Name: 자기 공명 영상 준비, 정화하고, 명암 요원 이용 란탄족 단지의 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 배우세요 란탄족 단지의 합성, 투석 정화 및 자기 공명 영상 특성화 방법을. 이 기술은 생체 대분자 표지 및 영상 대비제 개발에 필수적입니다.

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우리는 기꺼이 웨인 스테이트 유니버 시티 (MJA), 연구 (SMV)를 노화에 대한 미국 재단에서 부여하고 독립 직업 전환 의생명 이미징 국립 연구소에서 수상 (R00EB007129)과 국립 연구소의 생물로 패스에서 시작 자금을 인정 보건 (MJA).

1. LnCl 3 소금을 사용 Metalation <ol><li> 30-265 mm의 솔루션을 생산하기 위해 물속에 리간드를 해산. 리간드 2 - (4 - isothiocyanatobenzyl) diethylenetriamine pentaacetic의 산성 (P - SCN - BN - DTPA)는 73 mm의 농도에서이 비디오에 사용되었습니다. </li><li> 1 M NH 4 OH를 추가하여 5.5 및 7.0 사이의 리간드의 솔루션의 산도를 조정합니다. 이 비디오에서, 1 M NH 4 OH 솔루션의 0.2 ML 사용되었다. </li><li> 5,000에서 1,000 사이 mm의 농도와 솔루션을 생산하기 위해 물에 LnCl 세 1-2에 상응하는 디졸브. 이 비디오에서는 EuCl 3 GdCl 3 111 mm의 농도에 사용되었습니다. 금속의 초과는 종종 완료 metalation을 유도하고 결과적으로 정화 작업을 단순화하는 데 사용됩니다. </li><li> 교반하면서 리간드의 솔루션에 LnCl 3 솔루션을 추가합니다. </li><li> LnCl 3 추가 후, 0.2 M NH 4 OH를 추가하여 5.5 및 7.0 사이에 발생하는 반응 혼합물의 산도를 조정합니다. 0.2 M NH 4 OH 솔루션의 0.5 ML 총이 동영상에 사용되었습니다. 귀하의 리간드가 산성에 민감한 기능 그룹을 포함하는 경우이 단계에서 산도를 여러 번 조정합니다. 주의 - 솔루션도 기본되면 모든 기본 기능 민감한 그룹, isothiocyanate와 같은 활용을 위해 사용할 수 없게 표시됩니다. </li><li> 산도 측정을 통해 반응을 모니터링합니다. 산도 상수 남아 때 반응이 완료됩니다. </li></ol> 2. 육아 산도의 검사 결과 (이 동영상에 포함되어 있지만, 기본 기능에 민감한 그룹없이 리간드에 도움되지 않음) <ol><li> ≥ 11 산도를 조절하기 위해 반응 혼합물에 NH 4 OH를 집중 추가합니다. 이 단계는 불용성 수산화 같은 uncomplexed 금속을 촉진합니다. </li><li> 0.2 μm의 필터를 통해 뜨는을 필터링합니다. 반응 혼합물은 필터를 나막신 경우, centrifuging 사전 필터링 decanting 권장합니다. </li><li> 투석을 수행하지 않는 경우, 압력 감소 (회전 증발 또는 동결 건조 권장)에서 용매 제거합니다. </li><li> 무료 란탄족가 남아있을 경우 단계 2.1-2.3 반복 수 있습니다. </li></ol> 3. 투석 검사 결과 <ol><li> 추가 길이 (샘플 볼륨의 약 10 %) 떠나면서 샘플 볼륨을 개최 적절한 길이 (제조 업체의 지침을 따르십)에 투석 튜브 컷. 이 비디오에서는 100-500 달튼 분자량 컷 - 오프 (MWCO) 멤브레인 사용되었지만, 활용이 metalation하기 전에 수행하는 경우 큰 MWCO 튜빙을 적절하게 사용할 수 있습니다. 또한, 투석 카세트가 원하는 경우 투석 튜브에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 제조 업체의 지침에 따라 해당되는 경우, 주변 온도에서 15 분 물에 컷 투석 튜브를 만끽해보세요. </li><li> 물 (dialysate)와 투석 저수지 (1 L의 비커이 동영상에 사용되었습니다) 입력합니다. dialysate 볼륨은 약 100x 그 샘플의해야합니다. </li><li> 팔짱을 두 번 튜브 끝과 투석 폐쇄 클램프로 튜브의 접힌 부분을 확보. 그것이 투석 도중에 폐쇄 상태를 유지하기 위해 고무 밴드와 폐쇄의 끝을 넣어. </li><li> 0.2 μm의 필터를 통해 반응 혼합물을 필터와 튜브를 찢어하지 않도록주의되는 튜브의 오픈 엔드에 여과물를로드합니다. 튜브를 닫습니다 충분한 머리 공간을 남겨주십시오. </li><li> 두 번, 폐쇄와 함께 안전하고, 단계 3.4에서와 같이 고무 밴드로 폐쇄 랩 튜브의 나머지 열린 끝을 접으십시오. </li><li> 고무 밴드를 사용하여 투석 튜브의 한쪽 끝을에서 클램프에 공기가 들어있는 유리관을 연결합니다. 다른 클램프로 모래가 담긴 병을 연결합니다. 이러한 튜브는 튜브가 dialysate에 포장되어 유지되었는지 확인합니다. </li><li> dialysate를 포함 투석 저수지에 전체 튜브를 놓습니다. </li><li> 주위 온도에서 느린 속도 (없음 vortexing)에서 자기 저어 접시를 사용하여 dialysate을 저어. </li><li> 하루 코스 (이 동영상에 dialysate가 2.5, 6.5, 및 11.5 H로 변경되었습니다)을 통해 배 dialysate를 변경하고 (투석의 20-28 H 총) 투석은 밤새 계속하실 수 있습니다. </li><li> dialysate에서 투석 튜브를 제거하고 신중하게 샘플을 제거 한 폐쇄를 엽니다. 물로 배 투석 튜브를 세척하고 샘플로 세탁을 결합. </li><li> 감소 압력 하에서 물을 제거합니다. 프리즈 건조는이 동영상에서 사용됩니다. </li></ol> 4. 무료로 금속의 존재를 평가 <ol><li> 아세테이트 버퍼에있는 금속 복잡한 디졸브 (버퍼 준비 : 400 ML의 물 속에 초산 1.4 ML를 해산, 1 M NH 4 OH와 5.8으로 산도를 조정, 500 ML 총 볼륨을 생성하는 물을 추가) 및 xylenol을 추가 주황색 표시등 (산도 5.8 버퍼에서 16 μm의). 이 비디오에서는 단지 0.3 MG는 버퍼의 0.3 ML에 해산되었으며 지표 솔루션 3 ML이 추가되었습니다. </li><li>보라색에 노란색에서 표시기의 색상 변화의 관찰을 통해 무료로 금속의 존재를 감지합니다. </li><li> 원하는 경우, 무료 금속의 금액은 교정 곡선 1을 만들어 계량하실 수 있습니다. 또는 염료 arsenazo III는 xylenol 오렌지 2 대신 사용할 수 있습니다. 무료로 금속이 남아있을 경우 예제는 더 이상 이전 특성에 투석, 탈염 열, 또는 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC)를 사용하여 정화되어야합니다. </li></ol> 5. 수상 조정 번호 (Q)의 결정 <ol><li> H 2 O에서 복잡한 (~ 1 ㎜)을 포함하는 III - EU의 솔루션과 D 2 O.에서 같은 농도의 다른 솔루션을 준비 이전 분석, D 2 O 솔루션은 잔류 H 2 O.을 제거하는 세 번 증발와 D 2 O에 용해되어야합니다 </li><li> 깨끗한 쿠베트에 물 솔루션을 추가하고, spectrofluorometer에 쿠베트를 놓습니다. </li><li> 각 (~ 395 nm의와 ~ 595 nm의, 각각)의 맥시멈을 결정하기 위해 여기와 방출 스캔을 수행합니다. </li><li> 여기와 단계 5.3 여기 및 발광 슬릿 너비 (5 NM), 플래시 개수 (100), 초기 지연 (0.01 MS), 최대 지연 (13 MS)에서 결정 방출 파장 다음 매개 변수를 사용하여 인광 시간 붕괴 실험을 수행 및 지연 증가 (0.1 MS). 이러한 조건은 대부분의 단지에 적합하지만, 최대 지연과 증가 값은 매우 긴 또는 극단적으로 짧은 붕괴 시간과 함께 증가 또는 종족에 대한 감소 수 있습니다. </li><li> 단계 5.1 준비 D 2 O 솔루션 단계 5.4를 반복합니다. </li><li> 5.4 및 5.5에서 얻어진 발광 - 붕괴의 데이터에서, 강도 대 시간의 자연 로그를 플롯. 이 라인의 경사가 붕괴 속도 (τ -1) (그림 2)입니다. 이 비디오에서 Microsoft Excel 2007 원시 데이터에서 자연 로그 플롯을 생성하는 데 사용되었다. 호록스 및 동료 (EQ 1) 3 개발한 방정식의 붕괴 속도를 사용합니다. 귀하의 리간드가 금속에 맞춰 조정 OH 또는 NH 그룹을 포함하는 경우, 다음 방정식이 사용하는 세 전에 수정해야합니다. </li></ol> EQ 1 : <img src="/files/ftp_upload/2844/2844eq1.jpg" alt="방정식 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 1"> 6. Relaxivity 측정 <ol><li> T 1 (세로 완화 시간) 또는 T 2 (가로 휴식 시간) 휴식 시간 분석기에 원하는 응용 프로그램 모드를 선택합니다. </li><li> GD의 다른 농도 III 함유 수성 용매에서 복잡한을 포함 샘플 시리즈를 준비합니다. 이 비디오에서는, 물은 0.625, 1.25, 2.50, 5.00, 10.0의 용매 및 솔루션으로 사용되었다, 0 MM이 준비되었습니다. 기타 수성 용매 또는 버퍼를 사용하지만, 그것은 빈으로 솔벤트를 사용하는 것이 중요합니다 수 있습니다. 예제의 마지막 볼륨 사용되고있는 악기에만 적용됩니다. </li><li> 악기의 샘플을 장소와 그것이 악기 (37 ° C이 비디오에서)의 온도 평형 5 분 앉아 보자. </li><li> T 1 T 2 (T 1과 T 2 대표적인 곡선 그림 3에 표시됩니다)에 대한 원활한 지수 곡선을 얻기 위해 소프트웨어의 매개 변수를 조정하여 휴식 시간 (s의 단위)를 확인합니다. </li><li> 단계 6.3 및 빈 포함한 모든 샘플 6.4 반복합니다. </li><li> S -1 단위로 측정된 T 1 T 2 값의 역수를 계산합니다. </li><li> T 1 -1 또는 T GD III 농도 비교 2 -1 값 (mm의 단위) 플롯. 때문에 GD III -가 포함된 단지의 흡습 특성, 원자 흡수 분광 광도법 또는 유도 결합 플라즈마 질량 분광법을 사용하여 GD III의 농도를 확인합니다. 직선과 줄거리를 맞습니다. 대표 플롯은 그림 4에 표시됩니다. </li><li> 장착되어 라인의 경사가 relaxivity (T 1과 T 2 각각에 대한 R 1 R 2)이며, MM -1 S -1의 단위를했다. </li></ol> 7. 대표 결과 이 프로토콜에서 설명하는 단계에 대한 대표적인 데이터는 테이블과 인물 섹션에 포함되었습니다. 프로토콜에서 설명한 물 조정 번호와 relaxivity 특성화 이외에, 그것은 표준 화학 기술을 사용하여 최종 제품을 특성화하는 것이 중요합니다. 및 EU III -가 포함된 단지는 그림 5에 표시된 - 화합물의 신분은 질량 분광법 및 질량 스펙트럼 대표 GD III에 대한 진단 동위 원소 패턴을 보여주는을 사용하여 얻을 수있다. 또한, 비 - GD III에 대한 <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 metalation 및 정화를위한 일반적인 제도 :. 제도 metalation와 다른 정화 경로를 선택하는 이유에 대한 일반적인 절차를 묘사. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 - 발광 강도를 줄거리 :. 강도 비교 섹션에서 5 시간의 자연 로그의 대표 플롯. 물, D 2 O 솔루션에 대한 인수와 비슷한 곡선에서 생성된 라인의 슬로프는 EU의 물 조정 번호 III 함유 단지를 특성화 EQ 1 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 휴식 붕괴 시간 곡선 :. (왼쪽) T 1 (오른쪽) T이 취득 대표 데이터입니다. 이러한 곡선 모양의 편차가 신뢰할 데이터를 생산합니다. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 Relaxivity 결정 :. GD III의 농도 비교 1 / T 1 대표 플롯. 장착되어 라인의 경사가 relaxivity이며 MM -1 S -1의 단위를했다. <img src="/files/ftp_upload/2844/2844fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5 질량 스펙트럼 :.위한 진단 동위 원소 패턴을 보여주는 대표적인 질량 스펙트럼 (왼쪽) GD III 함유 단지과 (오른쪽) 약속 III 함유 단지 있습니다. 검은 가우스 봉우리는 이론 동위 원소 분포를 나타내며 빨간색 라인은 실제 데이터입니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

란탄족 기반 대비 요원 4-14을 포함 출판물의 증가 감안할 때, 그것은 치료가, 준비 정화하고, 재현성과 유사한 결과를 보장하기 위해 제품을 특성화로 촬영하는 것이 중요합니다. 이 단지는 종종 정화하고 상자 성체의 자연과 bioconjugation 사용할 수있는 기능 그룹의 감도에 따라 유기 분자에 상대적 성격 도전 간주됩니다. 우리는 란탄족 단지의 합성, 정제 및 특성에 대한 일반적인 방법을 설명합니다. 그러나 이러한 방법 중 하나를 선택할 때 그것은 연구되고있는 특정 시스템을 고려하는 것이 중요합니다. complexation 반응에서 상업적으로 사용할 수있는 금속 소금의 다​​양한 사용과 소금의 선택은 연구의 목적에 따라 수 있습니다. 예를 들어, 염화 (또는 triflate 또는 질산) 소금을 사용하는 장점은 비교적 온화 조건이 온도와 관련하여 필요한 것입니다. 그러나 이러한 방법은 산도주의 모니터링을 필요로하고 부산물로 소금을 생산합니다. 공부중인...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 및 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> EuCl 3 • 6H 2 O </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 203254 - 5G </td></tr><tr><td> P - SCN - BN - DTPA </td><td> Macrocyclics </td><td> B - 305 </td></tr><tr><td> 암모늄 수산화 </td><td> EMD </td><td> AX1303 - 3 </td></tr><tr><td> 스펙트럼 / 포어 바이오 셀룰로오스 에스터 (CE) 투석 막 - 500 D MWCO </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 68-671-24 </td></tr><tr><td> Millipore IC Millex - LG 필터 유닛 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> SLLG C13 NL </td></tr><tr><td> xylenol 오렌지 tetrasodium 소금 </td><td> 알파 Aesar </td><td> 41,379 </td></tr><tr><td> 초산 </td><td> Fluka </td><td> 49,199 </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구소 주식 회사 </td><td> DLM - 4-25 </td></tr><tr><td> 정수기 </td><td> ELGA </td><td> Purelab 울트라 </td></tr><tr><td> 고성능 액체 크로마 토그래피 및 질량 분광법 </td><td> Shimadzu </td><td> LCMS - 2010EV </td></tr><tr><td> 휴식 시간 분석기 </td><td> Bruker </td><td> mq60 minispec </td></tr><tr><td> UV - 마주 분광 광도계 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 20-624-00092 </td></tr><tr><td> 동결 건조기 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 10-030-133 </td></tr><tr><td> 산도 측정기 </td><td> 한나 스트 루먼트 </td><td> HI 221 </td></tr><tr><td> spectrofluorometer </td><td> 호리바 조빈 이본 </td><td> Fluoromax - 4 </td></tr><tr><td> 매튜 먼로의 분자량 계산기 버전 6.46은 2009 년 10월 17일을 다운로드 </td><td> <a href="http://ncrr.pnl.gov/software/">http://ncrr.pnl.gov/software/</a> </td><td> 분자량 계산기 </td></tr></tbody></table>

자기 공명 영상 준비, 정화하고, 명암 요원 이용 란탄족 단지의 특성화

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate 기반 리간드는 일반적으로 란탄족 이온을 킬레이트하는 데 사용하고, 그 결과 단지는 자기 공명 영상 (MRI)에 대한 대비를 대리인으로 유용합니다. 그들이 기능을 빠르고, 높은 순도를 허용 그룹 및 아민 반응 활성 에스테르 및 isothiocyanate 그룹 또는 thiol 반응 maleimides 통해 macromolecules 및 biomolecules에 높은 항복 활용을 포함하기 때문에 많은 상용 리간드 특히 유용합니다. 이러한 리간드의 metalation가 bioconjugation 화학, metalation 절차에 미묘한 차이의 분야에서 일반적인 지식으로 간주되는 동안 금속 시작 재료를 선택할 때 고려되어야합니다. 또한, 정화 및 특성이 존재하고, 가장 효과적인 절차의 선택에 대한 여러 옵션을 부분적으로 시작 물질의 선택에 따라 달라집니다. 이러한 미묘한 차이는 종종 출판 프로토콜에서 무시됩니다. 여기, 우리의 목표는 metalation, 정화하고, MRI (그​​림 1)에 대한 대비 에이전트로 사용할 수 있습니다 란탄족 단지의 특성화를위한 일반적인 방법을 입증하는 것입니다. 우리는이 책자는 생명 의학 과학자 시작 자료 및 정화 방법의 선택을 완화하여 일반적으로 사용되는 반응을 자신의 레퍼토리에 란탄족 complexation 반응을 통합할 수있게 것으로 기대합니다.

우리는 metalation, 정화 및 란탄족 단지의 특성을 보여줍니다. 여기에서 설명한 단지는 자기 공명 영상을 사용하여 이러한 분자의 추적 활성화 macromolecules하는 복합 수 있습니다.

폴리아미노폴리카르복실레이트 기반 리간드는 란타넘족 이온을 킬레이트화하는 데 흔히 사용되며, 이를 통해 생성된 착물은 ...을 위한 조영제로 유용합니다.

본 실험 절차의 전반적인 목표는 생체 고분자 표지에 사용할 수 있는 란타넘족 함유 착물을 합성, 정제 및 분석하는 것입니다. 이는 먼저 용액의 pH를 조절하면서 금속 출발 물질과 리간드를 혼합함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 투석을 이용하여 생성된 착물을 정제하는 것입니다.다음으로, 유리 금속의 부재를 확인해야 합니다. 이 절차의 마지막 단계는 영상 촬영과 관련된 복합체의 특성을 분석하는 것입니다. 최종적으로, 이완 활성 측정(relax activity measurements)을 통해 합성된 복합체가 조영제로 작용함을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 조영제가 단백질과 결합할 때 물 배위수가 변하는지 여부와 같이 영상 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 필요한 개인들은 pH를 세밀하게 조절하지 못하면 LI를 생물학 교육에 사용할 수 없게 되므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 투석 및 활성 측정 과정을 시연하는 것은 Buda와 Sashi가 담당할 것입니다.란타넘족 염을 이용한 메테이션(methation)을 시작하기 위해, 먼저 리간드 1 당량을 물에 녹여 30~265 mM 농도의 용액을 조제합니다. 여기서는 Paraiso Benzyl DTPA 리간드를 73 mM 농도로 사용합니다. 다음으로, 1 M 암모늄 하이드록사이드를 첨가하여 리간드 용액의 pH를 5.5에서 7 사이로 조절합니다.이 영상에서는 1 M 암모늄 하이드록사이드 용액 0.2 mL를 사용하여, 물에 용해된 1~2 당량의 란타넘족 염화물을 녹여 5~1000 mM 농도의 용액을 제조합니다. 유로븀 염화물 또는 가돌리늄 염화물을 111 mM 농도로 사용할 수 있습니다. 대개 정제를 간편하게 하고 반응을 완결시키기 위해 금속을 과량으로 사용합니다.다음으로, 교반하면서 준비된 리간드 용액에 각각의 란타넘 염 용액을 첨가합니다. 이제 0.2 M 수산화암모늄을 첨가하여 생성된 반응 혼합물의 pH를 5.5에서 7 사이로 조절합니다. 이때 용액의 pH를 조절하기 위해 총 0.5 mL의 0.2 M 수산화암모늄 용액이 사용됩니다.사용하는 리간드에 산에 민감한 작용기가 포함되어 있는 경우, 이 단계 동안 pH를 여러 번 조정하십시오. 용액이 너무 염기성으로 변하면 Isothiocyanate와 같은 염기에 민감한 작용기를 사용할 수 없게 되므로, pH 조정 시 주의하시기 바랍니다. 결합 과정에서는 pH 측정을 통해 반응을 면밀히 모니터링하십시오.pH가 일정하게 유지되면 반응이 완료된 것입니다. 염기에 민감한 작용기가 없는 리간드의 경우, pH를 높이는 방식의 후처리 과정이 유용할 수 있습니다. 투석 후처리를 시작하려면, 시료 부피를 수용할 수 있는 적절한 길이의 투석 튜브 길이를 결정하고, 시료 부피의 10%를 추가로 수용할 수 있는 여유 길이를 더하십시오. 그다음 제조사 지침에 따라 튜브를 해당 길이로 절단하십시오.본 영상에서는 100~500 Dalton 분자량 컷오프 막을 사용하였으나, 상황에 따라 더 큰 분자량 컷오프 튜빙을 사용할 수 있습니다. 적절한 경우 접합을 메테이션 이전에 수행하십시오. 제조사의 지침에 따라 절단된 투석 튜빙을 상온의 물에 15분 동안 담가 두십시오. 다음으로, 투석액으로 사용할 물을 투석 저장조에 채웁니다. 여기서는 1L 비커가 사용되었습니다.투석액의 부피는 시료 부피의 약 100배가 되어야 합니다. 이제 튜브의 한쪽 끝을 두 번 접고, 접힌 부분을 투석 폐쇄 클램프로 고정합니다. 투석 중에 닫힌 상태가 유지되도록 폐쇄된 끝부분을 고무줄로 감쌉니다.이전에 준비한 반응 혼합물을 0.2 micron 필터로 여과합니다. 그런 다음 여과액을 튜빙의 열린 끝부분에 넣습니다. 이때 튜빙이 찢어지지 않도록 주의하십시오.튜브를 닫을 수 있도록 충분한 헤드 스페이스를 남겨두십시오. 튜브의 남은 열린 끝부분을 두 번 접은 다음, 마개로 고정하고 마개를 고무줄로 감싸십시오. 다음으로, 공기가 들어 있는 유리 바이알을 다른 고무줄을 사용하여 투석 튜브 한쪽 끝의 클램프에 부착하십시오.그런 다음 모래가 들어 있는 바이알을 다른 클램프에 부착하십시오. 이 바이알들은 튜브가 투석액에 계속 잠겨 있도록 보장합니다. 이제 튜브 전체를 투석액이 들어 있는 투석 저장조에 넣으십시오.상온에서 자석 교반기를 사용하여 투석액을 저속으로 교반합니다. 교반 속도를 낮게 유지하여 용액에 볼텍스(vortex)가 발생하지 않도록 주의하십시오. 하루 동안 투석액을 세 번 교체합니다.본 영상에서는 투석액을 2.5, 6.5, 11.5시간에 교체합니다. 총 20에서 28시간 동안 밤새 투석을 계속 진행하십시오. 투석이 완료되면 튜브를 투석액에서 제거하고, 한쪽 밀폐 장치를 조심스럽게 열어 샘플을 꺼냅니다.투석 튜브를 물로 3회 세척하고, 세척액을 샘플과 합칩니다. 마지막으로, 여기에서 감압 상태로 샘플의 물을 제거합니다. 이는 동결 건조를 통해 수행됩니다.시료를 동결시킨 후 동결 건조 장치에 놓습니다. 시료 내 유리 금속의 존재 여부를 평가하기 위해, 먼저 아세트산 1.4 milliliters를 물 400 milliliters에 녹여 아세테이트 완충액을 준비하고, 1 molar 수산화암모늄으로 pH를 5.8로 조절한 뒤 물을 추가하여 최종 부피를 500 milliliters로 맞춥니다. 그런 다음 각 착물을 0.3 milliliters의 완충액에 0.3 milligrams씩 녹입니다.이제 pH 5.8 완충액 내에서 16 micromolar 농도가 되도록 xol orange 지시약을 준비합니다. 이 지시약 용액 3 milliliters를 이전에 용해시킨 금속 착물에 첨가합니다. 지시약의 색이 노란색에서 보라색으로 변하는 것을 관찰하여 유리 금속의 존재를 검출합니다.원하는 경우, 검정 곡선을 작성하여 유리 금속의 양을 정량할 수 있습니다. 유리 금속이 남아 있다면, 특성 분석 전 투석이나 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 시료를 추가로 정제해야 합니다. 다음으로, opium 시료의 수분 배위수를 결정하기 위해, 물에 약 1mM 농도로 opium 함유 복합체 용액을 준비하고, 이어서 중수(deuterium oxide)에 동일한 농도의 또 다른 용액을 준비하십시오.분석 전, 잔류 수분을 제거하기 위해 중수(deuterium oxide) 용액을 증발시키고 다시 중수에 녹이는 과정을 세 번 반복합니다. 분광 형광 광도계(spectro fluorimeter)의 전원을 켜고, 깨끗한 큐벳(vete)에 수용액을 넣은 후 큐벳을 분광 형광 광도계에 배치합니다. 이제 여기(excitation) 및 방출(emissions) 측정을 수행하여 각각 약 395 nanometers와 595 nanometers에서 최대치를 결정합니다. 다음으로, 방금 결정한 여기 및 방출 파장과 여기에 표시된 매개변수를 사용하여 인광 시간 감쇠(phosphorescence time decay) 실험을 수행합니다.준비된 중수(deuterium oxide) 용액으로 이 단계를 반복하십시오. 방금 얻은 발광 감쇄 데이터로부터 강도의 자연로그 값과 시간의 관계를 그래프로 나타냅니다. 이 직선들의 기울기가 감쇄 속도입니다. 이 영상에서는 원시 데이터로부터 자연로그 그래프를 생성하기 위해 Microsoft Excel 2007을 사용하였습니다.여기 제시된 Hors 및 공동 연구자들이 개발한 방정식의 붕괴율을 사용하십시오. 리간드에 금속과 배위 결합된 OH 또는 NH 그룹이 포함되어 있는 경우, 사용 전 방정식을 수정해야 합니다. 샘플의 상대적 측정값을 결정하려면 먼저 완화 시간 분석기에서 T1 또는 T2 중 원하는 응용 모드를 선택하십시오.여기서는 T1 설정이 선택됩니다. 다음으로, 수성 용매에 서로 다른 농도의 란타넘족 함유 착물을 포함하는 일련의 시료를 준비합니다. 여기서는 물이 용매로 사용되며, 용액의 농도는 10, 5, 2, 0.5, 1.25, 0.625 및 0입니다.밀리몰(Millimolar) 농도로 준비합니다. 다른 적절한 용매나 완충액을 사용할 수 있으나, 해당 용매를 블랭크(blank)로 사용하는 것이 중요합니다. 시료의 최종 부피는 사용하는 기기에 따라 다릅니다.시료를 기기에 넣고, 본 영상에서 사용된 장비의 설정 온도인 37 °C에서 온도 평형이 이루어지도록 5분 동안 둡니다. 이제 T1 또는 T2에 대해 매끄러운 지수 곡선을 얻을 수 있도록 소프트웨어 매개변수를 조정하여 초 단위의 완화 시간을 측정합니다. 공백 시료(blank)를 포함한 모든 시료에 대해 이 과정을 반복합니다.이제 측정된 T one 또는 T two 이완 값의 역수를 계산하여 그래프로 나타냅니다. 이 값들을 밀리몰(millimolar) 단위의 Lathan 농도에 대해 도식화하고 직선으로 피팅합니다. 피팅된 직선의 기울기가 이완 활성도가 되며, T one의 경우 R one, T two의 경우 R two가 됩니다.여기서 메틸화 및 정제에 대한 일반적인 체계를 볼 수 있습니다. 이 체계는 메틸화의 일반적인 절차와 서로 다른 정제 경로를 선택하는 이유를 보여줍니다. 여기서는 대표적인 발광 감쇠 도표를 볼 수 있는데, 여기서는 감쇠의 자연로그를 시간에 대해 도식화하였습니다. 물과 중수($\text{D}_2\text{O}$) 용액에 대해 유사한 곡선으로부터 생성된 직선의 기울기를 식 1에 대입하여 $\text{Eu}$ 함유 복합체의 수분 배위수를 결정합니다.활성도(livity) 측정의 대표적인 예가 여기에 제시되어 있으며, 적합된 직선의 기울기가 시료의 T₁ 활성도가 됩니다. 프로토콜에 설명된 물 배위수 및 활성도 분석 외에도, 표준 화학적 기법을 사용하여 최종 생성물을 분석하는 것이 중요합니다. 화합물의 정체는 질량 분석법을 통해 확인할 수 있으며, 가돌리늄(gadolinium)과 오븀(opium) 함유 착물의 특징적인 동위원소 패턴을 보여주는 대표적인 질량 분석 스펙트럼이 여기에 제시되어 있습니다.이 절차에 이어, 생성된 착물을 더욱 상세히 분석하기 위해 ENDR 분광법, HPLC 및 원소 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 생체 고분자 표지에 사용할 수 있는 란타넘족 함유 착물을 합성, 정제 및 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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