에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

이 절차의 전반적인 목표는 액체 질소에서 마우스 배아를 동결 보존하고 살아있는 마우스의 회수를 위해 해동하는 것입니다. 이는 먼저 마우스 배아를 평형 매질에 담그고, 극저온 튜브의 유리화 매질로 옮긴 다음, 액체 질소 탱크에 넣음으로써 이루어집니다. 나중에 배아는 고삼투압 배지에서 해동하고 수용 암컷으로 이식될 때까지 배양 배지에서 배양할 수 있습니다.

궁극적으로, 유리화 해동 후 배아의 90% 이상이 생존하고, 배아 이식 후 30-70%의 출산율이 나타나는 것으로 나타났습니다. 이 기술의 주요 장점은 투과성 동결 보호제 글리콜이 기존의 동결 보호제보다 배아에 덜 독성이 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 이 프로토콜을 시작하기 전에 제 실험실의 기술자가 할 것입니다.

자연 교배 또는 기존 IVF 기술로 얻은 배양에서 2개의 세포 마우스 배아를 최종 보관을 위해 극저온 튜브에 준비하고 50마이크로리터의 배아 동결 용액 EF S 40을 추가합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 실온에서 35mm 또는 60mm 플라스틱 페트리 접시를 준비합니다. EFS 20.

유리 모세관을 사용하여 최대 30개의 배아를 접시로 옮깁니다. 배양 배지를 옮기지 않도록 주의하십시오. 또한 배아의 탈수를 보장하기 위해 방울 바닥에 놓으십시오.

약 60-90초 후에 모세관 튜브를 사용하여 탈수된 배아를 추출합니다. 축소 된 형태로. 이러한 배아를 극저온 튜브의 EFS 용액으로 이동시켜 가능한 한 적은 EFS 20을 전달합니다.

배아가 이식되면 액체 질소로 동결하기 전에 EFS 40에 1분 동안 정착시킵니다. 배아를 해동하기 전에 배양 접시에 M 16 배지와 같은 10 마이크로 리터의 고 삼투압 배아 배양 배지를 최소 2 방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 방울을 실리콘 또는 미네랄 오일로 완전히 덮고 사용할 때까지 접시를 이산화탄소 인큐베이터에 넣으십시오.

다음으로, 안면 마스크와 크라이오 장갑을 착용한 상태에서 TS one solution을 섭씨 37도까지 예열합니다. 액체 질소 탱크에서 배아를 회수합니다. 이제 극저온 튜브를 빠르게 열고 액체 질소를 탱크 또는 적절한 용기에 버리십시오.

그런 다음 30초 동안 기다립니다. 이제 850마이크로리터의 따뜻한 TS 원 용액을 극저온 튜브에 추가합니다. 용액을 부드럽게 빨아들이고 약 10회 분출하여 고르게 용해되도록 합니다.

그런 다음 전체 볼륨을 60mm 페트리 플라스틱 접시에 옮깁니다. 또는 유리가 배아가 실온과 평형을 이룰 때까지 3분 동안 기다렸다가 나머지 절차 동안 머물러야 합니다. 온난화 장치를 사용하지 마십시오.

실체 현미경으로 접시에 있는 배아를 빠르게 검사하여 이 배아가 배양의 시작 부분에서 어떻게 보이는지 알 수 있습니다. 약 2분 동안 배양을 한 후 배지가 접시 표면에 펴질 때까지 접시를 부드럽게 흔들어 배아를 가라앉힙니다. 배양의 마지막 순간에 접시에 TS 2 용액을 50 마이크로 리터 방울 3 방울 떨어뜨립니다.

3분이 지나면 실체 현미경을 사용하여 배아가 약간 줄어들었는지 확인합니다. 배아가 여전히 부어 있으면 1-3분 더 배양을 계속합니다. 이제 유리 모세관으로 배아를 집어 TS 2의 첫 번째 방울로 옮깁니다.

3분 정도 기다렸다가 배아를 두 번째 방울로 옮깁니다. 그 다음에는 세 번째 드롭이 이어집니다. 마지막으로, 인큐베이터에 보관된 준비된 배아 배지 접시를 회수하고 유리 모세관을 사용하여 배아를 배지의 첫 번째 방울로 옮깁니다.

입체경으로 검사하면 배아는 서서히 정상적인 형태를 회복해야 합니다. 이제 접시를 약 10분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 그런 다음 TS 2에서 이월된 자당을 씻어냅니다.

배아를 배양 배지의 다음 방울로 이동합니다. 배아가 수혜 암컷의 uc로 옮겨질 때까지 CO2 인큐베이터에서 배아를 계속 배양합니다. 3개의 서로 다른 마우스 균주의 300-480개 배아를 유리화하고 회수한 후 생존율이 매우 높았습니다.

해동 후, 정상적인 형태를 보이는 배아의 비율은 93%에서 99% 사이였으며, 그 배아 중 최소 84%가 아세포 낭종으로 발달했습니다. 누출 질소로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 직접적인 접촉을 피하고 누출에 대한 단거리 노출을 최소화하기 위한 예방 조치를 잊지 마십시오. 질소는 항상 이 절차를 수행하여 섭취해야 합니다.