Small Molecule Nematicides 스크리닝 분석: Ditylenchus dipsaci 에 대한 잠재적 선충제를 스크리닝하는 중간 처리량 방법

Ditylenchus dipsaci와 같은 식물 기생 선충류는 미세한 벌레입니다. 살아있는 벌레는 근육 수축을 통해 정현파 운동을 나타내며, 운동성은 배양 조건에서 건강을 결정하는 중요한 요인입니다.

살선충제(화학적 독성 물질)에 노출되면 주요 생물학적 과정을 방해하여 배양된 선충의 이동성에 영향을 미쳐 사망에 이를 수 있습니다.

소분자 살선충제를 스크리닝하려면 증류수 함유 멀티웰 플레이트를 사용합니다. 깨끗한 피닝 도구를 사용하여 잠재적인 소분자 살선충제를 화학 스톡 플레이트에서 분석 플레이트로 옮겨 일관된 양의 분자를 각 웰로 옮깁니다.

플레이트의 각 웰에 동일한 수의 선충류를 분배합니다. 선충의 생존과 이동성을 지원하기 위해 습한 상태를 유지하면서 플레이트를 밀봉합니다. 벌레가 가라앉는 것을 방지하기 위해 플레이트를 가볍게 교반하면서 배양합니다.

배양하는 동안 다양한 독성 소분자가 벌레에게 작용하여 죽이는 반면, 무독성 소분자는 영향을 미치지 않습니다. 해부 현미경으로 플레이트를 관찰하여 운동성이 없는 벌레 개체군이 있는 우물을 식별합니다.

종점 화학 자극제인 수산화나트륨 용액으로 분석 플레이트를 보충합니다. 이것은 쉬고 있는 벌레의 움직임을 촉발하고 죽은 벌레와 구별합니다.

일부 우물에서 수산화나트륨 처리 후 비운동성 벌레의 존재는 살선충제로서 해당 소분자의 효능을 확인합니다.

분석 플레이트를 준비하려면 고압멸균된 증류수를 멸균 트로프에 붓고 트로프에서 40마이크로리터의 증류수를 다중 채널 피펫이 있는 평평한 바닥의 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 96웰 화학 스톡 플레이트의 화학 물질을 화학 플레이트에 세 번 고정하여 분석 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 핀을 분석 플레이트에 10회 옮깁니다. 세척액 앞의 종이에 닦아냅니다.

수집품에서 선충류의 수를 계산하려면 먼저 수집품을 재현탁한 다음 저보유 팁을 사용하여 5마이크로리터의 용액을 슬라이드에 피펫팅합니다. 해부 현미경을 사용하여 5마이크로리터의 선충 수를 계산합니다. 그런 다음 멸균 증류수를 사용하여 마이크로리터당 웜 2마리로 농도를 조정합니다.

다음으로, 다중 채널 피펫과 트로프가 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터의 샘플을 추가합니다. 젖은 종이 타월로 접시를 싸서 상자에 넣습니다. 그런 다음 젖은 종이 타월을 추가하여 플레이트의 움직임을 안정화하고 최소화하고 200rpm으로 설정된 섭씨 20도 쉐이킹 인큐베이터에서 끈적끈적한 패드에 부착합니다.

해부 현미경으로 5일째에 플레이트를 관찰합니다. DMSO 용매 대조군 및 약물 처리 우물에서 이동 및 총 D. dipsaci 수를 계산합니다.

벌레가 움직이지 않는 경우 움직임을 자극하기 위해 최종 농도 40밀리몰의 1몰 수산화나트륨 2마이크로리터를 우물에 첨가합니다. 모바일 웜의 비율을 계산합니다. D. dipsaci 스크리닝에서 재현 가능하게 0% 이동성 웜을 산출한 우물은 강력한 히트로 분류됩니다.