세포 인구 분석 피부 발암 중

이 절차의 전반적인 목표는 피부암 기저 세포 암종의 마우스 모델에서 세포 집단 분석을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 마우스에서 표적 유전자 발현을 유도함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 표피를 마우스 피부에서 분리합니다.

단일 세포 현탁액을 생성한 후, 표피 세포는 특정 세포 서비스 마커로 표지됩니다. 궁극적으로, 피부의 종양 발생 중 세포 집단 변화는 유세포 분석을 통해 모니터링할 수 있습니다. 암 발병은 많은 세포 유형을 포함하는 과정입니다.

이 절차의 목적은 연구자가 다양한 세포가 피부암 발병에 어떻게 기여하는지 조사하는 데 도움을 주는 것입니다. 이 방법은 피부암 발생 중 세포 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 췌장암과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 시각적 평가 없이는 실험을 종료해야 하는 시점을 결정하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

먼저, ma keratin 14 Cree ER 마우스는 K 14 마우스라고 하며, Rosa 26 마우스는 YFP 태그가 지정된 돌연변이 평활화 유전자 SMU M 2를 SMU라고 합니다. 마우스. 다음으로, 3주에서 6주 된 이중 양성 마우스에서 수확한 0.5cm 긴 꼬리 표본을 단백질 분해 효소 K.의 밀리리터당 1밀리그램으로 직접 PCR 꼬리 용해 용액에 담그고, 그런 다음 흔들림과 함께 섭씨 55도에서 밤새 표본을 배양합니다. 다음 날, 마이크로 원심 분리기에서 최고 속도로 조직을 회전시켜 이물질을 제거합니다.

그런 다음 각 동물의 유전형 분석을 위해 공급업체에서 권장하는 프라이머 및 조건과 함께 개별 PCR 반응에서 각 샘플에서 1마이크로리터의 SNAT를 사용합니다. 구부러진 20게이지 수유 바늘을 사용하여 동물에게 타목시펜을 투여합니다. K 14 C er 및 ROSA 26에 대해 5일 연속 경구 위장에 의한 이중 양성으로 각질세포에서 OO M 2 발현을 유도합니다.

일반적으로 표현형은 세포 분석을 위해 피부를 채취하기 위해 GFP 태그가 지정된 K 14 OO 마우스의 귀와 꼬리에 더 심합니다. 먼저 떨림을 사용하여 안락사된 동물의 털을 제거합니다. 그런 다음 마우스 피부를 제거하고 조직을 섭씨 37도의 디스베 용액에 1-2시간 동안 담그십시오.

원추 치료 후에는 한 쌍의 집게를 사용하여 표피와 진피를 분리합니다. 이제 가위를 사용하여 표피를 다집니다. 그런 다음 50 밀리리터 튜브에 37 °C에서 1-2 시간 동안 콜라겐 분해 효소 4 용액에 조직을 담그십시오.

20분마다 튜브를 부드럽게 휘젓고 세포를 해리합니다. 현미경을 사용하여 콜라겐분해효소 배지에서 단일 세포를 검출할 수 있는 경우 세포 해리를 확인합니다. 세포 수율을 높이기 위해 추가로 30분 동안 검체를 배양합니다.

그런 다음 70 미크론 세포 여과기를 통해 조직 혼합물을 여과하고 500 번 G 및 실온에서 10 분 동안 세포를 세척하여 세포를 라벨링하는 것은 리서스로 시작하여 밀리리터 당 6 개의 세포의 2.5 배 10에서 10 % FBS로 보충 된 PBS에서 방금 씻은 펠렛을 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 용액을 얼음 위에 30분 동안 올려 비특이적 결합을 차단합니다. 다음으로, 특정 항체 라벨링을 위해 세포의 분취량을 1.5ml 마이크로 튜브로 옮깁니다.

각 튜브에 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 농도로 항체를 추가합니다. 몇 초 동안 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 항체와 세포를 혼합한 다음 튜브를 다시 얼음 위에 30분 동안 놓습니다. 튜브를 PBS 1밀리리터로 세척한 후 펠릿을 PBS에 재현탁시킨 다음 최종 농도인 밀리리터당 1밀리그램으로 DPI를 첨가합니다.

데이터를 분석할 때 먼저 전방 산점도 대 측면 산점도를 기반으로 DABI 양성 데드 셀을 제외한 단일 세포를 선택합니다. 마우스는 이 이미지에서 볼 수 있듯이 고슴도치 신호가 활성화될 때를 제외하고는 기저 세포 암종을 발병하지 않습니다. 발암성 평활화 된 매끄러운 M 2 YFP의 타목시펜 유도 발현은 이러한 동물의 피부 h 및 e 염색 표본의 성장 해부학 수준에서도 명백한 피부 표현형을 초래합니다.

피부 종양은 K 14 SMU 마우스에서 관찰될 수 있습니다. SMU M 2 YFP 유도가 없으면 동물 피부는 h와 e에 의해 비정상적인 형태를 나타내지 않았습니다. 이러한 점도표를 염색하면 정상 마우스와 종양이 있는 마우스의 골수성 세포에 대한 대표적인 분석을 볼 수 있습니다.

CD11 B 양성 GR 1 양성 세포는 골수성 세포로부터 유래되며, 그 중 일부는 정상 및 비 smu M2 YFP 유도 마우스에서 골수성 유래 억제 세포이다. CD 11 B 양성 GR one 양성 세포 집단은 거의 검출되지 않지만 염증이나 종양 발달에 대한 반응으로 증가합니다. K 14 SMU 마우스에서.

피부에서 smu, M, 2, YFP 및 각질세포의 유도 발현은 CD 11 B 양성 GR 1 양성 세포 집단의 증가를 초래합니다. 이 기술을 통해 피부 생물학 분야의 연구자들은 생쥐의 B 세포 암종에 대한 분자 분석을 수행할 수 있습니다.