유전자 조작 마우스 모델의 전립선암 모델링: 마우스 전방 전립선 엽 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 국소 유전자 편집 기술

강력한 업스트림 프로모터에 의해 Cas9 엔도뉴클레아제와 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 조작된 게놈을 가진 마취 및 준비된 CRISPR/Cas9 녹인 마우스 모델로 시작합니다. 프로모터 바로 하류에 삽입된 floxed-STOP 카세트 또는 LSL은 정상적인 조건에서 Cas9 및 GFP 전사를 차단합니다.

쥐의 복벽을 절개하여 정낭에 부착된 전립선 엽을 노출시킵니다. 원하는 아데노바이러스 현탁액을 전엽에 주입하여 표적 바이러스 게놈이 세포로 전달되는 것을 촉진합니다. 전립선엽을 복강에 다시 넣고 절개 부위를 봉합합니다.

바이러스에 감염된 세포 내에서 바이러스 게놈은 돌연변이할 유전자를 표적으로 하는 Cre 재조합효소 및 가이드 RNA를 발현합니다. Cre 효소는 LSL 카세트를 인식하고 floxed 전사 차단제를 절제합니다. 이 단계를 통해 프로모터는 Cas9 엔도뉴클레아제 및 GFP의 발현을 유도할 수 있습니다.

그 후, Cas9 엔도뉴클레아제는 바이러스 암호화 가이드 RNA와 복합체를 형성하여 이러한 복합체를 돌연변이할 유전자 내의 표적 서열로 유도합니다. 이러한 국소화를 통해 Cas9 엔도뉴클레아제는 표적 유전자 내의 게놈 DNA를 절단하여 유전적 변형을 일으킬 수 있습니다.

발암성 변화는 돌연변이 세포를 암으로 만듭니다. 돌연변이 세포 내에서 GFP 리포터 단백질의 공동 발현은 암 진행의 식별 및 추적을 용이하게 합니다.

전립선에 바이러스를 전달하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 8주 된 수컷 마우스를 마취한 후 근육 이완, 페달 철수 및 눈꺼풀 반사를 평가하여 마취 깊이를 검사합니다. 반사 상실이 관찰되면 동물의 하복부를 면도하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 안구건조증으로 인한 실명을 예방하기 위해 동물의 눈을 동물용 안과 연고로 조심스럽게 덮습니다. 그런 다음 70% 에탄올과 10% 포비돈-요오드를 사용하여 면도한 복부를 닦아 수술 부위를 소독합니다.

다음으로 멸균 수술용 가위를 사용하여 하복부 정중선에 약 1cm 수직 피부 절개를 합니다. 그런 다음 미세한 끝 겸자로 복막을 들어 올려 아래에 있는 장기가 손상되지 않도록 하고 수술용 가위를 사용하여 복막을 통해 8mm 이하의 절개를 조심스럽게 합니다. 지방 조직을 부드럽게 옆으로 움직여 정낭을 드러냅니다. 그런 다음 고리 모양의 겸자를 사용하여 전방 전립선을 식별할 수 있을 때까지 정낭을 조심스럽게 들어 올립니다.

이제 0.5밀리리터 인슐린 주사기와 30G x 8밀리미터 바늘을 사용하여 총 30마이크로리터의 바이러스 용액을 전립선 전피에 주입합니다. 누출을 최소화하고 체액이 조직 내에서 흡수되어 작은 기포를 형성하도록 합니다. 그런 다음 정낭을 복강에 다시 넣습니다.

체액이 누출 없이 작은 기포로 조직 내에서 흡수되도록 하려면 정낭과 평행하게 전립선엽 모양을 따라 주입

테이퍼 포인트 바늘과 13mm, 3/8 원을 사용하여 6-0 흡수성 봉합사의 2-3개의 간단한 단속 스티치로 복막을 봉합합니다. 그런 다음 복막 손상을 방지하기 위해 집게로 피부를 들어 올리고 3개의 멸균 4.8 x 6.5mm 클립으로 피부를 스테이플

수술 후 더 나은 회복을 위해 멸균 1밀리리터 주사기와 27G x 1/2인치 바늘을 사용하여 복강내 주사로 체중 그램당 0.1밀리리터의 용량으로 마취 해독제를 투여합니다. 그런 다음 동물을 조심스럽게 다시 새장에 넣으십시오.

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.