높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

이 방법의 전반적인 목표는 뇌척수액(CSF)에서 여러 바이오마커를 빠르고 저렴하게 정량화하여 진단 및 치료 모니터링에 대한 사용을 평가하는 것입니다. 이것은 이전에 측정할 수 없었던 바이오마커를 측정할 수 있는 새로운 분석법입니다. 그리고 우리는 이것이 진단 목적으로 사용될 수 있고 다양한 신경 퇴행성 질환을 구별하고 잠재적으로 예후 정보를 제공하는 데 사용될 수 있다고 생각합니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 시료 전처리가 빠르고 간단하며 매우 특이적이며 임상 실험실로 번역할 수 있도록 비용 효율적으로 설계되었다는 것입니다. 이 기술의 의미는 치료 또는 진단으로 확장되며, 이 고처리량 검사는 신경 퇴행의 새로운 치료법을 위한 향후 임상 시험에서 사용될 수 있습니다. 이 방법론은 신장 질환을 위한 소변, 심근병증을 위한 혈장, 다능성을 위한 세포와 같은 다른 질병 및 조직에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 제조업체의 지침에 따라 원하는 합성 펩타이드를 밀리리터당 1밀리그램의 스톡 농도로 재현탁시킵니다. 스톡 농도에서 펩타이드 1/10 희석액을 준비하고 각 펩타이드 1,000피코몰을 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 풀링합니다. 풀링된 펩타이드 샘플을 SpeedVac 농축기에서 건조시킵니다.

완료되면 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 다음으로, 100마이크로리터의 CSF를 결합이 낮은 마이크로 원심분리기 튜브로 분취합니다. CSF 샘플을 동결 건조합니다.

풀링된 펩타이드 샘플의 부분 표본을 분해 완충액에 재현탁하여 10의 농도와 마이크로리터당 1피코몰을 얻습니다. 이제 풀링된 펩타이드 샘플을 0, 1, 2, 5, 10 및 15 피코몰라 농도로 동결 건조된 100마이크로리터 CSF 분취액에 스파이크합니다. 그런 다음 20나노그램의 온전한 무관련 단백질을 첨가하여 트립신의 소화 효율을 위한 내부 표준물질 및 제어 역할을 합니다.

CSF 분취액에 분해 버퍼를 20마이크로리터의 최종 부피로 추가하고 샘플을 와류로 가열합니다. 그런 다음 1.5마이크로리터의 디티오트레이톨을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 진탕하여 표준 프로토콜에 따라 샘플을 분해합니다. 그런 다음 샘플에 3마이크로리터의 요오드아세트아미드를 넣고 어두운 곳에서 45분 동안 실온에서 흔듭니다.

그런 다음 이중 증류수 165마이크로리터를 추가합니다. 10마이크로리터의 0.1마이크로그램/마이크로리터, 염기서열분석 등급의 변형된 트립신 용액을 50밀리몰의 중탄산암모늄 완충액에 재현탁액으로 샘플에 추가합니다. 샘플을 섭씨 37도의 수조에서 밤새 배양합니다.

그런 다음 샘플을 동결하여 분해를 중지하십시오. CSF를 얼음에 해동한 후 16, 000회 g에서 10분 동안 원심분리한다. 완료되면 60 마이크로 리터의 각 다이제스트를 300 마이크로 리터 유리 인서트 베일로 옮깁니다.

C18 UPLC 컬럼이 장착된 LC-MS 시스템을 사용하여 10분 동안 1-40%의 아세토니트릴 선형 그래디언트를 사용하여 표준 곡선 지점에서 가장 높은 농도를 주입합니다. 실행이 완료되면 소프트웨어에서 결과 크로마토그램을 열고 머무름 시간과 펩타이드당 가장 강렬한 두 가지 전이를 기록합니다. 이 정보를 기반으로 이전에 생성된 다중 반응 모니터링 또는 MRM 분석법을 시간 지정 채널로 업데이트하여 펩타이드를 측정합니다.

감도를 유지하려면 각 채널을 8보다 큰 피크당 포인트로 유지하고 각 펩타이드에 대해 하나 이상의 전이에 대해 0.01초보다 큰 체류 시간을 유지하십시오. MS 분석법 파일의 분석법 이벤트에서 용매 지연을 선택하여 MRM 분석법(Method)에 용매 지연을 포함합니다. 짧은 HPLC 분석법(Method)에서 올바른 피크를 올바르게 일치시키는 것이 중요합니다.

이는 표준 곡선에 사용되는 매트릭스의 스파이크 펩타이드를 사용하여 수행하고 방법 개발 중에 여러 전이를 관찰하여 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 데이터 주석을 수동으로 검토하여 정확성을 확인합니다. 각 펩타이드와 비율을 적절한 안정 동위원소 표지 내부 표준물질에 분석합니다.

고처리량 CSF 분석에서 얻은 중요한 펩타이드 마커의 크로마토그램이 여기에 나와 있습니다. 이 데이터는 관련 안정 동위원소 표지 내부 표준물질에 대한 표준화된 비율을 제공하며, 이는 절대 CSF 농도를 결정하고 임상 샘플의 변화를 통계적으로 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 CSF 분석에 포함된 74개의 펩타이드를 정량화한 결과, 25개가 치매 환자의 CSF에서 유의하게 변형된 것으로 나타났으며, 치매 마커인 pro-orexin 및 YKL chitinase-3-like protein의 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

ApoE4는 알츠하이머병의 알려진 위험 인자이며, ApoE 동형의 검출은 이성질체 E2 및 E4의 아미노산 변화에 해당하는 펩타이드의 검출을 기반으로 합니다. 각 동형 조합에 대해 예상되는 피크 패턴이 여기에 나와 있습니다. 분석법이 설정되면 적절하게 수행되면 하루 만에 분석을 수행할 수 있습니다. 이 방법의 개발 이후, 높은 분석 민감도와 특이성을 가진 새로운 바이오마커 세트를 측정할 수 있었으며, 이를 통해 연구자들은 새로운 방식으로 신경퇴행성 질환을 평가할 수 있게 되었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 감도와 특이성을 위해 MRM 분석을 설계하고 최적화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. DTE, 흰개미, 포름산 및 인체 조직으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 과정에서 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.