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전기화학발광, ECL, 면역분석을 사용하여 마우스 뇌 용해물에서 특정 단백질을 정량적으로 검출하려면 멀티웰 분석 플레이트로 시작합니다.
우물은 전기 회로를 완성하는 전도성 작동 전극과 상대 전극으로 구성됩니다. 유전체층은 전극을 분리하여 분석 감도를 향상시킵니다.
표적 단백질에 대한 1차 마우스 단클론 항체를 웰에 추가합니다. 더 큰 결합 능력을 가진 작동 전극은 항체가 고정되는 것을 용이
하게 합니다.단백질 함유 용액과 함께 배양하여 웰의 나머지 결합 표면에 결합하여 배경 간섭을 줄입니다.
마우스 뇌 핵 분획 용해물을 첨가하십시오. 용해물의 표적 단백질은 단클론 항체에 특이적으로 결합합니다.
표지되지 않은 다클론 항체를 추가하여 전극의 1차 단클론 항체에 결합된 단백질의 에피토프를 인식하고 결합합니다. 루테늄 복합체로 표지된 특정 2차 항체를 추가하여 표지되지 않은 항체에 결합합니다. 계면활성제를 함유한 적절한 완충액을 첨가하여 적절한 ECL 생성 환경을 제공하며, 트리프로필아민, TPA를 제공합니다.
멀티웰 플레이트를 ECL 검출 시스템에 놓습니다. 전극에 전위를 가하면 항체에 결합된 루테늄 복합체가 산화됩니다. 동시에 TPA는 산화되어 자발적으로 양성자를 잃습니다.
생성된 TPA 라디칼은 산화된 루테늄 복합체를 여기 상태로 환원시킵니다. 루테늄 복합체는 기저 상태로 이완되면 광검출기에 의해 감지된 광자를 방출합니다.
측정된 광도는 용해물의 특정 단백질 농도를 나타냅니다.
냉장고에서 96웰 플레이트를 꺼내 호일을 제거합니다. 항체 코팅 용액을 폐기물 용기에 넣어 웰에서 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 두드려 남은 용액을 제거합니다.
다음으로, 각 웰에 125마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다. 그런 다음 접착 호일로 플레이트를 다시 밀봉합니다. 플레이트를 궤도 마이크로플레이트 셰이커에 놓고 800RPM으로 설정하고 실온에서 90분 동안 배양합니다.
얼음, MeCP2 또는 TAT-MeCP2 단백질 스톡 용액 1바이알, 마우스 뇌 용해물 및 HDF 용해물 1개를 해동합니다. 원고의 표 2에 설명된 대로 깨끗한 튜브에서 단백질 원액을 희석합니다.
다음으로, 용해물 샘플을 희석합니다. 마우스 뇌 용해물의 경우, 용해 완충액 25마이크로리터당 1-20마이크로그램을 사용한다. HDF 용해물의 경우, 용해 완충액 25마이크로리터당 0.25-1마이크로그램을 첨가합니다.
96웰 플레이트를 90분 동안 배양한 후, 폐기물 용기에 넣어 웰에서 차단 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 두드려 남은 용액을 제거합니다. 그런 다음 세척액 150마이크로리터로 플레이트를 3회 세척하고 세척액을 추가하고 즉시 제거합니다.
25마이크로리터의 표준물질과 샘플을 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 800RPM을 일정하게 흔들면서 4시간 더 배양합니다.
표지되지 않은 검출 항체인 다클론 토끼 항-MeCP2를 얼음 위에서 해동합니다. 분석 희석액을 사용하여 항체를 1:6000의 비율로 희석합니다. 96웰 플레이트가 셰이커에서 배양을 마치면 플레이트를 폐기물 용기에 튕겨 표준물질과 샘플을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월에 접시를 두드려 남은 용액을 제거합니다.
세척액을 첨가하여 150마이크로리터의 세척액으로 플레이트를 3회 세척하고 즉시 제거합니다. 다중 채널 피터를 사용하여 각 웰에 25마이크로리터의 표지되지 않은 검출 항체 용액을 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 800RPM에서 일정하게 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
냉장고에서 특정 2차 항체를 채취하여 얼음 위에 올려 놓습니다. 2차 항체를 분석 희석액에 희석하고 부드럽게 혼합합니다.
96웰 플레이트에서 표지되지 않은 유리 검출 항체를 제거하려면 폐기물 용기에 넣은 다음 종이 타월에 플레이트를 두드립니다. 앞서 설명한 대로 플레이트를 3회 세척한 후, 다중 채널 피펫터를 사용하여 각 웰에 25마이크로리터의 2차 항체를 추가합니다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 800RPM에서 일정하게 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
유리 2차 항체를 폐기물 용기에 넣고 종이 타월로 플레이트를 두드려 제거한 다음 앞서 설명한 대로 플레이트를 세 번 세척합니다.
플레이트의 각 웰에 빛 생성을 위한 보조 반응물로 트리프로필아민을 포함하는 계면활성제와 함께 150마이크로리터의 1X 트리스 기반 금 판독 완충액을 추가합니다.
기포 생성을 방지하려면 역방향 피펫팅 기술을 사용하십시오. 전기화학발광 검출 시스템이 있는 마이크로플레이트 플랫폼에 96웰 플레이트를 놓습니다.
내장된 CCD 카메라를 사용하여 즉시 데이터 캡처를 시작합니다. 상대적인 빛 단위에 해당하고 빛의 강도에 정비례하는 신호 수를 기록합니다.
