공학 세포 투과 단백질

세포 기능의 조작은 지난 15년 이내에 DNA 형질주입 또는 바이러스 형질주입의 고전적인 접근 방식을 통해 달성할 수 있습니다. 또 다른 방법이 발전했습니다. 단백질 transduction biological active protein은 관심 단백질에 융합된 작은 펩타이드를 사용하여 포유류 세포에 직접 전달될 수 있으며, 이는 세포 흡수를 촉진합니다.

DNA를 사용하지 않기 때문에 무력화의 위험을 방지할 수 있습니다. 위에서 언급한 고전적인 방법과는 대조적입니다. 단백질 형질도입은 적정 방식으로 단백질을 전달할 수 있습니다.

또한, 작은 세포 집단뿐만 아니라 유사분열 후 뉴런과 같은 비분열 세포도 조절될 수 있습니다. 효율적인 방식으로 재조합 단백질을 발현하려면 Paciz 벡터 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 말단 단자와 C 단자 변형으로 구성된 모듈식 벡터 시스템입니다.

두 벡터 모두 정제 수단에 관심 유전자를 쉽게 삽입할 수 있습니다. 히스티딘 태그(histidine tag)와 단백질 transduction domain이 통합되어 있습니다. 우리의 경우, HI 바이러스의 접촉은 세포 분포를 위한 세포 흡수를 촉진합니다.

핵 국소화 신호는 제어 이유로 벡터를 완성하며, 핵융합 태그는 간단히 제거할 수 있습니다. 게다가, 이러한 태그의 배열은 융합 단백질의 특성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 수율과 순도, 판매 가능성 및 생물학적 기능에 미치는 영향은 예측할 수 없습니다.

안녕하세요, 제 이름은 버나드 머스(Bernard Mus)이고 독일 본드에 있는 재건신경생물학 연구소(Institute of Reconstructive Neurobiology)의 줄기세포 공학 그룹에서 일하고 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Christoph P이고 in Hoover Lab의 회원이기도 합니다. 당사의 작업 그룹은 다양한 포유류 세포에 생물학적 활성 단백질을 직접 전달하기 위해 단백질 형질 도입 기술을 집중적으로 활용하고 있으며, 오늘 우리는 대장균 안팎의 발현 및 정제 과정을 안내하고자 합니다.

그 후, 세포 배양에 세포 영구 융합 단백질을 적용하는 방법을 보여드리고자 하며, 이를 통해 전체 절차의 발현, 정제 및 응용을 예시해 드리고자 합니다. 우리는 부위 특이적 재조합 Cree를 사용하여 마우스 오닉 줄기 세포를 유전적으로 변형합니다. 알겠습니다. 시작하자.

하룻밤 배양을 접종하기 위해 섭씨 영하 80도의 글리세롤 스톡에 저장된 이미 변형된 박테리아를 사용합니다. 이 박테리아는 이미 decre recombination을 위한 벡터 인코딩을 포함하고 있습니다. 파이퍼 팁을 사용하여 소량의 박테리아를 파이퍼 팁에 긁어 하룻밤 배양액이 들어있는 비커에 떨어뜨립니다.

하룻밤 배양은 최종 농도 oh 0.5%의 포도당과 ml당 50마이크로그램의 탄산 인슐린이 보충된 LB 배지로 구성됩니다. 그런 다음 비커를 섭씨 37도에서 작동하는 인큐베이터에 넣어 부위 특이적 Recombinate Cree를 발현합니다. 우리는 대규모 발현 문화를 위해 전쟁 전의 결핵 매체를 사용하고 있습니다.

발현 속도를 높이려면 섭씨 37도까지 가열된 TB 배지를 사용하는 것이 좋으며, 이는 재조합 단백질이 발현되는 동안의 온도를 나타냅니다. 다음으로, 최종 농도 oh 0.5%에서 결핵 배지에 포도당을 첨가합니다.포도당은 유도 전 발현 배양이 성장하는 동안 융합 단백질의 기저 발현이 증가하는 것을 방지합니다. 마지막으로, 암피실린을 ml당 100마이크로그램의 최종 농도로 발현 배양액에 첨가하여 decree 단백질에 대한 플라스미드 인코딩을 여전히 보유하고 있는 박테리아만 포함하는 순수 배양을 보장합니다.

이제 우리는 하룻밤 배양을 하고 1:50의 비율로 표현 배양을 접종할 수 있습니다. 그런 다음 비커는 섭씨 37도의 온도에서 작동하는 인큐베이터로 옮겨집니다. Expression 전반에 걸쳐 정기적으로 광학 밀도를 측정하기 위해 샘플을 채취해야 합니다.

배양액이 광학 밀도 1.5에 도달하자마자 박테리아는 최종 농도 oh 0.5 밀리몰의 IPTG로 유도됩니다. 유도 1시간 후, 발현 배양액은 튜브로 옮겨지고 이후 원심분리를 통해 수확됩니다. 이를 위해 SLA 3000 로터를 사용하고 있습니다.

분리기는 5, 4 도 전방에서 10 분 동안 분당 000 라운드의 속도로 작동하고 있습니다. 그런 다음 스내트는 폐기되고 박테리아 펠릿은 섭씨 영하 20도에서 무기한 보관할 수 있습니다. 얼어붙은 펠릿은 1리터의 발현 배양에 해당하는 항소인 lizza buffer에 재현탁됩니다.

우리는 10ml의 lizza 버퍼를 사용하고 용액이 균질해질 때까지 약 15분 동안 기다립니다. 그런 다음 현탁액 1ml당 1mg의 라이소자임을 추가합니다. 효소가 박테리아를 파괴할 수 있도록 용액을 20분 동안 혼합합니다.

그 후, Benson Nase를 1에서 1000까지 희석하여 추가로 15분 동안 첨가하면 DNA가 절단되어 점성이 없는 용액이 됩니다. 마지막으로, 세포의 용해를 보장하기 위해 sonator를 사용합니다. 이 프로그램은 인증 완료 후 45%의 전력으로 1분 30초 동안 실행됩니다.

여기에서 모든 단계, 정제의 미처리 용해물 또는 SDS 페이지 분석의 샘플을 채취하는 것을 잊지 마십시오. 이제 decree 단백질이 글리세롤 스톡 내에서 침전되는 경향이 있으므로 현탁액 ml 당 1ml의 얼음처럼 차가운 TSB 완충액을 추가하는 것이 정말 중요합니다. 이 단계를 건너뛰면 용액이 곧 혼합되고 이제 원심분리할 준비가 된 것입니다.

이를 위해 SS 34 로터를 사용합니다. 분리기는 17, 섭씨 4도에 30 분 동안 000 분당 회전수로 달리고 있다. 작업이 완료되었을 때, Centrifuge Inc는 S 상등액을 새로운 50ml Falcon 튜브에 조심스럽게 옮겼습니다.

이제 상등액 니켈에 니켈 안티 A 슬러리를 첨가하십시오. 안티 A는 히스티딘 기술 융합 단백질의 적절한 정제를 위한 중요한 시약입니다. 히스티딘은 니켈 이온과 복합체를 형성하여 친화성 정제를 가능하게 하고 이제 섭씨 40도에서 60분 동안 주차 튜브를 부드럽게 흔듭니다.

1시간 후, 이제 20ML 컬럼에 현탁액을 적용하고 용액이 중력 흐름에 의해 흐르도록 할 수 있습니다. 대규모 생산의 경우 현탁액을 여러 기둥으로 분할하는 것이 가능합니다. 그런 다음 15밀리몰의 이너솔이 들어 있는 버퍼로 컬럼을 두 번 세척합니다.

적용되는 완충액의 양은 수지 부피에 따라 다릅니다. 니켈 NTA 2mls는 세척 수단용 수지 1ml에 해당합니다. 세척 후 5개의 수지 부피의 세척 버퍼를 컬럼에 넣으면 이제 단백질을 피할 준비가 되었습니다.

따라서 당사는 250밀리몰의 면역 농도를 가진 용리 완충액을 사용합니다. 따라서 수지의 색이 녹색으로 어떻게 변하는지 확인하십시오. CRE 단백질의 농도가 높기 때문에 OID 분획은 때때로 똥이 됩니다.

이를 방지하기 위해 용액을 혼합하고 추가 lys 버퍼를 추가하면 모든 분획이 이제 풀링되어 용해 튜브로 옮겨집니다. 용해는 올레 1차 투석기를 제거하고, 고농도의 염을 함유한 완충액에 대해 단계를 수행한다. 1시간 후, 고염분 완충액을 교환하고 밤새 투석 절차를 적용합니다.

다음 날, 투석 튜브를 고염 완충액에서 꺼내 글리세롤 완충액으로 옮깁니다. 3-5시간 후, 글리세롤 완충액을 교환하고 다시 밤새 투석을 실시합니다. 글리세롤 완충액에 대한 용해는 최소 3배의 농축 원액을 생성합니다.

원액은 이제 활성의 손실 없이 몇 년 동안 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.품질 보증을 위해 수집된 SDS 페이지 샘플을 겔에 로드하고 이후에 염색할 수 있습니다. Kamasi의 경우, Cree 융합 단백질은 OID 분획에서 두드러진 띠로 검출될 수 있습니다. 적절한 농도의 승무원 재조합을 사용하려면 Redford 분석을 통해 농도를 측정해야 합니다.

포유류 세포에 영구적인 단백질을 적용하는 방법. 우선, 최고의 단백질 전달 효율을 달성하기 위해 표적 세포를 준비합니다. 밀도에서 단층 세포를 확인하여 다음 날 80-90%의 합류 세포층을 형성하며, 표적 세포가 조밀한 집락에서 자란 예 세포인 경우

세포를 분리하고 체세포적으로 5시간 전에 단일 세포 현탁액으로 확인합니다. 단백질 형질도입 전에 단일 세포 현탁액을 만드는 것이 중요한데, 그렇지 않으면 군체 표면의 공기 세포만 형질주입될 수 있기 때문입니다. 트리인 치료 전에 미디어를 흡인하고 PPS로 공기 세포를 잠시 관찰하십시오.

혈청이 함유된 잔여 Yes, gross media를 제거합니다. 흡인 후 PPS 오버레이 세포를 뚝뚝 떨어뜨리고 3-5분 동안 배양합니다. 이제 현미경으로 모든 콜로니가 단일 세포로 용해되어 있는지 확인하십시오.

방금 언급한 이유는, 이것이 yes 세포로의 단백질 전달을 위한 중요한 단계이기 때문입니다. 분리된 세포를 튜브로 옮깁니다. 튜브를 테이블에 놓고 원심분리기를 사용하여 셀을 스핀다운하고 슈퍼 에이전트를 흡인하고 셀을 다시 현탁시킵니다.

성장 배지의 P는 세포를 적절한 세포 수로 희석합니다. 물론 그것은 조직 배양의 크기에 달려 있습니다. 접시는 공기 세포를 추가로 5 시간 동안 배양합니다.

이렇게 하면 공기 세포가 바닥에 부착되어 부착될 수 있는 충분한 시간을 얻을 수 있습니다. 3 클래스 행 스톡은 영하 20도에서 2 년 이상 보관할 수 있습니다. 재조합 세포 영구 융합 단백질로 작업할 때 필요에 따라 사용할 수 있는 스톡 솔루션을 갖는 것이 매우 유용합니다.

세포가 접시에 부착될 때까지 기다리는 동안 C 형질 주입 배지를 준비하여 콜레스테롤 재고에서 적절한 양의 세포 영구 크리프 단백질을 자신에게 희석하기만 하면 됩니다. 미디어. Clare 스톡 용액은 아직 멸균되지 않았기 때문에 트랜스 매체는 적용하기 전에 멸균 여과해야 합니다. 로브 단백질 결합 필터에 나사로 고정할 수 있는 주사기를 사용하는 것이 좋습니다.

최종 개울 농도는 세포 유형 또는 배지 보충제에 따라 다릅니다. 예를 들어, 혈청은 형질전환 효율에 강한 부정적인 영향을 미칩니다. 이는 무혈청 매체를 사용하거나 개울 농도를 높임으로써 극복할 수 있습니다.

우리는 최고의 재결합 효율을 가능하게 하는 최적의 조건을 찾습니다. 수화물 농도는 oh 0.5에서 최대 10 마이크로 몰까지 가능합니다. 6시간에서 18시간 사이에 다른 배양 시간을 테스트하는 것이 좋습니다.

5시간의 배양 후 표적 세포를 꺼내 크로스 배지를 흡인합니다. 그 후, 단백질 전달 배지로 교체하고 야간 배양 후 공기 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다. D 세포를 PPS로 간단히 세척하고 단백질 전달 배지를 정상 ES 배지로 변경했습니다.

세포 배양 후 48시간이 지나면 영구 Cree vent 유전자 발현을 xul을 통해 검출할 수 있습니다. 양성 bega 표현형을 가진 염색 세포는 부위 특이적 재조합에 의해 성공적으로 유전적으로 조작되었습니다. 크리어 보고서.

세포는 pre mediad recombination에 CRE 사용 Lae 구조를 품고 있습니다. Lock P 측면 정지 시퀀스를 절제하고 팀 프로모터에 의해 주도되는 고급 리포터 유전자를 활성화합니다. 전처리된 리포터 에어 셀에서 재결합 효율을 평가하려면 에어 셀을 고정해야 합니다.

4%PFA가 포함된 PBS 오버레이 셀로 s 배지 세척 셀을 두 번 흡인하고 실온에서 10분 동안 셀을 배양합니다. 그 후 PBS로 다시 한 번 세포를 세 번 세척합니다. Xal Stain 용액의 마지막 세척 단계에서 PBS를 흡인한 후 웰로 세포를 37도에서 하룻밤 동안 인큐베이터에서 배양합니다.

다음 날에는 블루 칼라 세포에 의해 Beal 활동을 모니터링할 수 있습니다. 재조합 효율은 청색 군체의 수에 의해 결정될 수 있습니다. 최적의 조건에서는 90% 이상의 재조합 효율을 달성할 수 있어야 합니다.좋아, 오늘은 대장균에서 부위별 쿼리 재조합을 표현하고 정제하는 방법을 보여드렸습니다.

이 원리 증명 연구에서 우리는 대부분의 염에서 재결합을 유도할 수 있었습니다. 좋아요, 그게 다입니다. 당신의 실험에 행운을 빕니다.I.