극저온 빨대를 사용한 토끼 배아 유리화: 장기 보관을 위해 토끼 배아를 보존하기 위한 초고속 냉각 기술

배아 유리화는 배아를 초저온으로 매우 빠른 속도로 냉각시켜 장기 보관을 용이하게 하는 초고속 냉동 보존 기술입니다.

시작하려면 수확한 토끼 배아를 적절한 배지에 넣으십시오. 저농도의 세포 투과 냉동 보호제(에틸렌 글리콜 또는 EG 및 디메틸 설폭사이드 또는 DMSO)를 포함하는 평형 용액과 함께 배아를 배양합니다. EG와 DMSO는 세포막을 통해 확산되어 세포 내부의 물 분자를 대체하고 세포 내 얼음 결정 형성을 방지합니다.

다음으로, 더 높은 농도의 EG 및 DMSO를 함유한 유리화 용액과 함께 배아를 배양하여 냉동 보호제의 적절한 투과와 충분한 세포내 수분 유출을 가능하게 하여 동결 손상으로부터 세포를 보호합니다.

멸균 극저온 빨대 캐리어를 마이크로디스펜서에 연결합니다. 마이크로디스펜서를 사용하여 빨대에 원하는 배지를 적절한 수준으로 채웁니다. 그런 다음 기포를 흡인한 다음 최소한의 양의 배아 함유 유리화 용액과 또 다른 기포를 흡입합니다.

첫 번째 매체 분획이 분말 코팅된 면 플러그를 적시고 중합하여 빨대 끝을 밀봉할 때까지 매체를 다시 흡인합니다. 소수성 빨대 플러그로 다른 쪽 끝을 닫습니다. 공기 및 배지 세그먼트는 폐쇄된 캐리어 내에서 배아를 분리하는 데 도움이 됩니다.

빨대를 -196°C의 액체 질소에 잠깐 담그십시오. 캐리어는 높은 냉각 속도를 보장하여 배아를 유리와 같은 비정질 상으로 응고시키는 반면, 소량의 유리화 용액과 냉동 보호제는 삼투압 스트레스를 완화합니다. 대사 활동이 중단된 유리화 배아는 사용할 때까지 보관할 수 있습니다.

배아 유리화의 경우, 배아를 평형 용액에 2분 동안 담근 후 유리화 용액에서 1분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 배아를 125마이크로리터 플라스틱 미니빨대에 넣고 빨대의 닫힌 끝을 적절한 1밀리리터 마이크로디스펜서에 연결합니다. 빨대 길이의 최대 1/3까지 베이스 배지를 흡인한 다음 작은 기포를 흡입합니다.

다음으로, 실체현미경을 사용하여 40마이크로리터의 유리화 용액에서 배아를 흡인한 다음 첫 번째 액체 분획을 미니빨대의 면 끝까지 이동할 수 있을 만큼 충분한 기본 배지에 또 다른 작은 기포를 흡인합니다. 그런 다음 미니빨대의 열린 끝을 빨대 마개로 닫고 미니빨대를 액체질소에 직접 담가 유리화를 달성한 다음 미니빨대를 액체질소 듀어에 보관합니다.