Morpholino 매개 유전자 편집: 단세포 동굴물고기 알에서 번역 차단 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 사용한 유전자 녹다운 기술

모르폴리노는 천연 뉴클레오티드와 비교하여 인산염 백본과 당 구조에 차이가 있는 짧은 단일 가닥 재설계된 올리고뉴클레오티드입니다. 이러한 특징은 생리학적 pH에서 모르폴리노의 안정성을 향상시킵니다. 이러한 변이에도 불구하고 모르폴리노는 녹다운할 원하는 표적 유전자의 특정 mRNA 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 설계하는 데 도움이 되는 표준 뉴클레오

모르폴리노 기반 유전자 편집을 수행하려면 먼저 아가로스 주입 플레이트의 웰 안에 놓인 단세포 동굴 물고기 알을 채취합니다. 반투명하고 둥근 계란을 시각화하여 난황낭(계란 내부에 존재하는 액체로 채워진 구조)을 찾습니다.

설계된 모르폴리노가 포함된 용액으로 미리 채워진 미세 주입 바늘을 가져 가십시오. 용액을 달걀 노른자에 직접 주입하여 모르폴리노가 세포질에 들어가도록 합니다. 세포 내부에서 표적 유전자는 mRNA를 형성하여 세포질로 운반됩니다.

세포질 내에서 주입된 모르폴리노는 내인성 개시 부위에서 상보적인 표적 mRNA 전사체와 혼성화되고 그 너머로 확장됩니다. 이 과정은 리보솜의 더 큰 서브유닛과 일부 특정 단백질과 복합체화된 작은 리보솜 서브유닛으로 구성된 초기 번역 개시 복합체의 결합을 차단합니다.

그 후, 번역 개시 복합체의 진행이 입체적으로 방해되어 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 멈춥니다. 마지막으로, 표적 단백질 농도는 모르폴리노에 의한 번역 차단으로 인해 감소합니다.

주사 당일 유리 피펫을 사용하여 단세포 계란을 주입 플레이트로 옮기고 주입 플레이트의 최대 5줄에 한 줄당 30-40개의 계란을 채웁니다. 소량의 어류 시스템 물로 계란을 수분으로 유지하십시오. 얼음 위에 모르폴리노를 해동하고 긴 Microloader 피펫 팁을 사용하거나 끝에 2-4마이크로리터 볼루스를 추가하여 계란당 400피코그램의 모르폴리노가 주입되도록 주사 용액을 준비합니다.

모든 바늘이 로드되면 겸자를 사용하여 주사 바늘 끝에서 초과 길이를 다듬고 첫 번째 바늘을 피코리터 마이크로인젝터에 연결된 마이크로매니퓰레이터에 장착합니다. 그런 다음 주입 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘로 각 계란을 관통한 후 1나노리터의 모르폴리노 주입 용액을 노른자에 직접 주입합니다.