3 차원의 인간 피부 모델을 재구성 : 도구는 일반 피부와 흑색증의 진행을 공부하기

본 절차의 전반적인 목표는 멜라노사이트, 흑색종 및 피부 줄기세포 생물학 연구를 위한 3D 인공 인간 피부 재구성물을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 조직 배양 트레이의 인서트를 중화된 소 콜라겐으로 코팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 섬유아세포와 콜라겐을 이용하여 세포성 진피 구획을 만드는 것입니다.

다음으로, 각질형성세포를 멜라닌세포 또는 흑색종 세포와 혼합하여 표피 구획을 제작합니다. 실험 절차의 마지막 단계는 18일 차에 재건된 피부를 수확하여 마우스에 이식하는 것입니다. 최종적으로, 이식편에 대한 면역조직화학 및 면역형광 분석을 통해 멜라닌세포를 포함하는 정상 피부의 구조와 정상 줄기세포의 이동 및 분화, 그리고 단계별 흑색종 표현형을 확인할 수 있습니다.

우리는 20년 전 피부 재구성 모델을 개발했습니다. 연구 초기 단계에서 배양 접시에서 배양된 일반 멜라닌 세포나 멜라노마 세포가 조직 맥락 속에 있는 세포와 매우 다르게 행동한다는 것을 발견했기 때문입니다. 따라서 피부 재구성 모델은 세포가 피부의 한 구획에서 다른 곳으로 어떻게 이동하는지 관찰하는 데 이상적입니다. 이전에 준비한 무세포층 콜라겐 혼합물을 얼음 위에 두고, 6웰 인서트의 각 웰에 옅은 황색 용액 1 mL를 첨가합니다.

웰 조직 배양 트레이를 실온에서 30분 동안 배양하여 겔을 응고시킵니다. 이 시간 동안 겔이 응고되면서 용액의 색상이 노란색에서 분홍색으로 변해야 합니다. 0.25% trypsin EDTA를 사용하여 배양 플라스크에서 인간 섬유아세포(human fibroblast)를 분리하고 5분 후에 trypsin 처리합니다. 10% FBS가 포함된 DMEM을 첨가하여 효소 처리 과정을 중화시킵니다.

상온에서 200 G로 5분간 원심분리하여 분리된 세포를 수집한 후, 10% FBS가 첨가된 DMEM 1.5 mL당 4.5 × 10⁵ cells 농도로 세포를 재부유시킵니다. 다음으로, 미리 준비한 세포층 콜라겐 혼합물을 50 mL 튜브에 채우고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

섬유아세포 현탁액 1.5 milliliters를 튜브에 넣고 잘 혼합합니다. 각 무세포층 코팅 인서트에 짚색의 세포층 용액 3 milliliters를 넣습니다. 그런 다음, 배양 기간 동안 5% carbon dioxide 조직 배양 인큐베이터의 37 degrees Celsius에서 조직 배양 트레이를 45분 동안 배양합니다.

세포층 용액의 색상 또한 노란색에서 분홍색으로 변해야 합니다. 상층 젤이 응고되면, 조직 배양 트레이 내 인서트 안쪽에 10% FBS가 포함된 DMEM 2 mL를 첨가하고, 인서트 바깥쪽에 10 mL를 첨가합니다. 조직 배양 트레이를 4일 동안 배양합니다.

배양 4일째에 겔이 수축되었는지 확인한 후, 각 인서트의 내부와 외부에서 배지를 흡입하여 제거합니다. 일반 혈청을 씻어내기 위해 인서트 내부에 2 mL, 외부에 10 mL의 세척 배지를 첨가합니다. 그런 다음 표피 형성을 위해 트레이를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.

먼저 인간 각질 형성 세포에 트립신을 처리합니다. 그다음 5분 후에, 분리된 세포를 200 G에서 5분 동안 원심 분리한 후 대두 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)를 사용하여 트립신을 중화합니다. 세포 펠렛을 skin 내에서 4.17 × 10⁶ cells/mL 농도로 재부유합니다.

각질세포를 수확한 후 배지를 재구성합니다. 인간 멜라닌 세포를 트립신으로 1~2분간 처리합니다. 다시 콩 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor)를 사용하여 트립신을 중화합니다.

그 후 이전과 동일한 조건으로 세포를 원심 분리한 다음, 멜라노사이트 펠렛을 mL당 8.3 × 10⁵ cells 농도로 skin 배지에서 재현탁합니다. medium one 또한 동일하게 재구성하십시오. 다음으로, 준비된 진피층 조직 배양 트레이의 각 인서트 내부와 외부에서 세척 배지를 제거합니다.

각 인서트의 내부에 1.5 milliliters, 외부에 10 milliliters의 skin, reconstruct medium을 첨가하여 세척액을 교체합니다. 그다음 각질형성세포(keratinocyte) 세포 현탁액 600 microliters와 멜라닌세포(melanocyte) 현탁액 600 microliters를 혼합합니다. 혼합된 세포 현탁액 200 microliters를 분주합니다.

각 인서트 내부에 한 방울씩 떨어뜨립니다. 조직 배양 트레이를 37 °C에서 이틀 동안 배양합니다. 세포 배양 후, 각 인서트의 내부와 외부에서 skin, reconstruct medium one을 흡입하여 제거한 다음, 인서트 내부에 2 mL의 skin, reconstruct medium two를, 외부에 10 mL를 추가합니다.

그 후 재구성체를 37 °C에서 이틀 더 배양합니다. 두 번째 2일 배양 후, 각 인서트의 내부와 외부에서 피부 재구성 배지 2를 흡입하여 제거합니다. 이제 인서트의 외부에만 피부 재구성 배지 3 7.5 mL를 추가합니다.

재구성물을 배양기에 다시 넣고 배지를 교체합니다. 18일까지 격일로 재구성 배지 3을 교체합니다. 배양 18일 차에 피부 재구성물이 담긴 조직 배양 트레이 내 인서트의 내부와 외부에서 배지를 흡입하여 제거합니다.

포셉을 사용하여 트레이에서 인서트를 제거합니다. 메스 날로 가장자리에 가깝게 원을 그려 폴리카보네이트 필터를 포함한 구조물을 잘라냅니다. 그런 다음 필터에 담긴 재구성체를 단단한 표면에 놓고 메스 날로 절반으로 자릅니다.

재구성 조직의 절반을 검은색 TBS 생검지에 놓은 다음, 해당 종이를 조직 카세트에 넣습니다. 카세트 전체를 10% formalin에 4시간 이상 담급니다. 그다음 카세트를 70% ethanol에 넣고, 파라핀 매립을 위한 재구성 조직 처리 준비가 될 때까지 4°C에서 보관합니다.

재구성된 조직의 나머지 절반을 4°C에서 50% sucrose에 1~2시간 동안 둡니다. 그 후 sucrose 농도를 2 M로 변경하여 4°C에서 다시 1~2시간 동안 보관합니다. 베이스 몰드의 절반을 최적 절단 온도 매질(optimal cutting temperature, freezing media 또는 OCT)로 채웁니다.

기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 핀셋으로 재구성체의 가장자리를 잡고 설탕물(sucrose)에서 꺼내십시오. 설탕물이 모두 흡수될 때까지 킴와이프스(Kim wipes) 위에 올려두십시오.

포셉과 스패출러를 사용하여 재구성물을 OCT 위의 보트로 옮깁니다. 보트가 완전히 찰 때까지 재구성물 윗부분을 OCT로 더 덮습니다. 이때 다시 한번 기포가 생기지 않도록 주의합니다.

OCT가 완전히 얼 수 있도록 보트를 분쇄된 드라이아이스 위에 고르게 놓습니다. 그 다음 베이스 몰드와 호일을 감싸고, 크라이오스탯으로 절단할 준비가 될 때까지 -70 °C에서 보관합니다. 마우스 피부 재건 이식을 준비하려면, 용기에 액체 질소를 채우고 50 mL 튜브에 DMEM 5 mL를 넣습니다.

비커에 수돗물 600 milliliters를 채우고 핫플레이트 위에 올려 가열합니다. 그런 다음 약 6주령의 암컷 skid hairless outbred 마우스를 선택합니다. 이소플루린으로 마우스를 마취시킨 후,

시술 전 과정 동안 마취 상태를 유지하기 위해 노즈 콘(nose cone)을 사용합니다. 무균 안과용 윤활제를 도포하고 보온 장치를 제공하여 저체온증을 방지합니다. 다음으로, 복합 벤조인 팅크(compound benzoin tincture)와 알코올 솜을 사용하여 마우스의 피부를 세척합니다.

나중에 봉합할 때 동일한 위치를 유지할 수 있도록 마우스 등의 윗부분에 선을 표시합니다. 아이리스 가위(iris scissors)와 포셉(forceps)을 사용하여 마우스 등에 원형의 상처 부위를 만들고, 멸균 거즈 스펀지로 상처 부위를 덮습니다. 떼어낸 원형의 마우스 피부를 DMEM이 담긴 50 milliliter 튜브에 넣습니다.

배지와 조직이 완전히 얼 때까지 튜브를 액체 질소 용기에 담급니다. 그 다음, 완전히 해동될 때까지 튜브를 뜨거운 물이 담긴 비커에 넣어 해동합니다. 이러한 동결 및 해동 과정을 3회 반복합니다.

수술용 칼을 사용하여 인서트에서 피부 재건물을 분리합니다. 막을 매우 조심스럽게 제거한 다음, 피부 재건물을 마우스 상처 부위 상단으로 옮깁니다. 이제 피부 재건물 위에 마우스 피부를 덮어줍니다.

첫 번째 봉합사가 이전에 표시한 마커 위에 위치하고 두 번째 봉합사가 아래에 위치하도록 합니다. 그런 다음 피부 재건 부위의 양측에 두 개의 봉합사를 추가로 사용하여 마우스 피부를 고정합니다. 이식 후 마우스 피부를 세척하고, 마우스를 새 케이지로 옮깁니다.

18일 차에 피부 재구성 모델의 표피는 층상 각질세포 층으로 구성되며, 미분화된 기저층과 순차적으로 분화된 층들이 수직 방향으로 배열되어 있습니다. 재구성된 단면을 멜라닌 세포 마커로 염색합니다.

검은색 화살표로 표시된 S 100은 멜라닌 세포가 표피의 기저층에 정렬되어 있으며 수지상 돌기 연장을 통해 여러 각질 형성 세포와 통신하고 있음을 보여줍니다. 진피 구획에는 제1형 콜라겐 매트릭스에 내장된 섬유아세포가 포함되어 있으며, 침착된 콜라겐 4는 표피와 진피를 구분하는 기저막을 나타냅니다. 다음 그림들은 표피의 각질 형성 세포가 어떻게 여러 층으로 발달하는지를 보여줍니다.

GFP 렌티바이러스 벡터로 표지된 피부 줄기세포를 섬유아세포와 함께 매립했을 때, 이들은 1형 콜라겐 매트릭스 내에서 표피로 이동하며 5일째에 멜라닌 세포로 분화합니다. 각질 형성 세포를 파종한 후, 단일 세포들이 구체로부터 밖으로 이동하기 시작합니다.

표피가 여전히 단일 층으로 구성되어 있음에 유의하십시오. 8일째에 일부 세포가 표피-진피 경계면에 도달합니다.

10일 차가 되면 여기서 볼 수 있듯이 GFP 양성 세포들이 기저막 위치에 조밀하게 정렬됩니다. 표피로 이동한 GFP 양성 세포들은 멜라닌세포 마커인 HMB 45를 발현합니다. 서로 다른 단계의 멜라노마 세포주를 피부 재구성 모델에 통합했을 때, 세포의 거동은 이들의 생체 내 특성을 반영합니다.

이 그림에서는 2D 배양으로 성장시킨 정상 멜라닌 세포와 멜라노마 세포를 확인할 수 있습니다. 여기에서 보는 바와 같이, 피부 재구성체 내에서 정상 멜라닌 세포의 위치와 성장 속도는 엄격하게 조절됩니다. 방사형 성장기의 일차성 멜라노마는 주로 표피에서 증식하는 반면, 수직 성장기의 멜라노마는 이 그림에서 보듯 진피까지 침습적으로 성장합니다. 마지막으로, 전이성 멜라노마가 진피 깊숙이 공격적으로 침범하는 양상을 여기서 확인할 수 있습니다.

정상 피부에 대한 본 연구는 흑색종의 발생 및 진행에 대한 이해를 높이는 기초를 제공합니다.