선택하는 이유를 설명합니다. 여기서 우리는 감쇠의 자연 로그가 표시된 대표적인 발광 붕괴 플롯을 볼 수 있으며, 시간과 시간에 대한 물 및 중수소 산화물 용액에 필요한 유사한 곡선에서 생성된 선의 기울기를 방정식 1과 함께 사용하여 아편 함유 복합체의 물 배위 수를 결정합니다.

livity 측정의 대표적인 예는 여기에서 볼 수 있으며, 피팅 라인의 기울기는 샘플의 T 1 livity입니다. 프로토콜에 설명된 수분 배위수 및 생명체 특성화 외에도 표준 화학 기술을 사용하여 최종 제품을 특성화하는 것도 중요합니다. 화합물의 정체는 가돌리늄 및 아편 함유 복합체에 대한 진단용 동위원소 패턴을 보여주는 질량 분석기를 사용하여 얻을 수 있습니다.

이 절차에 따라 endr 분광법 HPLC 및 원소 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 생성된 복합체를 추가로 특성화할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생물학적 거대분자를 라벨링하는 데 사용할 수 있는 란탄족 함유 복합체를 합성, 정제 및 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.