Name: 면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 배우세요 정량적 면역블로팅과 면역형광 조직학을 활용하여 FFPE 조직 샘플에서 바이오마커 단백질을 정량화하는 방법을. 이 기술은 암 병리학 연구에서 객관적이고 정확한 단백질 수준 평가를 가능하게 합니다.

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이 작품은 프레드릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 (오전)에 의해 부분적으로 투자 되었다.

기본 인간의 조직 샘플을 사용 하 여 승인 보건 복지부 산하 교육 병원 연구 윤리 위원회 (HSREB) 여왕의 대학에서 얻은 했다.
1. 건물 셀 라인 조직 Microarray (TMA)
<ol><li>수확 하 고 세포를 씻어. 참고:이 프로토콜 (예: 헬러, Jurkat, RCH ACV) 다양 한 설립된 불멸 하 게 셀 라인에서 테스트 되었습니다.<ol>
<li>부착 세포, 그들은 약 80 %confluency 도달 약 1.3 x 107 셀을 수확. 셀 라인에 대 한 적절 한 시 약을 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 참고: Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)는 표면 단백질을 저하의 위험을 줄이기 위해 트립 신 이상으로 일반적으로 선호. 트립 신을 사용 하는 경우 셀 수확 직후 소 태아 혈 청 (FBS)를 사용 하 여 트립 신을 중화.</li>
		<li>현 탁 액 셀, 약 8 x 10의7 셀 로그-성장의 단계에서 수확.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브에 225 x g에 5 분 동안 centrifuging 여 수확/분리 된 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>가만히 따르다는 상쾌한 고 다시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) X 1의 10 mL에 펠 릿을 중단. 225 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 가만히 따르다. 참고: 1 X PBS 구성 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4 증류수; pH 7.4에 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포 르 말린에 셀을 해결 하 고 그들을 펠 렛.<ol>
<li>10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF)의 10 ml 원뿔 관 내의 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 참고: NBF 9 ml 1 X PBS의 37% 포름알데히드 재고 솔루션의 1 mL를 희석 하 여 준비 될 수 있습니다. 주의: 포 르 말린 및 포름알데히드 처리 때 주의 사용 합니다. 연기 후드를 사용 하 여 포 르 말린 및 포름알데히드를 포함 하는 단계에 대 한.</li>
		<li>하룻밤 실 온에서 24 rpm (약 17 h) 로커에 셀을 품 어.</li>
		<li>PBS에서 낮은 융 점 agarose의 1% 솔루션 (0.01 g 당 1 mL PBS agarose의)을 준비 합니다.<ol>
<li>충분히 500 µ L 셀 라인 샘플 당 agarose 솔루션의 준비.</li>
			<li>80 ° C 물 목욕 또는 열 블록에서 2-5 분에 대 한 비정 기 혼합과 agarose를 녹. 일단 해산, 경화를 방지 하는 37 ° C 물 목욕 또는 열 블록에서 솔루션을 계속.</li>
		</ol>
</li>
		<li>펠 릿에서 고정된 셀 225 x g.에서 5 분 동안 centrifuging 1.2.2 단계는 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 1 x PBS의 500 µ L에 셀.</li>
		<li>290 x g.는 상쾌한의 모든 Aspirate에 5 분 동안 centrifuging 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 펠 릿으로 셀을 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agarose 셀 캐스팅.<ol>
<li>셀을 포함 하는 각 관 (1.2.3 단계)에서 1 %agarose 솔루션의 ~ 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게, 그러나 빨리, P-1000 micropipette 혼합을 사용 하 여 위아래로 혼합 플라스틱. 참고: 조리개를 확대 하 여 거품을 형성 하지 않도록 피 펫 팁의 끝을 잘라. 경화를 방지 하기 위해 37 ° C 물 목욕에서 작업 agarose 솔루션을 유지.</li>
		<li>실 온에서 (5-10 분)을 강화 하기 위해 agarose 셀 솔루션을 수 있습니다. 각 microcentrifuge에 NBF 튜브 샘플을 포함 하 고 실내 온도에 파라핀 포함 (최대 24 시간)까지 10%의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀 포함 agarose 플러그를 준비 합니다.<ol>
<li>샘플에서 NBF에서 발음.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브, 플라스틱 조직 카세트 플러그를 삽입 하는 면도날을 사용 하 여 셀 플러그를 제거 합니다. 10%에서 카세트 저장 NBF 실내 온도에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플을 처리 하거나 수동으로 하룻밤 또는 자동된 조직 프로세서를 사용 하 여 및 표준 조직학 방법을 사용 하 여 파라핀 왁 스에 포함. 참고: 피셔 외 예제에서는 프로토콜에 대 한 19 .</li>
	<li>특수화를 사용 하 여 "조직 arrayer" 악기, 추수는 파라핀에서 중복 0.6-m m 코어 각 셀 라인에서 차단 하 고, 행에서에 삽입할 셀 라인 TMA를 만들려면 빈 받는 사람 파라핀 블록. 참고: 표준 방법 등 표도르와 3 월20에 설명 된 사용 해야 합니다.</li>
	<li>TMA에 양수 또는 음수 컨트롤로 2-3 추가 조직 유형 (예: 편도 선, 결 장, 고환, 등)을 나타내는 기본 샘플에서 코어를 통합 합니다. 관심사의 단백질에 대 한 적합 한 조직을 선택 합니다.</li>
	<li>조직학의 두 섹션, 약 4 ~ 6 µ m 두께, 셀 라인 TMA 준비 하는 톰을 사용 합니다. 조직학 슬라이드에 섹션을 탑재, 건조, 그리고 deparaffinize (표도르와 3 월20에서 같이).</li>
</ol>2입니다. 면역 형광에 의해 얼룩 샘플
<ol><li>1 차적인 항 체의 희석을 최적화 합니다. 참고: Kajimura 그 외 여러분 에서 같은 FFPE 직물 단면도 IHC 또는 경우의 최적화에 대 한 존재 하는 표준 프로토콜 21. 방법의 간략 한 개요는 여기에 설명 된.<ol>
<li>제조업체의 지침에 의해 유도 하는 관심사의 단백질을 기본 항 체의 4-5 희석을 준비 합니다.</li>
		<li>형태학 상으로 인식할 수 있는 세포 인구에 있는 관심사의 단백질을 표현 하는 동물이 나 인간의 소스에서 제어 조직 형식을 식별 합니다. 조직 섹션을 준비 하 고 표도르와 3 월20에 같은 표준 immunohistochemistry 절차 다음 슬라이드에 탑재. 참고: 필요한 섹션의 수 주 항 체 희석 더하기 하나는 추가의 수가입니다.</li>
		<li>Immunohistology에 대 한 자동 또는 수동 시스템을 사용 하 여 1 차적인 항 체 희석 단계 2.1.2에서에서 슬라이드에 2.1.1 각 단계에서 테스트 합니다. 추가 슬라이드에서 기본 항 체의 응용 프로그램을 생략 하 고 부정적인 제어로 사용.</li>
		<li>착 색 과정에서 모든 슬라이드와 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstain 및 붙일 태그가 이차 항 체로 서 얼룩. HRP (양 고추냉이 과산화 효소)을 사용 하 여 감도 향상이 필요한 경우-활용 된 이차 항 체 및 tyramide 기반 신호 증폭 시스템 (참조 스택 외. 13)입니다. 참고: 기본 항 체를 멀티플렉싱 때 다른 형광 라벨 각 단백질에 대 한 사용 됩니다.</li>
		<li>사용 된 fluorophores에 적절 한 구동 및 검출 파장을 사용 하 여 디지털 이미지 파일을 생성할 수 있는 적절 한 악기를 사용 하 여 immunostained 슬라이드를 검사 합니다.</li>
		<li>적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 디지털 이미지를 볼 하 고 경험적으로 선택 배경 형광 상대적 신호 강도 최적화 하는 1 차적인 항 체 희석. 참고: 원하는 경우,이 최적화 발생할 수 있습니다는 HRP 활용 된 이차 항 체, 3, diaminobenzidine (DAB)-3'와 명시 야 현미경을 사용 하 여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 라인 TMA에 얼룩 경우 수행 합니다.<ol>
<li>Immunohistology에 대 한 자동 또는 수동 시스템을 사용 하 여 최적화 된 기본 항 체 희석 (으로 단계 2.1에서에서 결정)으로 셀 라인 TMA의 슬라이드를 얼룩. 두 번째 슬라이드에서 기본 항 체의 응용 프로그램을 생략 하 고 부정적인 제어로 사용.</li>
		<li>착 색 과정에서 모든 슬라이드 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstain로와 이차 항 체 및 tyramide 단계 2.1.4로 얼룩.</li>
		<li>사용 된 fluorophores에 적절 한 구동 및 검출 파장을 사용 하 여 디지털 이미지 파일을 생성할 수 있는 적절 한 악기를 사용 하 여 immunostained 슬라이드를 검사 합니다.</li>
		<li>이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 (즉, 세포질 및 핵)의 세포질 구획을 식별 하 고 각 셀 라인에 대 한 평균 형광 강도 (MFI) 계량. 참고:이 목적을 위해 다양 한 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다 그리고 많은 스택 외. 에서 설명 13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 양적 Immunoblotting 셀 라인의
<ol><li>셀의 lysates 준비.<ol>
<li>1.1.1에서 1.1.3 단계에 설명 된 대로 각 셀 라인의 2 백만 세포를 수확.</li>
		<li>50 mL 원뿔 튜브에 650 x g에 5 분에 대 한 셀 아래로 회전 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL로 세포 세척. 1 ml의 얼음 처럼 차가운 PBS와 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 resuspend. 단계 3.1.2에 의하여 centrifuge, 가만히 따르다, 그리고 얼음 세포를 떠나.</li>
		<li>셀, 프로 테아 제 억제제 (RIPA 세포의 용 해 버퍼의 mL 당 100 X 억제제의 10 µ L)와 찬 radioimmunoprecipitation (RIPA) 세포의 용 해 버퍼의 약 200 µ L를 추가 소용돌이 15 분 동안 얼음에 품 어. 참고: 효과적인 세포에 필요한 세포의 용 해 버퍼의 양을 셀 선으로 변화 하 고 실험적으로 결정 될 수 있다. RIPA 버퍼는 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1.0 %NP-40, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 0.1 %SDS 증류수에 구성 됩니다.</li>
		<li>상대적으로 심지어는 immunoblots에 로드 되도록 각 lysate 메서드를 사용 하는 적절 한 Bradford 분석 실험 등에서 20 µ L 샘플에서 총 단백질 계량. 각 세포 lysate의 나머지 (약 180 µ L) 6 X Laemmli 세포의 용 해 버퍼의 약 40 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 열 블록 또는 물 욕조에 100 ° C에서 비등. 참고: 6 X Laemmli 버퍼 300 mM Tris HCl (pH 6.8), 4% (w/v) SDS, 60% 글리세롤, 블루, 0.6% (w/v) bromophenol의 구성에 50 m m dithiothreitol (DTT) 증류수.</li>
		<li>2 주 동안-20 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>모든 셀 라인 셀 줄은 관심의 가장 풍부한 단백질 결정의 immunoblot을 수행 합니다. 참고: 마흐무드, T. 및 양, PC에 설명 된 절차를 따릅니다. 22, 다음 수정입니다.<ol>
<li>약 수 microcentrifuge 튜브 lysate (에서 준비 단계 3.1) 포함 10-50 µ g (관심사의 단백질 풍부)에 따라 단백질의 세포. 6 X Laemmli 버퍼 및 15 µ L까지 볼륨에 충분 한 RIPA 세포의 용 해 버퍼의 2.5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>스태킹 5% 고 해결 (예, 15-100 kDa 사이의 단백질에 대 한 10%)는 적절 한 농도 로드 단백질 사다리와 단계 3.2.1에서에서 샘플 SDS 페이지 젤. 빈 우물에 1 X Laemmli 버퍼를 로드 합니다. 적절 한 설정, 일반적으로 125 V, 80 분 또는 bromophenol 파랑 염료에 접시의 바닥을 도달할 때까지 전원 공급 장치를 실행 합니다.</li>
		<li>Wiedemann 외 에 설명 된 대로 세미 드라이 단백질 전송을 수행합니다 23. 참고: 결과 위해 대표, 니트로 막 (이 메탄올에 배어 있이 필요 하지 않습니다), 찬 Bjerrum Schafer 닐슨 (BSN) 전송 버퍼 사용 했다. BSN 버퍼 48 mM Tris, 39mm 글리신, 증류수에 20% 메탄올 구성 됩니다.</li>
		<li>전송 후 가로로 GAPDH 같은 적절 한 내부 통제 단백질에서 관심사의 단백질을 포함 하는 부분을 분리 하는 막 잘라 면도날을 사용 합니다.</li>
		<li>주 항 체의 제조 업체에서 권장 하는 블로킹 버퍼를 사용 하 여 차단 하 고 항 체 외피를 진행 합니다. 참고: 최적의 기본 항 체 희석 단백질 풍부 및 감도 따라 크게 달라질 수 있습니다. 아래의 대표 결과 대 한 관심사의 단백질에 항 체 GAPDH 컨트롤 필수 1:40,000 희석 1:1,000 희석이 필요 합니다. 사용 하는 이차 항 체의 희석 1:3, 000 이었다.</li>
		<li>항 체 외피 막의 세척 후에, 샌드위치 가방 같은 투명 한 플라스틱 칼 집에서 막 스트립을 놓습니다.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 enchanced 화학 (ECL) 혼합물을 준비 합니다. P-1000 피 펫을 사용 하 여을 ECL 혼합 막 커버, 칼 집, 1-2 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 혼합 된 멤브레인 스트립을 품 어.</li>
		<li>디지털 이미징 플랫폼에 막 칼을 놓습니다. 화학 및 색도계 마커 검출에 사용 하 여 캡처하는 막의 다양 한 노출. 참고: 노출 시간 로드 단백질의 금액에 따라 달라 집니다, 그리고 대상 단백질의 풍부, 항 체 친 화력 등 몇 초 단위로 자동 노출 (일반적으로 몇 초), 및 테스트 노출 시간 위와 아래 시작.</li>
		<li>경험적으로, 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 가장 대상 단백질을 표현 하는 셀 줄 결정 또는.</li>
	</ol></li>
	<li>직렬 희석을 사용 하 여 각 1 차 항 체의 선형 동적 범위를 찾아.<ol>
<li>수행 단계 3.2.1-3.2.8 (단계 3.2.9에서에서 확인) 대상 단백질의 높은 농도 표현 하는 셀 라인에서 직렬 희석의 시리즈를 사용 하 여.</li>
		<li>ImageJ 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 노출 이미지에 densitometry 수행.<ol>
<li>예를 들어 ImageJ를 사용 하 여 사각형 선택 도구를 사용 선택할 계량 하 젤의 첫 번째 레인. 이동 분석 | 젤 | 첫 번째 차선을 선택. 마우스를 사용 하 여 다음 차선에 결과 사각형 위로 이동. 이동 분석 | 젤 | 다음 차선을 선택. 반복적으로 다음 차선에는 사각형을 이동 하 고 레인의 나머지 부분에 대 한 차선을 선택 합니다.</li>
			<li>이동 분석 | 젤 | 플롯 레인. 직선 도구를 사용 하 여 배경 소음을 제거 하려면 각 피크의 기지를 통해 라인을 그릴. 자동 선택 도구 사용 하 여 각 피크를 선택 하 고 이제부터 라고도 밴드 강도, 결과 창에서 각 피크의 밀도 수집 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Densitometry 만들려고 scatterplot는 밴드 강도 대 의 총 단백질의 양을 각 1 차 항 체에 대 한 로드 출력을 사용 합니다. 최적 및 육안 검사의 라인을 사용 하 여 각 항 체의 선형 동적 범위의 위치 (강도 범위)을 결정 합니다.</li>
		<li>모든 셀 라인으로 앞으로 이동 하는 농도 되도록 선형 범위의 높은 끝에 값을 생성 하는 단백질 농도 선택 합니다. 참고:이 농도이 단백질의 가장 큰 금액으로 셀 라인에서 채도 수준 때문에, 거기 이상 되어야 합니다의 위험 노출 다른 셀 라인에 대 한 밴드.</li>
	</ol></li>
	<li>immunoblot 단계 3.3.4 모든 셀 라인에서에서 선택 단백질 농도 사용 하 여 수행 하 고 단계 3.2.1-3.2.8를 반복 합니다.<ol>
<li>3.3.2 단계에서 디지털 스캔 densitometry를 수행 합니다. 3.3.3 단계에서 식별 된 각 항 체에 대 한 선형 범위 내에서 신호를 생성 하는 노출 이미지를 선택 합니다.</li>
		<li>3.4.1에서 이상적인 노출에서 밴드 강도 신호를 사용 하 여 각 셀 라인에 대 한 컨트롤 밴드 강도 로드 하는 대상 단백질 밴드 강렬의 비율을 계산 합니다. 이 비율 값은 관심의 대상 단백질의 관계 되는 풍부를 나타냅니다.</li>
		<li>피어슨 상관 관계 테스트 수행 (할 수 있는 통계 소프트웨어 패키지를 사용 하 여) immunoblotting (3.4.2 단계)에서 얻은 그 단계의 경우 얼룩 (2.2) 이미지 분석에서 얻은 값을 연결할.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>The Human Protein Atlas BCL2. , 
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<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).</li>
<li>Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).</li>
<li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+%26+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13(2008).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

메서드를 설명 하는 우리가 사용 하는 양적 immunoblotting (IB)의 면역 형광 검사 (면)의 유틸리티를 보여 FFPE 조직 샘플에서 대상 단백질의 관계 되는 풍부를 ascertaining에 대 한. 현재 단백질 정량화 방법 비 IHC2,3, 등 그들의 명백한 자연 또는 균질 샘플, 샘플 구조와 세포 인구에 대 한 조사와 같은 방지 하는 필요에 의해 제한 됩니다. IB 및 질량 분석8,9,,1011. 양이 많은 경우 메서드는 유효성을 검사 하 고 신중 하 게 적용 하는 경우 이러한 한계를 초월 수 있습니다. 불멸 하 게 세포의 양적 iIF IF 정보를 비교 하 여 반 정량적 성격의 경우 ...

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) 조직 생 검 견본에 있는 단백질을 정할 필요가 많은 임상 분야에 존재 합니다. 예를 들어 일상적인 생 검 표본에서 바이오 마커 단백질의 정량화는 암 환자1에 대 한 치료 예 후를 명료 하 사용 됩니다. 그러나, 현재 메서드는 일반적으로 주관적 및 유효성 검사 부족.
Immunohistochemistry (IHC) 병 리 실험실에서 일상적으로 사용 되 고 일반적으로 1 차적인 항 체 대상 단백질에 지시 및 양 고추냉이 과산화 효소2등 효소 상표로 활용 된 이차 항 체에 따라 달라 집니다. 기존의 IHC 구분, 만들 수 있습니다 사용 분의 샘플링 하 고 그로 인하여 그것의 관련 조직학 컨텍스트 내에서 단백질 식의 평가 허용 하는 조직 샘플의 형태학 무결성을 보존 한다. 그러나, IHC에 의해 생성 된 비 신호 빼기 때문에, 그것은 상대적으로 좁은 동적 범위에서 겪고 있다 고 멀티플렉싱2,,34에 대 한 제한 된 잠재력을 제공. 매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석기 (MALDI-MSI) 이미징 형태학의 무결성을 유지 합니다. 그러나,이 개발 기술 겸손 형태학 해상도와 연결 하며 중요 한 보정 및 정규화, 일상 임상 사용5,,67에 대 한 그것의 타당성을 방해. 단백질 조직 샘플에서 계량을 대체 기술을 포함 immunoblotting8,11, 질량 분석의9,10,및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)12, 각 이 무 균으로 시작의 샘플 조직의 lysate. 기본 조직 샘플은 다른 유형의 다양 한 세포 유형 포함. 따라서, 조직 샘플 수반 기법 암 세포 같은 관심의 특정 세포 인구에서 단백질의 정량화를 허용 하지 않습니다.
IHC, 만약에 작은 적용 됩니다 처럼 FFPE 샘플링 하 고 조직학 무결성13의 보존 합니다. 그러나, 덕분에 형광 신호, 첨가제 자연 경우 의무가 여러 기본 항 체와 형광 라벨의 응용 프로그램입니다. 따라서, 관심사의 단백질 특정 셀 또는 세포질 구획 (예를 들어 핵 및 세포질) 다른 항 체를 사용 하 여 정의 내에서 상대적으로 측정할 수 있습니다. 형광 신호는 또한 더 큰 동적 범위13,14의 이점을. 우수성, 재현성, 및의 멀티플렉싱 잠재력 FFPE 샘플에 적용 하는 경우 시연된13,,1415되었습니다.
여기 우리 골드 표준으로 설립된 셀 라인을 사용 하 여 만약에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정에서 컴퓨터 기반 이미지 분석의 양적 성격을 확인 하는 양적 immunoblotting의 사용 설명 FFPE 조직 샘플에서 조직학 섹션입니다. 우리는 성공적으로 임상 생 샘플16,,1718바이오 마커 단백질을 계량 하는 다중 접근에서이 메서드를 적용 했습니다.

<table><tbody><tr><td>697</td><td>DSMZ</td><td>ACC 42</td><td>세포주</td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>세포주</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>세포주</td></tr><tr><td>RCH-ACV</td><td>DSMZ</td><td>ACC 548</td><td>세포주</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ</td><td>ACC 342</td><td>세포주</td></tr><tr><td>REH</td><td>DSMZ</td><td>ACC 22</td><td>세포주</td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>세포주</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>세포주</td></tr><tr><td>트립신/EDTA 용액</td><td>Invitrogen</td><td>R001100</td><td>접착 세포 분리용</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Wisent Inc.</td><td>81150</td><td>트립신 중</td></tr><tr><td>화 Neutral Buffered Formalin</td><td>프로토콜</td><td>245-684</td><td>세포 펠릿 UltraPure</td></tr><tr><td>저 융점 아가로스</td><td>고정용 Invitrogen</td><td>15517-022</td><td>세포 펠릿 주조용</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항인간 Bcl-2 항체, 클론 124</td><td>Dako (Agilent)</td><td>cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td><td>면역불련 및 면역블롯으로 Bcl-2를 검출하기 위해 (lot#:&nbsp; 00095786</td></tr><tr><td>Ventana Discovery XT</td><td>Roche</td><td>-</td><td>면역형광 염색 자동화용</td></tr><tr><td>EnVision+ 시스템- HRP 표지 폴리머(안티-마우스)</td><td>Dako(애질런트)</td><td>K4000</td><td>면역형광 신호 증폭용</td></tr><tr><td>EnVision+ 시스템-HRP 표지 폴리머(안티-토끼)</td><td>Dako(애질런트)</td><td>K4002</td><td>면역형광 신호 증폭용</td></tr><tr><td>시아닌 5 티라미드 시약</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL745001KT</td><td>면역 형광 신호 증폭</td></tr><tr><td>Aperio ImageScope</td><td>Leica Biosystems</td><td>-</td><td>스캔 된 슬라이드를 보려면</td></tr><tr><td>HALO 이미지 분석 소프트웨어</td><td>Indica Labs</td><td>-</td>면역 형광 단백질 분해 효소 억제제<td>의 정량화</td></tr><tr><td>(Halt 단백질 분해 효소 억제제 칵테일, 100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td>추가하려면 RIPA 완충</td></tr>액 <tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>BioShop</td><td>EDT001</td><td>RIPA 완충액</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>BDH Limited</td>용 <td>56009</td><td>RIPA 완충액용</td></tr><tr><td>데옥시콜레이트</td>나트륨 <td>시그마-알드리치</td><td>D6750</td><td>RIPA 완충액용</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>FisherBiotech</td><td>BP229</td><td>Laemlli 완충액</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>BioShop</td><td>BRO777</td><td>Laemlli 완충액</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>Laemlli 완충</td></tr>액 <tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB001</td><td>면역 블롯 세척 단백질</td></tr><tr><td>사다리 (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td>단백질 젤 여과</td></tr><tr><td>지 (매우 두꺼운 오점지)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703969</td><td>블로팅 용 </td></tr><tr><td>전사 니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td>블로팅 전사</td></tr>용 <tr><td>Trans-blot SD 반건조 전사 셀</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>반건조 전사용</td></tr><tr><td>탈지 분유(무지방 분유)</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>9999S</td><td>차단 완충액용</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>세척 완충액용</td></tr><tr><td>GAPDH rabbit 단클론 항체</td><td>Epitomics</td><td>2251-1</td><td>1차 항체 조절 단백질(lot#: YE101901C)</td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG(HRP 접합) 항체</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td><td>면역블롯</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG(HRP conjugated) 항체</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td><td>면역블롯에 대한 2차 항체(lot#: GR3192725-5)</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 기판</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>면역블롯 신호 감지용</td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29083461</td><td>면역블롯 신호 감지용</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>프리웨어, NIH</td><td>-</td><td>밀도 분석용</td></tr></tbody></table>

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 immunoblotting

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질의 정량화는 임상에서 중요 한 응용 프로그램을 연구 하는 고. 정량화 하는 최적의 방법 정확 하 고 광범위 한 선형 동적 범위를가지고 개별 세포 유형의 식별 수 있도록 샘플의 구조적 무결성을 유지 합니다. Immunohistochemistry (IHC), 질량 분석 등 immunoblotting 현재 방법 각 그들의 범주 특성상 이러한 규정에 맞게 실패 또는 샘플을 균질 필요가 있다. 대체 방법으로 우리는 면역 형광 검사 (IF) 및 FFPE 조직에 관심사의 단백질의 관계 되는 풍부를 결정 하기 위해 이미지 분석의 사용을 제안 합니다. 여기이 방법은 쉽게 최적화 된 넓은 동적 범위를 산출 및 선형 양적 immunoblotting의 황금 표준에 비해 정량은 설명 합니다. 또한,이 메서드는 샘플의 구조적 무결성의 유지 관리를 허용 하 고 진단 응용 프로그램에 중요 한 있을 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구별 허용 합니다. 전반적으로,이 FFPE 샘플에 있는 단백질의 상대적 정량화에 대 한 강력한 방법 이며 임상 적응 하거나 요구를 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜 FFPE 직물 구획으로 만든 셀 라인에서 안티-apoptotic 단백질 Bcl-2의 상대 수량을 결정 하는 경우의 기능 확인을 위해 사용 되었다. 암 세포에 선택적으로 측정 Bcl-2 종양 메커니즘을 명료 하 게 수 고 병 적인 진단 및 임상 관리 결정24알리는에서 유용할 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, Bcl-2 적절 한 B-lymphocyte 개발에 역할 그리고의 식은 일반적으로 림프 종25,,2627의 맥락에서 조사. 그림 1 프로토콜에 관련 된 단계를 설명합니다. 초기 면 최적화 단계에서 기본 안티-Bcl-2 항 체의 다양 한 희석 단계 2.1에에서 설명 된 대로 자동된 immunohist...

포 르 말린 조정의 파라핀 끼워 넣어진 조직 샘플 (FFPE)에 관심사의 단백질을 측정 하는 수단으로 이미지 분석와 결합 하 여 면역 형광 조직학 유효성을 양적 immunoblotting 사용 하 여를 설명 합니다. 우리의 결과 일상적인 생 검 견본에 있는 바이오 마커 단백질의 상대적 수량을 ascertaining에 대 한 면역 형광 조직학의 유틸리티를 보여 줍니다.

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

이 방법은 일상적으로 처리된 생검 물질에서 바이오마커 단백질을 정량화함으로써 암 병리학 분야에서 중요한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 종래의 면역히토케와 관련하여 이 기술의 주요 장점은 객관적이고, 넓은 동적 범위를 가지며, 특정 세포 유형에서 단백질의 정량화를 허용한다는 것이다. 특정 소위 바이오마커 단백질의 존재 또는 부재, 또는 특히, 암 생검 표본에 있는 그 단백질의 상대적인 풍부는 암의 특정 종류의 특정 병리 진단을 만드는 데 매우 유용할 수 있습니다.그러나 그것은 또한 암 처리에 반응을 예측에 유용할 수 있습니다, 그래서 이 기술은 암을 가진 환자의 진단 그리고 처리 둘 다 관련있는 이유입니다. 이 프로토콜은 주로 면역 형광 기반 분석의 정량적 특성을 검증하기 위해 불멸의 세포주에서 단백질 정량화를 사용하는 방법에 관한 것입니다. 그러나 면역 형광이 쉽게 멀티플렉스 접근 방식에 통합되고 1 차생검 샘플에 적용 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.이 절차를 지원하고 시연하는 것은 기술자인 리 부드로와 운영 책임자인 셰이켈 버크(Shakeel Virk)가 될 것입니다. 분자 병리학을 위한 여왕의 실험실에서 둘 다. 시작하려면, 원심 분리는 5 분 동안 225 Gs에서 50 밀리리터 원추형 튜브에서 이전에 수확 된 세포를 원심 분리합니다.슈퍼 나탄을 데칭하고, PBS의 10 밀리리터에서 세포 펠릿을 재중단. 그런 다음, 5 분 동안 225 Gs에서 다시 중단 된 세포를 원심 분리합니다. 10%NBF의 10 밀리리터로 세포 펠릿을 중단하십시오.그런 다음 하룻밤 동안 24 개의 RM에서 로커의 실온에서 세포를 배양합니다. 세포를 고정한 후, 세포를 225 Gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상체를 제거하고 PBS의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다.세포를 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리를 통해 세포를 펠릿한다. 그런 다음, 슈퍼 나티를 흡인. 세포를 포함하는 각 관에 1%아가로즈 용액의 약 500마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 혼합물을 위아래로 피펫하여 혼합합니다. 아가로즈 세포 용액이 경화된 후 튜브에 10%NBF의 1밀리리터를 추가합니다. 나중에 샘플에서 NBF를 제거합니다.면도날을 사용하여 셀 플러그를 제거하고 플러그를 플라스틱 조직 카세트에 넣습니다. 자동화된 조직 프로세서로 밤새 샘플을 처리합니다. 그런 다음 표준 조직학 방법을 사용하여 파라핀 왁스에 샘플을 포함시킴을 포함시킴이에 포함시킴이 에 포함시킴이 에 포함됩니다.티슈 어레이 기악기를 사용하여 파라핀 블록에서 6mm 코어를 복제하여 빈 파라핀 블록에 삽입합니다. 그 후, 마이크로토메를 사용하여 새로 생성된 세포주 TMA의 두 가지 조직학적 섹션을 준비합니다. 그런 다음 연수 슬라이드에 섹션을 장착하고 분리합니다.첫째, 셀라인 TMA의 두 슬라이드를 자동화된 염색 시스템에 로드합니다. 최적의 1차 항체 희석을 가진 한쪽에 얼룩을 남기고, 다른 한쪽은 음수 대조군 슬라이드로 남게 한다. 두 슬라이드에 핵 카운터스테인 및 이차 항체를 적용하십시오.염색 공정 후 티라미드 신호 증폭 시약을 추가합니다. 그 후, 사용된 형광에 대한 적절한 흥분 및 검출 파장을 사용하여 면역스테인드 슬라이드를 스캔한다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 핵 또는 세포질 여부에 관계없이 관심있는 셀룰러 구획을 식별하고 각 라인에 대한 평균 형광 강도 또는 MFI를 정량화합니다.대상 단백질의 가장 큰 풍부를 가지고 있는 세포주가 있는지 를 결정하기 위해, aliquot는 귀중한 준비된 세포가 미세 원심분리기 튜브로 lysate합니다. 그런 다음 6배 의 2.5 마이크로리터를 추가하고 충분한 RIPA 용해 버퍼를 추가하여 총 부피를 15 마이크로리터로 가져옵니다. 다음으로, 단백질 사다리와 SDS 페이지 젤을 적재하고 이전에 준비된 샘플을 로드합니다.이 후, 빈 우물에 완충하로드. 파란색 염료가 접시 바닥에 도달할 때까지 젤을 실행합니다. 반건조 단백질 전달을 수행한 후 면도날을 사용하여 멤브레인을 수평으로 절단하여 관심 있는 단백질과 관심 있는 단백질을 대조단백질과 분리합니다.제조 업체지침에 따라 차단 및 항체 배양을 수행합니다. 그런 다음 멤브레인 스트립을 투명 한 비닐 봉지에 넣습니다. P1000 파이펫을 사용하여 ECL 혼합물로 멤브레인을 덮습니다.그런 다음 가방을 밀봉하고 어둠 속에서 실온에서 멤브레인을 1 ~ 2 분 동안 배양합니다. 다음으로 멤브레인이 들어 있는 비닐 봉지를 디지털 이미징 플랫폼에 배치합니다. 화학 발광 및 색마커 검출을 사용하여 멤브레인의 다양한 노출을 캡처합니다.이미지 분석 소프트웨어 또는 시각적 관찰을 사용하여 가장 타겟 단백질을 표현하는 세포주가 결정됩니다. 이 셀라인의 직렬 희석을 면역한 후 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 노출 이미지를 엽니다. 직사각형 선택 도구를 사용하여 젤의 첫 번째 차선을 선택합니다.그런 다음 분석, 젤 및 첫 번째 차선을 선택하십시오. 직사각형 선택 도구를 다음 차선으로 이동하여 이 프로세스를 반복하고 분석, 젤 및 다음 차선을 선택합니다. 다음으로, 분석, 젤 및 플롯 레인으로 이동합니다.직선 도구를 사용하여 각 피크의 베이스를 가로질러 선을 그려 배경 노이즈를 제거합니다. 그런 다음 지팡이 도구를 사용하여 각 피크를 선택하고 결과 창에서 각 피크의 대역 강도를 가져옵니다. 밀도 측정 출력을 사용하여 각 1차 항체에 대해 로드된 총 단백질의 양에 비해 밴드 강도의 산란플롯을 만듭니다.그런 다음, 각 항체의 선형 동적 범위의 위치를 결정하기 위해 가장 적합하고 시각적 관찰의 라인을 사용합니다. 선형 범위 내에서 대역 강도를 산출하는 단백질 농도를 선택하고, 이전에 설명한 바와 같이, 그 단백질 농도로 모든 세포주의 면역blot를 수행한다. 다음으로, 디지털 스캔에서 밀도를 수행하여 각 항체에 대해 이전에 확인된 선형 범위 내에서 신호를 산출하는 노출을 선택합니다.그 후, 각 세포주에 대한 제어 대역 강도를 적재하는 표적 단백질 대역 강도의 비율을 계산한다. 마지막으로 통계 소프트웨어를 사용하여 IF 염색의 이미지 분석에서 얻은 값과 면역 블로팅에서 얻은 값 간의 Pearson 상관 관계 테스트를 수행합니다. 이 프로토콜은 항 세포 단백질 Bcl-2의 상대적 양을 결정하는 IF의 능력을 확인하기 위해 사용되었다.1 차적인 항체의 변화하는 희석은 면역 조직학 얼룩을 가진 인간 편도선 조직에 시험되었다. 이 실험의 경우 1~50개의 희석이 배경 잡음이 거의 없는 강력한 신호를 산출한 최적의 희석으로 결정되었습니다. 이러한 희석은 면역형광에 의해 세포주 TMA를 염색하는 데 사용되었고, 영상 분석은 Bcl-2에 기인하는 세포질 Cy5 신호를 정량화하기 위해 사용되었다.모든 테스트 된 세포주를 위한 면역 블롯을 기반으로, 그랜타-519Bcl-2의 가장 큰 풍부했다. 그란타-519 용액의 직렬 희석의 면역블롯은 Bcl-2의 선형 동적 범위를 찾아단백질 GAPDH를 조절하는 데 사용되었다. 이 분석기에서 Bcl-2의 다이나믹 레인지는 거의 0의 밴드 강도에서 7500 단위에 이르기까지 다양했습니다.GAPDH의 다이나믹 범위는 3000대에서 6500대까지 다양했다. 면역블롯은 선형 범위 내에서 노출과 함께 반복되었다. 그리고 Bcl-2 대 GAPDH의 비율은 각 세포주에 대해 계산되었다.Pearson 상관 관계 테스트는 면역 blotting의 강도 비율이 양적 IF의 강도 측정과 강하게 긍정적으로 상관관계가 있음을 입증했습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 모든 밴드가 각각의 선형 범위 내에 있는 최적의 노출을 찾기 위해 여러 시간 지점에 대한 최종 멤브레인을 노출하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. IF 프로토콜의 정량적 특성을 검증한 후, 표적 단백질이 발현되는 곳과 같은 임상 질문에 답하기 위해 일상적으로 처리된 조직 샘플에서 멀티플렉스 IF를 위해 수정될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 샘플에서 표적 단백질 발현을 정량화하기 위한 전체 단백질 정규화 기반 웨스턴 블로팅 기술을 보여줍니다. 샘플의 총 단백질 염색을 활용하여 비율계량 분석을 수행하여 표적 단백질의 상대적 발현 수준을 결정합니다.

단백질 발현 수준을 추정하기 위한 정량적 웨스턴 블로팅(Quantitative Western Blotting)

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정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

형광을 이용한 웨스턴 블로팅(western blotting)의 발전으로 단백질 발현의 미묘한 변화를 감지할 수 있게 되어 정량 분석이 가능해졌습니다. 여기에서는 다양한 종과 조직 유형에 걸쳐 다양한 단백질을 검출하기 위한 강력한 방법론에 대해 설명합니다. 일반적인 기술 문제를 극복하기 위한 전략도 제공됩니다.

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

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