Name: 공학 세포 투과 단백질 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 8 s
Description: 배우세요 포유류 세포에 직접 단백질을 전달하는 단백질 투과 기법을 E. coli 발현 및 니켈 친화 크로마토그래피 정제법과 함께. 이 방법은 유전자 변형 없이 비분열 세포를 조작할 수 있습니다.

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우리는 올리버 Brüstle 및 줄기 세포 공학 그룹, 지원 및 귀중한 토론 본 대학의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 SDS - PAGE 및 프로젝트 전반에 걸쳐 지속적인 지원의 준비에 대한 사빈 쉥크 감사합니다. 니콜 러스와 안나 Magerhans 뛰어난 기술 지원을 제공했습니다. 또한, 우리는 영화의 생산을위한 안드레아스 바, 쉴라 머텐스 감사하고 싶습니다. 이 작품은 폭스바겐 재단 (AZ I/77864) 및 교육과 연구의 독일 교육부 (BMBF, 01 GN 0813)에서 보조금에 의해 지원되었다.

발현 벡터와 표현의 건설 : pSESAME - Cre 호텔 표현 벡터는 표준 복제 방법을 사용 AvrII 및 NheI 제한 사이트를 통해 pSESAME에 Cre 호텔 - 인코딩 조각을 삽입하여 건설되었습니다. pSESAME은 히스티딘 태그, 두드리는 소리 - 도메인, NLS 시퀀스와 Cre 호텔, 약식 HTNCre 구성된 융합 단백질을 인코딩합니다. HTNCre 표현에 대한 pSESAME - Cre 호텔은 튜너 (DE3) pLacI로 변환 및 글리세롤 주식을 준비하는 데 사용되었다. <ol><li> 이상 박 문화 글리세롤 주식의 변형 박테리아와 코팅 pipet 팁을 사용하여 주사를했다. 이상의 밤 문화는 0.5 %의 포도당과 보충 LB 미디어로 구성되어 [V / V] 50 μg / ML의 최종 농도에 carbenicillin 37에서 성장을 허용했다 ° 16시간를위한 C. </li><li> 다음날 밀도 성장을 통해 밤 문화은 1 40 비율로 표현 문화를 예방하는 데 사용되었으며 37 ° C.에서 인큐베이터에 넣어되었습니다 표현 문화는 100 μg / ML의 최종 농도에서 0.5 % 포도당 [V / V]와 암피실린로 보충 TB 미디어 구성되어. </li><li> 1.5 OD 595에서 표현 문화는 1 H.위한 0.5 MM의 IPTG로 유도했습니다 </li><li> 후 박테리아는 SLA3000 로터에서 10 분 동안 5,000 rpm으로 원심 분리에 의해 수집되었다. </li><li> 박테리아의 알약은 마이너스 20 ° C 정화까지 저장되었습니다. </li></ol> 세포 투과 단백질의 정제 : <ol><li> 냉동 세균 알약은 실온에서 15 분 동안 리터 플라스크 문화 당 10 ML의 용해 버퍼에서 resuspended되었습니다. </li><li> 실온에서 혼합하는 동안 정지 후 추가로 15 분 동안 1 MG / ML 라이 소 자임와 incubated했다. </li><li> 25 U / ML benzonase는 나중에 추가하고 실온에서 15 분 동안 혼합하는 동안 incubated되었습니다. </li><li> 전력의 45 %로 0.5 S 펄스와 1.5 분 얼음 sonification 후, 1 ML 차가운 tartaric 소금 버퍼 (TSB)가 당 ML 정지 신중하면서 추가되었습니다 혼합하고 얼음에서 5 분 incubated. lysate 분수 (L)의 SDS - PAGE 샘플 찍은. </li><li> 걷어 lysate는 ° C 30 분 30,000 G. 4 원심 분리하여 얻은 가용성 (S)과 불용성 분수 (I)의 SDS - PAGE 샘플가 함락되었다. </li><li> 뜨는은 신선한 50 ML 팔콘 튜브 안으로 옮겨졌 다가 그리고 부드럽게 4 1 H에 대한 혼합되었습니다 ° C 50 % 초기 표현 문화의 리터 당 니켈 - NTA 슬러리 2 ML과 함께. </li><li> 현탁액은 중력 흐름 EconoPac 칼럼 (분율 흐름을 통해 (FT) 찍은의 SDS - PAGE 샘플)로 포장 및 세척 버퍼 5 침대 볼륨과 함께 두 번 씻어했다. 모두 세척 분수 (W1 &amp; W2)의 SDS - PAGE 샘플을 채취했다. </li><li> HTNCre 함유 분수는 SDS - PAGE 분석을위한 eluate 분율 (E)의 용출 버퍼와 샘플 3 침대 볼륨 eluted되었습니다 것은 찍은. </li><li> 이미다졸 두 번이나 높은 소금 버퍼에 대한 용출 분획을 dialyzing에 의해 제거되었습니다. </li><li> 단백질 솔루션은 더욱 두 번 글리세롤 버퍼에 대한 dialyzing로 집중되었다. 모든 투석 단계에서 샘플로 버퍼의 비율은 최소한 50되었다. 이 절차는 200 450 μm의 사이에 평소와 농도에 HTNCre를 포함하는 글리세롤 주식 솔루션으로 이어지는, 즉 표현 문화 1 리터 단백질 ~ 12 MG가 발생합니다. SDS - PAGE 분석을위한 글리세롤 주식 (GS)의 샘플을 수집했다. HTNCre 주식 솔루션은 마이너스 20 저장할 수 있습니다 ° C. </li></ol><img border="0" src="/files/ftp_upload/1627/1627fig1tmb.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : Cre 호텔 recombinase의 정화 과정을 통해 수집된 샘플의 SDS - PAGE 분석. Cre 호텔 표현의 유도는 lysate 소수의 지배적인 밴드로 표시됩니다. 단백질의 일부​​는 불용성이지만 eluate과 글리세롤 주식 분수 모습으로 Cre 호텔 단백질이 더 풍부하게하실 수 있습니다. L : Lysate, I : 불용성, S : 뜨는, FT : 흐름 -을 통해, W : 세탁, E : Eluate, GS : Gylcerol 주식. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1627/1627fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. murine 배아 줄기 (ES) 세포에 단백질 전달 : <ol><li> 조건부 β - Galactosidase 기자 다섯 구조를 갖고 ES 세포가 자기편 세포의 분리에 대한 TrypLE ™ Express를 사용하여 단일 세포로 씨앗을 품고 있었다. 4~6시간 후 세포가 다시 연결했고 매체가 삭제되었습니다. </li><li> 이후 ES 세포는 16 시간 동안 HTNCre 함유 매체와 incubated했다. <ul><li> 글리세롤의 품절 HTNCre 단백질의 적절한 금액 (10 μm의에 해당)은 ES 매체와 이후 살균 filtrated (0.22 μm의)에 희석되었다. </li></ul></li><li> 단백질 전달 매체는 정상적인 성장 매체로 변경되었습니다 후. </li><li> 이틀 세포는 PBS로 씻어 10 분 4 % Paraformaldehyde (PFA)가 수정되었습니다 후에. </li><li> 두 addiX - 걸의 얼룩이 수행되기 전에 PBS로 세척 tional 단계를 수행했다. </li><li> 고정 세포 X - 걸의 얼룩 솔루션 6 층 덮여 37 ° C. 밤 동안 incubated되었습니다 </li></ol> 대표 결과 : 다음 날 X - 걸의 얼룩 솔루션은 했잖아요되었으며 세포는 현미경 분석을위한 PBS의 레이어로 쓰여져있었습니다. recombined 세포의 80-100%는 β - Galactosidase의 활동에 의해 판단 murine ES 세포 내에서 관찰 수 있습니다.

<ol><li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+revisited%3A+novel+insights+into+the+mechanism+underlying+intracellular+delivery+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins.</a> Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).</li>
<li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talking+about+a+revolution%3A+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).</li>
<li>Nolden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+in+human+embryonic+stem+cells+induced+by+cell-permeant+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase.</a> Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).</li>
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</ol>

Cre 호텔 융합 단백질의 정화 과정에서 그것은 원심 분리하기 전에 얼음 차가운 TBS 버퍼의 추가를 생략하지 않는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 Cre 호텔 recombinase는 글리세롤 버퍼 내에 침전하는 경향이있다. eluate 분율이 될 나타나는 경우 솔루션을 다시 해제 때까지 융합 단백질 추가 용출 버퍼의 높은 농도로 인해 흐린이 추가되어야합니다. Cre 호텔 융합 단백질의 10 μm의의 응용 프로그램은 일반적으로 80-100%의 재조합 효율을 초래합니다. 소태아 세럼 (FCS)는 ES 세포 매체의 주요 구성 요소가되는 것은 강력하게 단백질 전달을 억제. Cre 호텔 recombinase의 따라서 고농도 사용할 수 있었다. 혈청이없는 조건에서 작업할 때 더 적은 단백질 (0.5-2 μm의)는 유사한 재조합 효율을 달성하는 데 사용할 수 있습니다. 손에 pSESAME 벡터 시스템과 하나가 같은 Oct4와 Sox2 7 Scl/Tal1 8로 전사 요인 등 다른 단백질로 단백질 전달의 기법을 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>TUNER (DE3) pLacI</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70625</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>T876.1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X998.4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>2363.4</td><td></td></tr><tr><td>트립톤/펩톤</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>8952.4</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; </td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>카베니실린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>벤조네이즈</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-타르타르산, 이나트륨염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% Ni-NTA 슬러리</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>EconoPac 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 0,22&amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 배지</td><td></td><td></td><td>효모 추출물, 트립톤/펩톤, NaCl</td></tr><tr><td>TB 배지</td><td></td><td></td><td>효모 추출물, 트립톤/펩톤, 글리세롤, K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>용해 버퍼</td><td></td><td></td><td>50 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 mM tris, pH 7.8</td></tr><tr><td>타르타르산염 버퍼 (TSB)</td><td></td><td></td><td>2 M L-타르타르산 이나트륨염 및 20 mM 이미다졸을 포함하는 PTB</td></tr><tr><td>세척 버퍼</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 15 mM 이미다졸</td></tr><tr><td>용출 버퍼</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 250 mM 이미다졸</td></tr><tr><td>고염 버퍼</td><td></td><td></td><td>600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>글리세롤 버퍼</td><td></td><td></td><td>50% 글리세롤, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>TrypLE&amp;#8482; Express</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Gal 염색액:</td><td></td><td></td><td>4 mM K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;), 4 mM K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;),&lt;br/&gt;2mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 0.4 mg/mL X-Gal을 PBS에 녹인 것</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3367</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr></tbody></table>

공학 세포 투과 단백질

Engineering Cell-permeable Protein

단백질 전달 기술은 포유 동물 세포에 생물 학적 활성 물질의 직접 전송을 가능하게 [검토 1,2 참조]를. 이것은 소위 세포 관통 펩티드 (CPPs)의 translocating 능력을 사용 할 수 들면, 또한 단백질 전달 도메인 (PTDs)로 지정. 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV - 1) 태트 (전사의 횡단 활성제) 단백질이 널리 사용되고 있습니다 파생된 문신 - CPP. 적극적으로 청구 문신함으로써 endocytosis 또는 / 및 직접 멤브레인 보급률 2 세포 멤브레인의 장벽을 극복 세포 투과성을 촉진합니다. 핵 지방화 신호와 함께 (NLS) 융합 단백질은 핵 전시 기능을 입력할 수 있습니다. 우리의 비디오 프레 젠 테이션 세포 투과 단백질 공학, 건설, 생산 및 DNA - 수정 효소 Cre 호텔의 세포 투과 버전의 응용 프로그램에 대한 예증으로 보여줍니다. CRE는 체외에서 생체내의 포유 동물 세포의 34 기본 쌍의 loxP 사이트를 인식하고 재결합 수있는 특정 사이트 recombinase입니다. 따라서 Cre 호텔 / loxP 시스템은 널리 조건 살아있는 세포 3,4의 게놈의 변이를 유도하는 데 사용됩니다. 세포 활성 Cre 호텔 recombinase의 배달 그러나, 제한을 나타냅니다. 우리는 유전자 수준의 관심을 직접 삽입이 가능하고 신속하게 편리하고 표준화된 방식으로 벡터 내에서 사용되는 다른 도메인과 태그를 복제하는 플랫폼을 제공 pSESAME 벡터 시스템을 설명합니다. 다른 태그 재정렬하면 높은 수율과 더 나은 용해도를 달성하는 가능성을 제공하는 융합 단백질의 생화 학적 속성을 수정 표시되었습니다. 우리와 E. 대장균에서 재조합 세포 permeant 단백질을 표현하고 정화하는 방법을 보여줍니다. 재조합 단백질 Cre 호텔의 기능은 마침내 세포 recombinase 활동을 평가하여 세포 배양에 확인됩니다.

단백질 전달은 세포에 생물학적으로 활성화된 단백질의 직접 배달을 수 있습니다. 이러한 DNA의 transfection 또는 바이러스성 도입으로 종래의 방법과는 달리이 비침습 패러다임은 세포 독성 및 영구 유전자 조작에 의해 종양 발생 변화의 위험을 우회 titratable 방식으로 고효율 세포 조작이 가능합니다.

단백질 형질도입 기술을 통해 생물학적으로 활성인 물질을 포유류 세포 내로 직접 전달할 수 있습니다 [검토를 위해 1,2 참조]. 이를 위해 ...

지난 15년 동안 세포 기능의 조절은 DNA transfection 또는 viral transduction이라는 고전적인 접근 방식을 통해 이루어져 왔습니다. 이에 더해 또 다른 방법이 발전하였습니다. 단백질 transduction을 통해, 표적 단백질에 융합되어 세포 내 흡수를 촉진하는 작은 펩타이드를 이용하여 생물학적 활성 단백질을 포유류 세포로 직접 전달할 수 있습니다.DNA를 사용하지 않으므로 외인성 유전자 삽입의 위험이 방지됩니다. 앞서 언급한 전통적인 방법들과 달리, 단백질 트랜스덕션은 단백질을 적정 가능한 방식으로 전달할 수 있게 합니다.또한, 소규모 세포 집단뿐만 아니라 분열 후 뉴런(post mitotic neurons)과 같이 분열하지 않는 세포들도 조절할 수 있습니다. 재조합 단백질을 효율적으로 발현시키기 위해 Paciz 벡터 시스템의 사용을 권장합니다. 이는 N-말단 및 C-말단 변이체로 구성된 모듈형 벡터 시스템입니다.두 벡터 모두 정제를 목적으로 표적 유전자를 쉽게 삽입할 수 있도록 설계되었습니다. 히스티딘 태그뿐만 아니라 단백질 투과 도메인도 통합되어 있습니다. 본 실험의 경우, 세포 내 분포를 위해 세포 흡수를 촉진하는 HI 바이러스 유래 도메인을 사용하였습니다.제어 목적으로 핵 국소화 신호를 추가하여 벡터를 완성하며, 융합 태그는 간단히 제거할 수 있습니다. 또한, 이러한 태그의 배열은 융합 단백질의 특성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 수율과 순도뿐만 아니라 세포 내 위치 및 생물학적 기능에 미치는 영향은 예측할 수 없습니다.안녕하세요, 제 이름은 Bernard Mus이며 독일 본에 위치한 재건 신경생물학 연구소의 줄기세포 공학 그룹에서 근무하고 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Christoph P이며 저 또한 Hoover Lab의 일원입니다. 저희 연구 그룹은 다양한 포유류 세포에 생물학적으로 활성된 단백질을 직접 전달하기 위해 단백질 도입 기술을 집중적으로 활용하고 있으며, 오늘은 e coli에서의 발현 및 정제 과정을 안내해 드리고자 합니다.그 후, 전체적인 발현, 정제 및 응용 과정을 예시하기 위해 세포 배양에서 세포 영구 융합 단백질을 적용하는 방법을 보여드리고자 합니다. 저희는 마우스 배아 줄기세포를 유전적으로 변형하기 위해 부위 특이적 재조합 Cre를 이용합니다. 자, 이제 시작하겠습니다.밤샘 배양액을 접종하기 위해, -80 °C의 글리세롤 스톡에 보관된 이미 형질전환된 박테리아를 사용합니다. 이 박테리아들은 이미 decre 재조합을 인코딩하는 벡터를 포함하고 있습니다. 피펫 팁을 사용하여 박테리아 소량을 긁어낸 후, 이를 밤샘 배양액이 담긴 비커에 떨어뜨립니다.밤샘 배양액은 최종 농도 0.5%의 glucose와 ml당 50 micrograms의 carbonic insulin이 첨가된 LB 배지로 구성됩니다. 그 후 비커를 37 °C로 설정된 배양기에 넣어 부위 특이적 Recombinate Cree를 발현시킵니다. 대규모 발현 배양에는 미리 가온된 TB 배지를 사용합니다.발현 속도를 높이기 위해, 재조합 단백질 발현 온도인 37 °C로 데운 TB 배지를 사용할 것을 권장합니다. 다음으로, 최종 농도가 0.5%가 되도록 TB 배지에 glucose를 첨가합니다. glucose는 유도 전 발현 배양액의 성장 과정 동안 융합 단백질의 기저 발현이 증가하는 것을 방지합니다. 마지막으로, decree 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 보유한 박테리아만 포함된 순수 배양을 보장하기 위해, 최종 농도가 100 µg/mL가 되도록 발현 배양액에 ampicillin을 첨가합니다.이제 하룻밤 동안 배양한 배양액을 준비하여 1:50의 비율로 발현 배양액에 접종할 수 있습니다. 그 후 비커를 37°C로 설정된 배양기에 옮깁니다. 발현 과정 전반에 걸쳐 정기적으로 샘플을 채취하여 흡광도(optical density)를 측정해야 합니다.배양액의 광학 밀도가 1.5에 도달하는 즉시, 0.5 millimolar의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 박테리아를 유도합니다. 1시간의 유도 후, 발현 배양액을 튜브에 옮기고 원심 분리를 통해 수확합니다. 이를 위해 SLA 3000 로터를 사용합니다.원심분리기를 4 °C에서 5,000 rpm의 속도로 10분 동안 가동합니다. 그 후 상층액은 버리고 박테리아 펠렛은 -20 °C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 냉동된 펠렛은 발현 배양액 1 L에 해당하는 양의 lizza 버퍼에 다시 현탁합니다.Lizza 버퍼 10 mL를 사용하고, 용액이 균질해질 때까지 약 15분 동안 기다립니다. 그 후 현탁액 1 mL당 1 mg의 라이소자임을 추가합니다. 효소가 박테리아를 용해할 수 있도록 용액을 20분 동안 혼합합니다.그 후, DNA를 절단하여 용액의 점도를 낮추기 위해 Benzonase를 1:1000 비율로 희석하여 추가로 15분 동안 처리합니다. 마지막으로, 세포 용해를 확실히 하기 위해 초음파 분쇄기(sonicator)를 사용합니다. 인증 완료 후, 45%의 출력으로 1분 30초 동안 프로그램을 가동합니다.정제 과정의 모든 단계에서 조추출액(crude lysate)이나 SDS-PAGE 분석을 위한 샘플을 채취하는 것을 잊지 마십시오. 글리세롤 스톡 내에서 단백질이 침전되는 경향이 있으므로, 현탁액 1 mL당 얼음처럼 차가운 TSB 버퍼 1 mL를 추가하는 것이 매우 중요합니다. 이 단계를 생략할 경우, 용액을 짧게 혼합하면 조추출액은 이제 원심분리할 준비가 됩니다.이를 위해 SS 34 로터를 사용합니다. 원심분리기는 4 °C에서 17,000 RPM으로 30분 동안 작동시킵니다. 과정이 끝나면, 원심분리된 상층액을 조심스럽게 새 50 ml Falcon 튜브로 옮깁니다.이제 상층액에 니켈 항-A 슬러리를 추가하십시오. 항-A는 히스티딘 태그 융합 단백질의 적절한 정제를 위한 핵심 시약입니다. 히스티딘은 니켈 이온과 복합체를 형성하여 친화성 정제를 가능하게 합니다. 이제 파킨 튜브를 40 °C에서 60분 동안 부드럽게 흔들어 섞어주십시오.1시간 후, 현탁액을 20 ML 컬럼에 도포하고 중력 흐름에 의해 용액이 통과하도록 합니다. 대규모 생산의 경우, 현탁액을 여러 컬럼으로 나누어 분할하는 것이 가능합니다. 그런 다음 15 millimolar의 innersole이 포함된 완충액으로 컬럼을 두 번 세척합니다.사용되는 버퍼의 양은 레진 부피에 따라 달라집니다. 세척 목적으로는 nickel NTA 2 mL가 레진 1 mL에 해당합니다. 세척 후 컬럼에 세척 버퍼를 레진 부피의 5배만큼 넣으며, 이제 단백질을 용출할 준비가 되었습니다.따라서 250 millimolar 농도의 immuno 용출 버퍼를 사용합니다. 이때 레진의 색상이 녹색으로 변하는 것을 확인하십시오. CRE 단백질의 고농도로 인해 OID 분획이 때때로 탁해질 수 있습니다.이를 방지하기 위해 용액을 혼합하고 추가적인 lys 버퍼를 첨가하며, 모든 분획을 풀링한 후 용해 튜브로 옮깁니다. 용해 과정은 제거할 것입니다. 첫 번째 투석 단계는 고농도 염을 포함하는 버퍼를 대상으로 수행됩니다. 1시간 후, 고염 버퍼를 교체하고 하룻밤 동안 투석 과정을 적용합니다.다음 날, 투석 튜브를 고농도 염 버퍼에서 꺼내 글리세롤 버퍼로 옮깁니다. 3~5시간 후, 글리세롤 버퍼를 교체하고 다시 하룻밤 동안 투석을 수행합니다. 글리세롤 버퍼를 이용한 용해를 통해 최소 3배 농축된 스톡 용액을 얻을 수 있습니다.이제 스톡 솔루션을 -20°C에서 수년 동안 활성 저하 없이 보관할 수 있습니다. 품질 보증을 위해 수집한 SDS page 샘플을 겔에 로딩하고 이어서 염색할 수 있습니다. Coomassie 염색 시, Cree 융합 단백질은 OID 분획에서 뚜렷한 밴드로 검출됩니다. 적절한 농도의 crew recombination을 사용하려면 Redford 분석을 통해 농도를 결정해야 합니다.포유류 세포에 영구적 단백질을 도입하는 방법입니다. 우선, 최고 수준의 단백질 도입 효율을 얻기 위해 표적 세포를 준비하십시오. 표적 세포가 조밀한 군락을 형성하며 성장하는 세포인 경우, 다음 날 80~90%의 합류도(confluence) 세포층이 형성될 수 있는 밀도로 단층 세포를 준비하십시오.5시간 전에 세포를 분리 및 체세포화하여 단일 세포 현탁액 상태로 만듭니다. 단백질 형질전환 전에 단일 세포 현탁액을 만드는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 콜로니 표면의 세포만 형질전환될 수 있기 때문입니다. 배지를 흡입하고, 트립신 처리 전 PPS로 세포를 잠시 관찰합니다.혈청이 포함된 잔여 조제 배지를 제거합니다. PPS 오버레이를 흡입한 후, 세포가 흘러내리도록 하여 3~5분 동안 배양합니다. 이제 현미경으로 확인하여 모든 콜로니가 단일 세포로 분해되었는지 확인합니다.앞서 언급한 이유들로 인해, 이 과정은 yeast 세포로의 단백질 형질전환을 위한 매우 중요한 단계입니다. 분리된 세포를 튜브로 옮깁니다. 튜브를 원심분리기 거치대에 넣고 원심분리하여 세포를 침강시킵니다. 상층액을 흡입하여 제거하고 세포를 재현탁합니다.성장 배지로 세포를 희석하여 적절한 세포 수로 맞춥니다. 이는 당연히 조직 배양 접시의 크기에 따라 달라집니다. 배양 접시에서 세포를 5시간 더 추가로 배양합니다.이렇게 하면 공기 세포가 바닥에 부착되어 부착성으로 성장할 수 있는 충분한 시간이 확보됩니다. 3-class row stock은 -20°C에서 2년 이상 보관할 수 있습니다. 재조합 세포 영구 융합 단백질을 다룰 때, 필요에 따라 사용할 수 있는 이러한 스톡 용액을 보유하는 것은 매우 유용합니다.세포가 디쉬에 부착되기를 기다리는 동안, 적정 부피의 C transduction protein stock을 배지에 희석하여 transduction 배지를 간단히 준비할 수 있습니다. Stock 용액이 아직 멸균 상태가 아니므로, 배지를 적용하기 전에 반드시 멸균 필터를 사용해 여과해야 합니다. 단백질 결합 필터가 장착된 시린지를 사용할 것을 권장합니다.최종 creek 농도는 세포 유형이나 배지 보충제에 따라 달라집니다. 예를 들어, 혈청은 형질도입 효율에 강한 부정적인 영향을 미칩니다. 이는 혈청이 없는 배지를 사용하거나 creek 농도를 높임으로써 극복할 수 있습니다.최고의 재조합 효율을 가능하게 하는 최적 조건을 확인합니다. 하이드레이트 농도를 0.5에서 10 µM까지 설정하십시오. 6시간에서 18시간 사이의 다양한 배양 시간을 테스트하는 것을 권장합니다.5시간 동안 배양한 후, 대상 세포를 꺼내 교차 배지를 흡입하여 제거합니다. 이어서 이를 단백질 형질전환 배지로 교체하고, 세포를 인큐베이터에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. D 세포를 PBS로 가볍게 세척한 후, 단백질 형질전환 배지를 일반 ES 배지로 교체합니다.세포 배양 48시간 후, XUL을 통해 Cre 재조합 효소 유전자의 영구적 발현을 검출할 수 있습니다. 양성 $\beta$-gal 표현형을 보이는 염색 세포들은 부위 특이적 재조합에 의해 유전 공학적으로 성공적으로 변형되었음을 나타냅니다. Cre 리포터.세포들은 전매개 재조합 시 Lae 컨스트럭트를 사용하여 CRE를 보유합니다. LoxP 플랭크 스톱 서열이 절단되고, team 프로모터에 의해 luxe 리포터 유전자가 활성화됩니다. 전처리된 리포터 공기 세포의 재조합 효율을 평가하기 위해 세포를 고정해야 합니다.배지를 흡입하고 PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 4% PFA로 세포를 덮고 상온에서 10분 동안 배양합니다. 그 후 PBS로 세포를 다시 세 번 세척합니다. 마지막 세척 단계에서 PBS를 흡입한 후, 웰에 Xal 염색 용액을 첨가하고 인큐베이터 내 37°C에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.다음 날, 파란색 칼라(collar) 세포를 통해 Beal 활성을 모니터링할 수 있습니다. 재조합 효율은 파란색 콜로니의 수로 결정할 수 있습니다. 최적의 조건에서는 90% 이상의 재조합 효율을 달성할 수 있습니다. 지금까지 E. coli로부터 부위 특이적 쿼리 재조합을 발현하고 정제하는 방법을 살펴보았습니다.본 개념 증명 연구에서, 우리는 대부분의 염에서 재조합을 유도할 수 있었습니다. 이것으로 마치겠습니다. 실험에 행운이 따르길 바랍니다.

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