3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : 도구는 일반 피부와 흑색증의 진행을 공부하기

이 절차의 전반적인 목표는 멜라닌 세포, 흑색종 및 피부 줄기 세포 생물학 연구를 위한 3D 인간 피부 재구성을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 조직 배양 트레이 삽입부에 중화된 소 콜라겐을 코팅함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 섬유아세포와 콜라겐으로 세포 진피 구획을 만드는 것입니다.

다음으로, 멜라닌 세포 또는 흑색종 세포와 혼합된 각질 세포로 표피 구획을 만듭니다. 절차의 마지막 단계는 18일째에 피부 재건물을 채취하여 피부 재건을 마우스에 이식하는 것입니다. 궁극적으로, 이식편의 면역조직화학 및 면역형광 분석은 멜라닌 세포를 포함하는 정상 피부의 구조, 정상 줄기 세포의 이동 및 분화, 단계별 흑색종 표현형을 보여줍니다.

우리가 20년 전에 피부 재건 모델을 개발한 이유는 연구 초기에 접시에서 배양된 정상적인 멜라닌 세포 또는 흑색종 세포가 조직 맥락에 있는 세포와 매우 다르게 행동한다는 것을 발견했기 때문입니다. 따라서 피부 재건 모델은 세포가 피부의 한 구획에서 다른 장소로 어떻게 이동하는지 보는 데 이상적입니다. 이전에 준비한 무세포 층 콜라겐 혼합물을 얼음에 넣은 다음 밀짚 노란색 용액 1 밀리리터를 6의 각 삽입물에 첨가합니다.

웰 조직 배양 트레이는 겔이 응고될 수 있도록 실온에서 30분 동안 트레이를 배양합니다. 이 시간 동안, 젤이 5 분 후에 0.25 % tripsin EDTA를 가진 그들의 문화 플라스크에서 트립신 눈, 인간적인 fiberblast를 응고시키는 동안 해결책은 노랗고에서 분홍색에 색깔에서 변화해야 합니다. 10%FBS를 포함하는 DMEM을 추가하여 화과정을 중화합니다.

분리된 세포를 실온에서 200G에서 5분간 원심분리하여 채취한 후, 1.5ml당 5번째 세포까지 10배의 4.5배로 세포를 재현탁합니다. DMEM은 10%FBS로 보충되었습니다. 다음으로, 50ml 튜브에 미리 준비된 세포층 콜라겐 혼합물을 채우고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

섬유아세포 현탁액 1.5ml를 튜브에 넣고 잘 섞습니다. 빨대 노란색 세포층 용액 3ml를 각 무세포층 코팅된 삽입물에 추가합니다. 그런 다음 배양 기간 동안 5% 이산화탄소 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 45분 동안 조직 배양 트레이를 배양합니다.

세포층 용액의 색상도 노란색에서 분홍색으로 변경되어야 합니다. 최상층 겔이 응고된 후 조직 배양 트레이의 삽입물 내부에 10%FBS가 포함된 DMEM 2ml를 추가하고 인서트 외부에 10ml를 추가합니다. 조직 배양 트레이를 4일 동안 배양합니다.

4일째에 겔이 수축하는지 확인하면 배양 4일째에 각 인서트의 내부와 외부 모두에서 배지를 흡인합니다. 인서트 내부에 2ml의 워시 미디엄을 추가하고 인서트 외부에 10ml를 추가하여 일반 세럼을 씻어냅니다. 그런 다음 표피 생성을 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 트레이를 배양합니다.

첫 번째 트립신은 인간 각질세포입니다. 그런 다음 5분 후 대두 트립신 억제제를 사용하여 분리된 세포를 200G에서 5분 동안 회전시킨 후 트립신을 중화합니다. Reus는 세포 펠릿을 피부의 밀리리터당 6개의 세포에 4.17 곱하기 10으로 현탁시킵니다.

각질세포를 채취한 후 배지 1을 재구성합니다. 트립신은 1-2분 동안 인간 멜라닌 세포를 얼립니다. 다시 말하지만, 대두 트립신 억제제로 트립신을 중화합니다.

그런 다음 이전과 동일한 조건에서 세포를 회전시킨 후 멜라닌 세포 펠릿을 8.3 곱하기 10으로 피부의 밀리리터당 5번째 세포에 재현탁합니다. 중간 수준도 재구성합니다. 다음으로, 진피층 준비된 조직 배양 트레이의 각 삽입물의 내부와 외부 모두에서 세척 매체를 제거합니다.

1.5ml의 피부를 추가하여 세척 매체를 교체하고 각 인서트의 내부에 1개, 외부에 10ml의 매체를 재구성합니다. 그런 다음 600마이크로리터의 각질세포 세포 현탁액과 600마이크로리터의 멜라닌세포 현탁액을 혼합합니다. 200마이크로리터의 혼합 셀 현탁액을 분배합니다.

각 인서트의 내부로 한 방울 한 방울 떨어뜨립니다. 조직 배양 트레이를 섭씨 37도에서 2일 동안 배양합니다. 세포를 배양한 후 피부를 흡인하고 각 인서트의 내부와 외부 모두에서 배지 1을 재구성한 다음 2ml의 피부를 추가하고 매체를 재구성하고 내부에 2개, 인서트 외부에 10ml를 재구성합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 이틀 동안 더 배양합니다. 두 번째 이틀 배양 후 피부를 흡인하고 각 삽입물의 내부와 외부에서 매체 2를 재구성합니다. 이제 피부 7.5ml를 추가하고 인서트 바깥쪽에만 매체 3을 재구성합니다.

재건물을 인큐베이터에 다시 넣고 피부를 교체합니다. 18일째까지 격일로 중간 3개를 재구성합니다. 배양 18일째에 피부 재구성 적재된 조직 배양 트레이의 삽입물 내부와 외부에서 배지를 흡인합니다.

집게로 트레이에서 삽입물을 제거합니다. 메스 날로 가장자리에 가까운 원을 그려 폴리카보네이트 필터를 포함한 구조물을 잘라냅니다. 그런 다음 단단한 표면의 필터에 재구성을 놓고 블레이드로 반으로 자릅니다.

재구성의 절반을 검은색 TBS 생검 종이에 놓고 종이를 조직학 카세트에 넣습니다. 전체 카세트를 10% 포르말린에 4시간 이상 담그십시오. 그런 다음 카세트를 70% 에탄올에 넣고 파라핀 임베딩을 위해 재구성을 처리할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관합니다.

재구성의 나머지 절반을 섭씨 4도의 50% 자당에 1-2시간 동안 놓습니다. 그런 다음 자당을 2 어금니로 변경 한 다음 섭씨 4도에서 1-2 시간 동안 보관하십시오. 베이스 몰드를 최적의 절단 온도, 동결 매체 또는 OCT로 반쯤 채웁니다.

거품을 피하십시오. 집게로 재구성의 가장자리를 잡고 자당에서 재구성을 제거합니다. 자당이 흡수될 때까지 Kim 물티슈에 놓습니다.

집게와 주걱을 사용하여 재구성을 OCT 상단의 보트로 옮깁니다. 보트가 완전히 가득 찰 때까지 재구성 상단을 더 많은 OCT로 덮습니다. 다시 말하지만, 거품을 피하십시오.

OCT가 완전히 얼도록 으깬 드라이아이스에 보트를 골고루 올려 놓습니다. 그런 다음 기본 금형과 호일을 감싸고 저온 유지 장치로 절단할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 70도에서 보관하십시오. 마우스의 피부 재건 이식을 준비하려면 용기에 액체 질소를 채우고 50ml 튜브에 5ml의 DMEM을 추가합니다.

비커에 수돗물 600ml를 채우고 열판 위에 비커를 올려 따뜻하게 합니다. 그런 다음 생후 약 6주 동안 암컷 스키드 털이 없는 근친 마우스를 선택합니다. 불소로 마우스를 마취 한 후.

시술 내내 마취를 유지하기 위해 노즈콘을 사용하십시오. 멸균 안과 윤활제를 바르고 저체온증을 방지하기 위해 열 지원을 제공합니다. 다음으로, 복합 벤조인 팅크와 알코올 준비 면봉으로 마우스 피부를 청소합니다.

나중에 봉합할 수 있도록 동일한 위치를 유지하기 위해 마우스 뒷면 위에 선을 표시합니다. 홍채 가위와 집게를 사용하여 마우스 등에 동그란 상처 부위를 자른 다음 멸균 거즈 스폰지로 상처 부위를 덮습니다. 둥근 마우스 피부를 DMEM의 50ml 튜브에 넣습니다.

모든 매체와 조직이 완전히 얼 때까지 튜브를 액체 질소 용기에 담그십시오. 그런 다음 완전히 해동될 때까지 뜨거운 물이 담긴 비이커에서 튜브를 해동합니다. 이 과정을 반복하고 절차를 세 번 동결 및 해동합니다.

수술용 칼날을 사용하여 삽입물에서 피부 재건물을 분리합니다. 멤브레인을 매우 조심스럽게 제거한 다음 피부 재건을 마우스 상처 베드 상단으로 옮깁니다. 이제 스킨 재구성 위에 마우스 스킨을 놓습니다.

첫 번째 봉합사는 이전에 표시된 마커 위에 있고 두 번째 봉합사는 아래쪽에 있는지 확인합니다. 그런 다음 피부 측면에 두 개의 봉합사를 더 사용하여 마우스 피부를 고정합니다. 이식 후 마우스 피부를 청소한 다음 마우스를 새 케이지에 넣습니다.

18일째. 피부 재건술의 표피는 층화된 각질세포층으로 구성되어 있으며, 미분화된 기저층과 순차적으로 분화된 층은 수직 지향적입니다. 멜라닌 세포 마커로 재구성 섹션을 염색합니다.

검은색 화살표로 표시된 S 100은 멜라닌 세포가 표피의 기저층에 정렬되어 있으며 수상돌기 확장을 통해 여러 각질 세포와 소통하고 있음을 보여줍니다. 진피 구획에는 콜라겐 유형 1 기질에 내장된 섬유아세포가 포함되어 있으며, 콜라겐 4는 표피와 진피를 분리하는 기저막을 나타냅니다. 다음 그림은 표피에 있는 여러 층의 각질 세포가 어떻게 발달하는지 보여줍니다.

GFP 렌티바이러스 벡터로 표지된 진피 줄기세포에 섬유아세포가 삽입된 경우. 콜라겐 유형 1 기질에서는 표피로 이동하여 5일째에 멜라닌 세포로 분화합니다. 각질세포를 파종한 후, 단세포는 구체에서 이동하기 시작합니다.

표피는 여전히 단일 층으로 구성되어 있습니다. 8일째. 소수의 세포가 표피 진피 계면에 도달합니다.

10일째가 되면 GFP 양성 세포가 기저막 위치에서 단단히 정렬됩니다. 표피에서 이동된 GFP 양성 세포는 멜라닌 세포 마커 HMB 45를 발현합니다. 흑색종 세포주의 여러 단계가 피부 재건에 통합될 때, 세포의 행동은 세포의 생체 내 특성을 반영합니다.

여기서, 2D 배양에서 성장한 정상 멜라닌 세포와 흑색종 세포를 이 그림에서 볼 수 있습니다. 정상 멜라닌 세포의 위치와 성장 속도는 여기에서 볼 수 있듯이 피부 재건에서 엄격하게 제어되며, 방사상 성장기, 원발성 흑색종은 주로 표피에서 증식하는 반면, 수직 성장기 흑색종은 이 그림에서 볼 수 있듯이 진피로 침습적으로 성장합니다. 마지막으로, 전이성 흑색종이 공격적으로 진피 깊숙이 침입하는 방식을 여기에서 볼 수 있습니다.

정상 피부에 대한 우리의 연구는 흑색종 발달 및 진행에 대한 더 나은 지식을 위한 기초를 제공합니다.