Gold Immunostaining of Exosomal Sections: A Technique to Visualize Diagnostic Markers in Exosomal Lumen(엑소좀 절편의 금 면역염색: 엑소좀 루멘에서 진단 마커를 시각화하는 기술)

엑소좀은 암 바이오마커 역할을 하는 다양한 생체분자를 둘러싸고 있는 작은 세포외 소포입니다.

엑소좀 바이오마커를 시각화하려면 적절한 전자 현미경 금속 그리드에 지지되는 초박형 레진 포매 엑소좀 섹션으로 시작합니다. 글리신 방울에서 그리드를 배양합니다. 글리신은 절편의 반응성 알데히드 그룹을 결합하고 중화하여 분석과의 간섭을 극복합니다.

샘플을 물로 헹구어 잔류 시약을 제거합니다. 그런 다음 샘플을 차단 완충액에서 배양합니다. 완충액은 샘플의 비특이적 항체 결합 부위를 차단하는 혈청 단백질을 운반합니다.

다음으로, 원하는 1차 항체 용액에서 샘플을 배양합니다. 이러한 항체는 엑소좀 내강에 국한된 표적 바이오마커를 인식하고 결합합니다. 결합되지 않은 항체는 적절한 완충액으로 씻어냅니다.

이제 샘플 함유 그리드를 1차 항체에 부착된 금 접합 2차 항체가 포함된 방울로 옮깁니다. 금-나노 입자는 표적 분자의 미세한 국소화를 시각화하기 위해 전자 밀도가 높은 마커 역할을 합니다. 결합되지 않은 2차 항체를 적절한 완충액으로 씻어냅니다.

마지막으로, 어두운 조건에서 그리드를 우라닐 아세테이트 및 구연산 납 용액에서 순차적으로 배양합니다. 이러한 중금속 시약은 샘플 내 지질, 단백질, 글리코겐과 같은 유기 분자의 대비를 염색하고 강화하여 배경과 구별합니다.

투과전자현미경으로 염색된 부분을 관찰합니다. 금 표지 바이오마커는 중금속으로 염색된 엑소좀 구조의 내강 내에서 어두운 입자로 나타납니다.

시작하려면 60나노미터 두께의 염색되지 않은 절편을 포함하는 그리드를 50마이크로리터 방울의 0.02M 글리신 방울에 10분 동안 배양하여 유리 알데히드 그룹을 소멸시킵니다. 그런 다음 100마이크로리터의 증류수로 절편을 각각 10분 동안 세 번 헹굽니다. 마지막 헹굼 후, 1% BSA를 함유한 PBS에서 실온에서 1시간 동안 절편을 배양합니다. 그런 다음 50-100마이크로리터의 항-KRS 항체 방울에서 그리드를 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 0.1% BSA를 함유한 PBS 한 방울에 각각 10분 동안 그리드를 5회 세척합니다. 그런 다음 그리드를 적절한 2차 항체 한 방울로 옮기고 실온에서 1시간 동안 절편을 배양합니다. 이제 0.1% BSA를 함유한 PBS를 별도로 10분 동안 그리드를 5회 세척합니다. 어둠 속에서 20분 동안 2% 우라닐 아세테이트로 절편을 이중 염색한 다음 레이놀드 구연산납을 10분 동안 염색합니다. 염색된 절편을 투과전자현미경에 넣고 80kV를 사용하여 샘플을 관찰하고 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지화합니다.

• Exosomes - Small extracellular vesicles enclosing cancer biomarkers.
• Glycine - A compound used to bind and neutralize reactive aldehyde groups.
• Blocking Buffer - A solution containing serum proteins that block non-specific antibody binding sites.
• Primary Antibody - A protein that recognizes and binds to target biomarkers in the exosomal lumen.
• Secondary Antibodies - Proteins tagged with gold-nanoparticles used to visualize primary antibodies.

• Introduce Exosomes - Definition and importance in cancer diagnosis (e.g., exosomes).
• Outline Glycine's Role - Its function in stabilizing exosomal structures (e.g., glycine).
• Explain Blocking Buffer - Serum proteins preventing unwanted reactions (e.g., blocking buffer).
• Educate on Antibody Tagging - Importance in visualizing exosomal biomarkers.

• What are exosomes and how do they serve as cancer biomarkers?
• What is the role of glycine in visualizing exosomal biomarkers?
• Why is a blocking buffer used in this process?

• Practical Application - Exosomes as diagnostic tools in cancer studies (e.g., exosome detection).
• Industry Impact - Enhancement of diagnostic accuracy in healthcare (e.g., cancer diagnostics).
• Societal Importance - Improving early detection and treatment strategies (e.g., personalized medicine).
• Scientific Advancements - Advancements in biomarker detection techniques.