망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

이 실험의 전반적인 목표는 망막 리본 시냅스에서 막 단백질을 정량적으로 분석하는 새로운 접근 방식을 개발하는 것입니다. 이 방법은 회로 내 시냅스에서 단백질의 정확한 위치와 같은 망막 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 망막 리본 시냅스에서 여러 단백질의 수, 밀도 및 속도를 추정할 수 있다는 것입니다.

동결 치환 절차와 초박형 절편을 시연하기 위해 NIDCD Advanced Imaging Core의 Ron Petralia 및 Ya-Xian Wang 박사가 있습니다. 이 절차를 시작하려면 현미경으로 안구를 해부합니다. 이렇게 하려면 먼저 각막을 제거해야 합니다.

그런 다음 집게로 망막 간 표면에서 수정체와 유리체를 제거합니다. 그런 다음 망막이 아이컵에서 분리될 때까지 공막을 벗깁니다. 면도기로 망막을 즉시 100, 200 마이크로 미터 두께의 스트립으로 자릅니다.

그 후, 0.1 어금니 PB에 4%파라포름알데히드에 망막 스트립을 혼합합니다. 그런 다음 실온에서 4%파라포름알데히드와 0.01%글루타르알데히드를 넣습니다. 0.15 밀리몰 염화칼슘으로 PB를 여러 번 세척한 후 동결 치환 전에 0.1 몰 PB의 글리세롤로 망막 스트립을 동결 보호합니다. 얼어붙은 조직을 평평한 임베딩 홀더에 넣기 전에 투명한 플라스틱 시트에서 얇은 원을 잘라 각 홀더의 바닥에 놓으면 완료 시 중합된 표본 상자를 쉽게 제거할

이제 AFS에서 자동 시퀀스를 설정합니다. AFS를 액체 질소로 채우고 플랫 임베딩 홀더를 AFS에 놓습니다. 메탄올에 1.5%uranyl acetate로 채우고 미리 냉각하십시오.

섭씨 184도의 액체 프로판에서 망막 스트립을 급강하 동결하려면 가는 브러시를 사용하여 플런징 로드 끝에 있는 금속 스텁에 부착된 작은 양면 테이프 조각에 샘플을 놓습니다. 그런 다음 브러시를 사용하여 여분의 버퍼를 흡수하십시오. 막대를 액체 프로판에 약 5초 동안 담그십시오.

그런 다음 액체 질소로 채워진 작은 운송 챔버를 사용하여 AFS로 옮깁니다. 냉동 샘플과 기구, 집게 및 메스를 AFS에 넣은 후 조직을 만지기 전에 챔버의 기구를 몇 분 동안 냉각합니다. 또는 액체 질소로 채워진 작은 운송 챔버에 기구의 끝을 몇 초 동안 넣어 식히십시오.

그런 다음 고운 메스를 사용하여 스텁에서 샘플과 테이프를 제거합니다. 다음으로, 메탄올에 1.5% 우라닐 아세테이트가 함유된 평평한 임베딩 알루미늄 홀더의 7개 웰 각각에 두 조각의 동결 섹션을 놓습니다. AFS에서 최소 90시간 동안 섭씨 32도를 유지하십시오.

그런 다음 자동 순서로 온도를 섭씨 45도까지 단계적으로 높입니다. 그 후, 예냉각된 메탄올에서 샘플을 세 번 세척합니다. 다음으로, 저온 매립 수지를 매립 매체로 사용하여 샘플을 점진적으로 침투시킵니다.

다음 날에는 수지를 다시 교체하고 우물의 상단 가장자리에 도달하도록 수지의 수준을 조정하십시오. AFS에서 UV 광을 설정하고 자동 시퀀스가 끝날 때까지 AFS에서 UV 광으로 샘플을 중합합니다. 그런 다음 AFS에서 샘플을 제거합니다.

일반적으로 샘플 블록은 여전히 약간의 분홍색과 색을 보입니다. 샘플을 실온에서 밤새 또는 완전히 투명해질 때까지 화학 흄 후드의 형광등 가까이에 두십시오. 이 단계에서는 초박 절편기로 70개의 노미터 두께의 초박형 섹션을 절단하고 formvar 탄소 코팅 니켈 그리드에 수집합니다.

그리드를 증류수로 한 번 씻은 다음 TBS를 세 번 씻습니다. 그런 다음 TBS에서 20마이크로리터의 5%BSA에 그리드를 30분 동안 배양한 다음 염소 항-CTB와 하나의 NMDAR 서브 유닛에 대한 항체를 포함하는 혼합물 20마이크로리터에서 실온에서 밤새 배양합니다. 그 후, ph 20에서 매번 7.6 마이크로리터의 TBS로 그리드를 세 번 세척합니다.

그런 다음 ph 8.2에서 TBS로 5분 동안 그리드를 한 번 세척합니다. 10나노미터 금 입자에 결합된 당나귀 항토끼 IGG와 18나노미터 금 입자에 결합된 당나귀 항염소 IGG를 포함하는 혼합물 20마이크로리터로 그리드를 2시간 동안 배양합니다. 2시간 후 20마이크로리터의 TBS에서 ph 7.6으로 그리드를 세 번 세척한 다음 초순수로 세척한 다음 그리드를 자연 건조합니다.

그런 다음 증류수에 5% 우라닐 아세테이트로 그리드를 8분 동안 대조 염색한 다음 어둠 속에서 5분 동안 증류수에 0.3% 구연산납을 대조합니다. 삼중 라벨링 실험의 경우, 항염소 CTB, 항-마우스 PSD-95 및 항-토끼 UN2A의 혼합물 20마이크로리터를 사용하여 실온에서 하룻밤 동안 그리드를 배양합니다. 그런 다음 18, 10 및 5나노미터 금 입자에 결합된 20마이크로리터의 IGG 혼합물로 그리드를 2시간 동안 배양합니다.

이 섹션에서는 먼저 축척 막대를 설정합니다. 그런 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 개별 망막 신경절 수상돌기의 PSD 길이를 측정합니다. 그런 다음 원형질막의 평균 두께 7-9나노미터를 기준으로 멤브레인에서 10나노미터 이내의 금 입자를 계산합니다.

입자 밀도를 선형 마이크로미터당 금 입자의 수로 계산합니다. 그런 다음 시냅스 위치를 위해 각 금 입자의 중심과 PSD의 중간 사이의 거리를 측정하거나 시냅스 외 위치를 위해 PSD의 가장자리 사이의 거리를 측정합니다. 이 이미지는 GluA2/3 및 CTB의 이중 면역골드 라벨링을 보여줍니다.

이것은 시냅스 전 리본(pre-synaptic ribbon)이며 작은 금 입자는 망막 신경절 돌기의 PSD에 모여 있습니다. 이 이미지는 GluN2B 및 CTB의 이중 면역금 라벨링을 보여줍니다. 작은 금 입자는 시냅스외 원형질막에 있습니다.

그리고 이 이미지는 GluN2A와 CTB의 이중 면역금 표지를 보여줍니다. GluA2/3와 유사하게 작은 입자가 PSD 내에 모여 있습니다. GluN2A, PSD-95 및 CTB의 삼중 면역금 표지는 다음과 같습니다.

GluN2A 금 입자 및 PSD-95 금 입자는 개별 CTB 양성 망막 신경절 수지상의 PSD 내에 공동 국소화되어 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, NMDA 수용체와 같은 일부 단백질 항원성은 강한 장기간 고정으로 현저히 감소하기 때문에 조직을 매우 부드럽게 고정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 망막 리본 시냅스에서 막 단백질을 매우 정밀하게 검출하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.