Name: 에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 학습하세요 에틸렌 글리콜 기반 vitrification을 이용한 마우스 태아의 cryopreservation 방법을. 이 기술은 90% 이상의 생존율과 낮은 배아 독성으로 다양한 마우스 계통에 적용 가능합니다.

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이 연구는 국립 BioResource 프로젝트와 협력하여 실시, 교육부, 문화, 스포츠, 과학 기술, 일본.되었습니다

실험의 전체 구조는 그림에 표시됩니다. 1. 1. 시약 준비 <ol><li> 아래의 다음과 같은 차트에 따라 100 ML 유리 병의 기본 매체 (여기에 PB1라고도 함) 확인 : <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> MM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.4 </td><td> 136.98 </td><td> 800.0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.6 </td><td> 2.68 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136.1 </td><td> 1.47 </td><td> 20.0 </td></tr><tr><td> 나이 HPO 4 0.12 H 2 O </td><td> 358.14 </td><td> 8.04 </td><td> 288.1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 6H 2 O </td><td> 203.3 </td><td> 0.49 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td></td><td> 180.2 </td><td> 5.56 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> 나의 pyruvate </td><td> 110 </td><td> 0.33 </td><td> 3.6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2 시간 2 O </td><td> 147 </td><td> 0.9 </td><td> 13.2 </td></tr><tr><td> 페니실린 G </td><td></td><td></td><td> 6.0 (약) </td></tr></tbody></table></li><li> Ficoll - 자당 (FS) 솔루션을 확인하십시오 : <ol><li> 50 ML 관에서 PB1 용액 14 ML 다음 화학 물질을 추가합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6.0 g </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 3.424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42.0 MG </td></tr></tbody></table></li><li> Ficoll 70 PB1 솔루션에 자당를 섞어 완전히 해산 때까지 잘 흔들. </li><li> 위의 완전한 해체를 확인 후, 용액의 표면에 BSA를 추가하고 그것을에서 보관BSA까지 4oC 완전히 (&gt; 4 시간 또는 야간) 해산입니다. </li></ol></li><li> 50 ML 튜브의 평균 솔루션 (EFS20)과 vitrification 솔루션 (EFS40)를 확인합니다 : <ul><li> EFS20 :​​ 20 % (V / V) 에틸렌 글리콜, 24 % (W / V) Ficoll, 그리고 BSA와 PB1에 0.4 몰 / L 자당 </li><li> EFS40 : 40 % (V / V) 에틸렌 글리콜 18 % (W / V) Ficoll, 그리고 BSA와 PB1 0.3 몰 / L * 자당 그들은 6 cryodamage에 더 민감한 때문에 * BALB / C 또는 ICR 변형에서 배아의, 0.9 몰 / L 자당으로 자당의 농도를 증가시킵니다. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 솔루션 </td><td> EFS40 솔루션 </td></tr><tr><td> 에틸렌 글리콜 </td><td> 한 ML </td><td> 이 ML </td></tr><tr><td> FS 솔루션 </td><td> 4 ML </td><td> 3 ML </td></tr></tbody></table></li><li> 0.45 μm의의 filte를 사용하여 여과하여 솔루션을 소독R. 4에서 5 ML 폴리스티렌 튜브 및 저장소에 aliquots 만들기 ° C. 그들은 약 6 개월 동안 사용할 수 있습니다. </li><li> 0.75 M의 자당 (TS1)이있는 배아 해동 솔루션의 준비 <ol><li> PB1에서 자당의 7.7 g을 (단계 1.1에서 준비) 용해 30 ML에 전체 볼륨을 가지고. 자당이 완전히 해소되기 전까지 부드럽게 흔들어하여 섞는다. </li><li> 표면 솔루션에 BSA의 90 밀리그램을 추가하고 완전히 용해 때까지 서 두십시오. </li><li> 여과하여 솔루션을 소독. </li><li> 4 ° C.에 나누어지는 및 저장 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : TS1도 상용 M2에서 준비하실 수 있습니다. <ol start="6"><li> M2에서 자당의 7.7 g을 용해 30 ML에 전체 볼륨을 가지고. </li><li> 자당이 완전히 해소되기 전까지 부드럽게 흔들어하여 섞는다. </li><li> 여과하여 솔루션을 소독. </li><li> 4oC에서 나누어지는하고 저장합니다. 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> TS2 (해동 솔루션: 0.25 M의 자당)이있는 <ol><li> 적절하게, PB1 또는 M2 20 ML 볼륨 10 ML TS1을 희석. </li><li> 4 ° C.에 나누어지는 및 저장 그들은 약 1 달 동안 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 2 셀 마우스 태아의 Vitrification <ol><li> 자연 교배 또는 체외 수정의 기법에 의해 기존의 2 셀 마우스 배아를 준비합니다. </li><li> 나누어지는 cryotube에 50 μl EFS40. 향후, 실온에서 vitrification 절차의 나머지 부분을 수행합니다. </li><li> 35mm 또는 60mm 플라스틱 페트리 접시의 바닥에 EFS20의 나누어지는 50 μl. </li><li> 문화 매체에만 최소 금액과 모세관 유리를 사용하여 EFS20 30 배아까지 전송합니다. 2 분 타이머를 시작합니다. 참고 : 드롭의 하단에있는 장소의 배아. 이것은 배아의 효율적인 탈수를합니다. stereomicroscope에 의한 배아의 형태를 확인합니다. 그림과 같이 탈수 배아는 수축된 형태를 보여줍니다. 2A.그들은 충분히 건조되지 않은 경우, 1 개 또는 2 분 기다립니다. </li><li> 1.5 분, 솔루션만을 최소한의 금액으로 EFS20 드롭에서 배아를 선택하십시오. 단계 2.1 준비 cryotube에 EFS40에게 전송합니다. 참고 : 최상의 결과를 얻으려면, 모든 배아가 약 2 분 EFS40로 전송할 수 있도록 배아를 수확의 타이밍을 조정합니다. </li><li> 1 분 기다립니다. </li><li> 액체 질소 (후면 2)에 직접 cryotube 놔. </li></ol> 3. Vitrified 2 셀 마우스 배아를 해동 <ol><li> 해동하기 전에 복구 배아의 배아 배지 10 μl 방울 (3.13 단계 참조)와 요리를 준비합니다. 사용까지 CO 2 배양기에서 석유와 장소 접시를 커버. 참고 : 일상적인 배아의 문화에 대한 미디어가이 실험에 사용될 수 있지만, 우리는 이러한 M16 매체로서 높은 osmolarity와 미디어를 권해드립니다. </li><li> 37 ° C.에 TS1을 따뜻하게 </li><li> 얼굴 마스크와 cryogloves 쓰세요. 에선 2t을 엽니다ank와 배아를 포함하는 cryotube를 검색할 수 있습니다. </li><li> 신속하게 튜브의 상단을 열고 에선 2 폐기. 다음 단계에서 동결에서 TS1을 방지하기 위해 30 초 기다립니다. </li><li> 튜브에 TS1의 850 μl (37 ° C)를 추가하고 솔루션을 고르게 해산 때까지 부드러운 pipettings (25 초 쯤 배)의 솔루션을 혼합하는 1000ul 피펫을 사용합니다. </li><li> 플라스틱 60mm 페트리 접시 (또는 시계 유리) (그림 3A)에 관의 전체 볼륨을 전송합니다. 참고 :이 단계에서 3.14 CO 2 배양기에 배치되기 전까지는 태아가 실내 온도 (22-25 ° C)에서 처리되어야합니다. </li><li> 3 분 타이머를 시작합니다. </li><li> 배아를 포함하는 매체가 접시의 표면 (그림 3B)에 걸쳐 때까지 TS1 2 분 주변에 부드럽게 요리를 흔들. 참고 :이 TS1에게 양도 때 그들이 표면 근처에 떠 있기 때문에 태아가 아래 아래로 내려가서 도움이 될 것입니다. </li><li> 일에 TS2 세 50 μl 방울을 넣고E 요리 (그림 3C). </li><li> TS1 3 분 후 stereomicroscope에 의해 태아의 형태를 확인, 그들은 약간 수축된해야합니다. TS1의 앞부분에서 태아의 형태 (그림 2B)를 참조하고 나중에 (그림 2C). 참고 : 배아가 계속 부어있다면, 3 분 1 이상을 TS1에 보관하십시오. </li><li> 배아를 들고 TS2의 첫 번째 드롭 (그림 3D)에게 전송할 수 있습니다. 3 분 타이머를 시작합니다 </li><li> 3 분 후, 세 번째 드롭 (그림 3E)에 다음 두 번째 드롭에 배아를 전송합니다. </li><li> 3.1 단계에서 준비한 문화 매체에 배아를 전송합니다. 배아는 그림에 표시되는 모양입니다. 2D. </li><li> CO 2 배양기에 넣어 요리. 약 10 분 후, TS2에서 이월되어 자당을 씻어 문화 매체의 다음 드롭 배아를 전송할 수 있습니다. </li><li> 배아 전송까지 CO2 배양기에서 문화를 계속합니다. 참고 : 전송 엠브리해동 당일받는 여성의 oviducts에 OS. 체외에서 오랜 문화는 생쥐의 일부 변종에 태아의 가능성이 저하될 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 해동은 표 1과 2에 표시하고 배아의 생체내 개발 이후 - 체외에서. 이 프로토콜의 장점은 생쥐의 다양한 변종에 해동하고 광범위한 적용 후 태아의 높은 survivability 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 변형 </td><td> 튜브의 총 번호 </td><td> vitrified 배아 개 </td><td> 복구된 (번호 (%)) </td><td> Morphologically 정상 (번호 (%)) </td><td> blastocysts로 개발 (제 (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / CA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> 표 1. 일반적인 마우스 종자에 vitrified - 해동 배아의 체외 개발에 <table border="1"><tbody><tr><td> 배아의 상태 </td><td> 받는 여성의 번호 </td><td> 배아의 번호 전송 </td><td> 주입 사이트 (번호 (%)) </td><td> (번호 (%)) 새끼 라이브 </td></tr><tr><td> 신선한 </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vitrified </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> 표 2. C57BL/6J 마우스에 vitrified - 해동 배아의 생체내 개발에. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 평균, vitrification 및 배아의 융해를 포함하여 실험의 전반적인 체계. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 해동의 각 단계에서 배아의 형태. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 배아의 절차를 해동. 모든 절차는 실온에서 수행됩니다. (A), cryotube에 TS1 (37 ° C)의 850 μl를 추가하고 플라스틱 접시에 cryotube에있는 솔루션의 전체 볼륨을 전송합니다. 이때 태아는 같은 그림에 표시된 부었습니다. 2B. (B), 부드러운 흔들림으로 접시의 표면에 걸쳐 솔루션을 펴. (C), 플라스틱 접시에 TS2 세 50 μl 방울을 넣으십시오. (D), TS2의 첫 번째 드롭에 배아를 전송합니다. 그림과 같이 3 분 후, 배아는 shurunken보세요. 2C. (E), 그들은 직렬 전송나머지 TS2로 니는 문화 매체 후 방울합니다.

<ol><li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196%C2%B0+and+-269%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li>
<li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196%C2%B0C+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li>
<li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li>
<li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mamm.+Ova.+Res%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li>
<li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution%2C+without+appreciable+loss+of+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fert%22%5BJournal%5D)">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li>
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<li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li>
<li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li>
</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

1985 2 Rall와 Fahy로 마우스 배아 vitrification의 첫 번째 보고서 이후, 몇 가지 기술 향상은 해동 후 태아의 survivability을 증가되었습니다. 가장 성공적인 수정 중 하나 때문에 낮은 독성과 높은 막 - 투자율의 cryoprotectant으로 에틸렌 글리콜의 사용에 의해 달성되었다. 이러한 장점은 우리가 상온 4 냉동 배아를 처리할 수 있도록, 다른 vitrification 방법은 냉각기 온도에서 나눠 배아을 필요로 항상 BALB / C를 포함하여 6 생쥐의 일부 변종에 적용되지 않습니다. 첫 번째 에틸렌 글리콜 기반 vitrification은 카사이 외에 의해 개발되었습니다. 1990 5,7 인치 원래 메소드가 컨테이너와 같은 플라스틱 빨대에 최적 이었기 때문에, 우리는 약간 실험실에서보다 쉽게​​ 접근하고 물리적 피해에 더 강한 cryotubes에 대한 프로토콜을 수정합니다. 따라서, 여기에서 설명한 vitrification 방법은 응용 프로그램 수연구 모델로 마우스를 사용하여 많은 실험실로 licable. 같은 방법도 morula와 blastocyst 단계 8 쥐 배아 9시 마우스 배아 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 최근 cryotubes의 품질 냉동 - 해동 후 태아의 생존 속도에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 그러므로, 그것은 vitrifying 배아 (; 특정 시약 및 장비의 테이블에서 참조 예) 전에 매끄러운위한 cryotubes의 내부 표면을 조사하는 것이 필수적입니다. Vitrification 방법은 기존의 느린 냉동 방법을 통해 많은 장점을 가지고 있지만, 그들은 본질적으로 운송 목적에 대하여에 불이익을했습니다. vitrified 배아 아래 -120에서 보관해야합니다로서 ° C가 자신의 생존을 유지하기 위해, 건조 화주는 일반적으로 자신의 안전 수송을 위해 사용됩니다. 드라이 화주는 무겁고 부피가 있으며, 그들의 왕복 특히 국제 운송을위한, 비싼 수 있습니다. 우리는 지금 현재에 의해 새로운 vitrification 방법을 개발하고 있습니다어떤 vitrified 배아는 최소 7 일 10 (-80 ° C 정도) 드라이 아이스 온도에서 저장할 수 있습니다. 이 방법은 다음 세대의 vitrification해야합니다.

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 머크 Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12,657 </td><td></td></tr><tr><td> 에틸렌 글리콜 </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> 나이 HPO 4 명이 12H 2 </sUB&gt; O </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 G </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P - 4687 </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P - 8574 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 와코 순수 화학 산업 </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 중간 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 매체 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> Cryotube </td><td> 스미토모 Bakelite </td><td> MS - 4501 </td><td> &quot;극저온 약병&quot; </td></tr></table>

에틸렌 글리콜 기반 vitrification에 의한 마우스 태아의 cryopreservation

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

마우스 배아의 Cryopreservation은 생쥐의 많은 변종이 유전자 개조에 의해 생산되어 있고 숫자가 지속적으로 매년 증가하기 때문에, 생명 의학 과학을 지원하는 기술 기반입니다. 그 기술 개발은 다음 후반 1980 년대 2 개발 vitrification 방법 다음, 1970 년대 1 느린 냉동 방법으로 시작했다. 일반적으로 후자의 기술은 민첩, 단순하고, 복구 배아 높은 survivability에 유리합니다. 그러나 포함된 cryoprotectants는 매우 독성이 있으며, 이후 배아 발달에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 기술은 솔루션 4 냉각 경우에도 생쥐의 특정 변종에 적용 아니었 ° C 배아 처리하는 동안 독성 효과를 완화합니다. RIKEN BioResource 센터에서 서로 다른 유전 배경과 phenotypes와 5000 개가 넘는 마우스 변종 3을 유지하고 있으며, 따라서 우리는 vitrification 테를 최적화chnique이있는 우리는 주위 온도가 4 vitrifying 및 (또는 더 정확하게, 액화) 해동 후 높은 배아 생존의 이점과 함께, 마우스의 여러 변종의 배아를 cryopreserve 수 있습니다. 여기, 우리는 성공적으로 우리 센터에서 사용되고 있습니다 마우스 배아의 vitrification 방법을 제시한다. cryopreservation 솔루션은 배아 5 독성을 최소화하기 위해 대신 DMSO의 에틸렌 글리콜이 포함되어 있습니다. 또한 각각 Ficoll과 devitrification 및 삼투 조정 방지 자당이 포함되어 있습니다. 배아는 상온에서 처​​리하고 5 분 이내에 액체 질소로 전송할 수 있습니다. 원래 메소드가 컨테이너와 같은 플라스틱 빨대에 최적 이었기 때문에, 우리는 약간 실험실에서보다 쉽게​​ 접근하고 물리적 피해에 더 강한 cryotubes에 대한 프로토콜을 수정합니다. 그것이 중요한 ste이기 때문에 우리는 또한 자세한 vitrified 배아를 해동의 과정을 설명사는 생쥐의 효율적인 복구를 위해 P. 이 방법은 안전하고 비용 효율적인 방식으로 나중에 사용하기 위해 마우스 종자 보존이 필요 연구자 및 기술자에게 도움이 될 것입니다.

마우스 배아의 에틸렌 글리콜 기반 vitrification 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 단순하고 낮은 배아 독성의 다른 방법에 유리하고, 따라서 근친과 유전자 - 수정된 생쥐를 포함하여 마우스의 여러 변종에 광범위하게 적용하실 수 있습니다.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

생쥐 배아의 동결보존은 생의학의 기술적 기반이 되는데, 이는 많은 생쥐 계통이 유전적...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 마우스 배아를 액체 질소에 동결 보존하고, 이를 해동하여 살아있는 마우스를 회복시키는 것입니다. 이는 먼저 마우스 배아를 평형화 배지에 담근 후, 크라이오 튜브 내의 유리화 배지로 옮기고, 다시 액체 질소 탱크에 배치함으로써 수행됩니다. 이후 배아는 고삼투압 배지에서 해동되며, 수용 암컷에 이식될 때까지 배양 배지에서 배양됩니다.최종적으로, 유리화 동결 해동 후 배아의 생존율은 90% 이상이었으며, 배아 이식 후 출생률은 30%에서 70% 사이로 나타났습니다. 이 기술의 주요 장점은 투과성 동결보호제인 glycol이 기존의 동결보호제보다 배아에 대한 독성이 적다는 점입니다. 본 프로토콜을 시작하기 전, 저희 실험실의 기술자가 해당 절차를 시연할 예정입니다.자연 교배 또는 일반적인 IVF 기술로 얻은 2세포 마우스 배아 두 개를 최종 보관을 위해 크라이오 튜브에 준비하고, 배아 동결액 EF S 40 50 µL를 첨가합니다. 그다음 35 mm 또는 60 mm 플라스틱 페트리 접시에 상온의 EFS 20 50 µL를 준비합니다.유리 모세관을 사용하여 최대 30개의 배아를 디쉬로 옮깁니다. 이때 배양액이 함께 옮겨지지 않도록 주의하십시오. 또한 배아의 탈수를 방지하기 위해, 배아를 방울의 바닥 부분에 배치하십시오.약 60~90초 후에 모세관을 사용하여 수축된 형태의 탈수된 배아를 흡입합니다. 이 배아들을 크라이오 튜브 내의 EFS 용액으로 옮기되, EFS 20은 가능한 한 적게 옮깁니다.배아를 옮긴 후, 액체 질소에 냉동시키기 전 EFS 40에서 1분 동안 안정화시킵니다. 배아를 해동하기 전에 M 16 배지와 같은 고삼투압 배아 배양액 10 µL를 배양 접시에 최소 두 방울 떨어뜨립니다. 그 다음, 실리콘 오일 또는 미네랄 오일로 방울을 완전히 덮고, 사용할 때까지 접시를 이산화탄소 배양기에 보관합니다.다음으로, 안면 마스크와 저온 장갑을 착용한 상태에서 TS one 용액을 37 °C로 가온합니다. 액체 질소 탱크에서 배아를 꺼냅니다. 이제 저온 튜브를 빠르게 열고, 액체 질소는 탱크나 적절한 용기에 버립니다.그런 다음 30초 동안 기다립니다. 이제 가온된 TS one 용액 850 µL를 크라이오 튜브에 첨가합니다. 용액이 균일하게 용해되도록 부드럽게 흡입하고 배출하는 과정을 약 10회 반복합니다.그런 다음 전체 부피를 60 millimeter 플라스틱 페트리 접시나 시계 접시로 옮깁니다. 배아가 상온에 적응할 수 있도록 3분 동안 기다리며, 이후의 모든 과정 동안 배아는 상온 상태를 유지해야 합니다. 가온 장치는 사용하지 마십시오.실체 현미경으로 디쉬 내의 배아를 빠르게 관찰하여 배양 시작 시점의 상태를 확인합니다. 약 2분간 배양한 후, 배지가 디쉬 표면에 넓게 퍼질 때까지 디쉬를 부드럽게 흔들어 배아를 가라앉힙니다. 배양 마지막 1분에 TS two 용액 50 µL 방울 세 개를 디쉬에 각각 분주합니다.3분이 지나면 실체 현미경을 사용하여 배아가 약간 수축되었는지 확인하십시오. 배아가 여전히 부풀어 있다면, 1~3분 더 배양을 계속하십시오. 이제 유리 모세관으로 배아를 집어 TS two의 첫 번째 방울로 옮기십시오.3분 동안 대기한 후 배아를 두 번째 방울로 옮깁니다. 이어서 세 번째 방울로 옮깁니다. 마지막으로, 인큐베이터에 보관해 두었던 배아 배양액 접시를 꺼내어 유리 모세관을 사용하여 배아를 배양액의 첫 번째 방울로 옮깁니다.실체 현미경으로 관찰했을 때, 배아는 서서히 정상적인 형태를 회복해야 합니다. 이제 배양 접시를 인큐베이터에 넣고 약 10분 동안 둡니다. 그런 다음 TS 2에서 이월된 수크로스를 씻어냅니다.배아를 다음 배양액 방울로 옮깁니다. 수혜 암컷의 uc로 이식할 때까지 CO2 배양기에서 배아 배양을 계속합니다. 세 가지 서로 다른 마우스 계통에서 300~480개의 배아를 유리화 및 회복시킨 후, 생존율이 매우 높게 나타났습니다.해동 후, 정상적인 형태를 보이는 배아의 비율은 93%에서 99% 사이였으며, 해당 배아 중 적어도 84%가 포배낭으로 발달했습니다. 액체 질소를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 직접적인 접촉을 피하고 짧은 거리에서의 노출을 최소화하기 위한 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 질소를 취급할 때는 항상 이 절차를 수행해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상 기사에서 우리는 하이 포스트 - 해동 서바이벌 속도로 햄스터 oocytes를 수집하고 cryopreserve하는 방법에 대한 단계별 데모를 제시한다. 동일한 절차도 성공적으로 동결과 preimplantation 개발의 다른 단계에 마우스 배아를 해동 적용할 수 있습니다.

수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

Preimplantation의 배아는 세포 탈수를 일으킬 수있는 hypertonic cryoprotective 솔루션으로 배치 후 cryopreserved 수 있습니다. 평균 후, 얼음 결정 형성은 배아를 둘러싼 솔루션에 유도합니다. 배아가 천천히 스토리지를위한 액체 질소로 폭락하기 전에 서브 제로 온도에 냉각로 추가 탈수가 발생합니다.

Preimplantation 캐틀의 태아, 양, 그리고 염소 Cryopreservation

여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 냉동 - 해동 정자와 두 개의 세포 단계의 배아 개발이 키트의 사용 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 유전자 변형 마우스 라인 전 • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 성공적으로 IVF로 회복되었습니다.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

이 비디오에서는 에틸렌 글리콜 및 디메틸 설폭사이드를 동결 보호제로, 극저온 빨대를 운반 시스템으로 사용하여 원하는 발달 단계에서 수확된 토끼 배아를 유리화하는 절차를 설명합니다. 유리화된 배아는 생존율이 높으며 사용할 때까지 장기간 보관할 수 있습니다.

극저온 빨대를 사용한 토끼 배아 유리화: 장기 보관을 위해 토끼 배아를 보존하기 위한 초고속 냉각 기술

이 비디오는 유리화 토끼 배아를 해동하는 절차와 최적의 배아 회복을 위한 예방 측정 단계를 보여줍니다.

토끼 배아 해동: 배아 이식을 위해 냉동 보존된 토끼 배아를 회수하기 위한 온난화 절차

자궁 - 난관 배아 입금 자궁 전송을 수행 할 때 발생할 수있는 배아 유출을 방지하는 장벽으로 자궁 - 난관 접합부를 사용한다. 과 vasectomized 남성은 배아 전송 pseudopregnant받는 사람을 얻기 위해 필요합니다. 두 가지 기술을 설명합니다.

마우스 모델에서 자궁 - 난관 배아 전송 및 정관

MicroSecure Vitrification은 FDA 우수 제조 및 조직 취급 관행을 준수하는 비상업적인 무균 폐쇄 유리화 장치 시스템으로 개발되었습니다. 소수성 플러그 배아 빨대가 업계에서 철수함에 따라 유리화 절차는 표준 내부 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 수정되었습니다.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

보조 생식 기술 (ARTs)은 결과를 개선 하 고 관련 위험을 줄이기 위해 지속적인 평가를 하 고 있습니다. 이 원고는 인간 재생의 이상적인 동물 모델로 서 토끼의 사용을 허용 하는 효율적인 냉동 보존 프로토콜을 가진 최소 침 습 배아 전달 절차를 설명 합니다.

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

여기 previtrification 개입 및 후 지구 온난화 복구 동안 blastocyst 수축 하 고 다시 확장의 강도 따라 시간 경과 형태학 프로토콜 선물이. 프로토콜의 응용 프로그램에서 체 외에서 수정 시간 경과 현미경을 장착 가능 하며 최적의 blastocyst vitrification 방법의 개발에 것이 좋습니다.

Vitrification 온난 단계 동안 Blastocyst 행동의 객관적인 평가 대 한 형태학 프로토콜

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

여기에서는 홈메이드 주걱으로 구성되고 홈메이드 솔루션을 활용하여 마우스와 양의 착상 전 배아를 유리화하기 위한 Spatula Montevideo 프로토콜을 제시합니다. 배아는 농도가 증가하는 두 개의 동결 보호 용액에서 빠르게 평형을 이루고, 주걱에 적재되고, 액체 질소에 담근 다음, 최종적으로 0.5mL 빨대로 밀봉됩니다.

포유류 배아의 유리화를 위한 주걱 몬테비데오 장치

학습하세요 에틸렌 글리콜 기반 vitrification을 이용한 마우스 태아의 cryopreservation 방법을. 이 기술은 90% 이상의 생존율과 낮은 배아 독성으로 다양한 마우스 계통에 적용 가능합니다.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

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