높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

이 방법의 전반적인 목적은 뇌척수액(CSF) 내의 여러 바이오마커를 빠르고 저렴하게 정량화하여, 이를 진단 및 치료 모니터링에 활용할 수 있는지 평가하는 것입니다. 이는 이전에는 측정이 불가능했던 바이오마커들을 측정할 수 있게 해주는 새로운 분석법입니다. 저희는 이 방법이 진단 목적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 서로 다른 신경퇴행성 질환을 구분하고 잠재적으로 예후 정보까지 제공할 수 있을 것으로 생각합니다.

이 기술의 주요 장점은 신속하고 시료 준비가 간편하며, 특이도가 높고 비용 효율적이어서 임상 실험실에 적용하기에 적합하도록 설계되었다는 점입니다. 이 고처리량 검사는 향후 신경퇴행성 질환의 새로운 치료법을 위한 임상 시험에 활용될 수 있어, 본 기술의 영향력은 치료 및 진단 분야까지 확장됩니다. 또한, 이 방법론은 신장 질환을 위한 소변, 심근병증을 위한 혈장, 그리고 다능성 확인을 위한 세포 등 다른 질병 및 조직에도 적용될 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 제조사의 지침에 따라 원하는 합성 펩타이드를 1 mg/mL의 스톡 농도로 재현탁하십시오. 스톡 농도의 펩타이드를 1/10로 희석하여 준비하고, 각 펩타이드 1,000 pmol을 저결합 마이크로원심분리 튜브에 모으십시오. 모아진 펩타이드 샘플을 SpeedVac 농축기로 건조하십시오.

완료 후, 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. 다음으로, CSF 100 µL를 low-binding 마이크로원심분리 튜브에 분주하십시오. CSF 샘플을 동결 건조하십시오.

혼합 펩타이드 샘플의 일부를 소화 버퍼에 재용해하여 10 pmol/µL 및 1 pmol/µL 농도로 준비합니다. 그다음, 동결 건조된 100 µL의 CSF 분주액에 혼합 펩타이드 샘플을 0, 1, 2, 5, 10, 15 pM 농도가 되도록 첨가합니다. 이어서, 내부 표준물질이자 트립신 소화 효율의 대조군으로 작용하도록 20 ng의 무관한 온전한 단백질을 첨가합니다.

CSF 분주액에 소화 완충액을 추가하여 최종 부피를 20 microliters로 맞춘 후, 샘플을 볼텍싱합니다. 그다음, 표준 프로토콜에 따라 1.5 microliters의 dithiothreitol을 추가하고 실온에서 1시간 동안 흔들어 샘플을 소화시킵니다. 이어서, 샘플에 3 microliters의 iodoacetamide를 추가하고 암실 내 실온에서 45분 동안 흔들어 줍니다.

그 다음, 165 µL의 2중 증류수를 첨가합니다. 50 mM 중탄산암모늄 버퍼에 재현탁된 0.1 µg/µL 농도의 시퀀싱 등급 변형 트립신 용액 10 µL를 시료에 첨가합니다. 시료를 37 °C 워터배스에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그 후, 샘플을 냉동하여 소화를 중단합니다. 얼음 위에서 CSF 소화물을 해동한 후, 16,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 완료되면, 각 소화물 60 µL를 300 µL 유리 인서트 바이알로 옮깁니다.

C18 UPLC 컬럼이 장착된 LC-MS 시스템을 사용하여, 10분 동안 1%에서 40% 아세토니트릴 선형 기울기를 적용하여 표준 곡선 지점 중 가장 높은 농도를 주입합니다. 분석이 완료되면 소프트웨어에서 결과 크로마토그램을 열고, 각 펩타이드별 머무름 시간과 가장 강도가 높은 상위 2개 전이(transition)를 기록합니다. 이 정보를 바탕으로, 펩타이드를 측정하기 위해 시간 설정 채널이 포함된 기존의 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring, MRM) 방법을 업데이트합니다.

감도를 유지하려면 각 펩타이드의 적어도 하나의 전이(transition)에 대해 피크당 포인트 수를 8개 이상으로, dwell time을 0.01초보다 크게 설정하여 각 채널을 유지하십시오. MS 방법 파일의 방법 이벤트(method events)에서 solvent delays를 선택하여 MRM 방법에 solvent delays를 포함하십시오. 짧은 HPLC 방법에서는 정확한 피크를 올바르게 매칭하는 것이 매우 중요합니다.

이는 표준 곡선에 사용되는 매트릭스 내의 스파이크 펩타이드를 이용하고, 방법 개발 단계에서 다중 전이를 관찰함으로써 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 데이터 주석(annotation)을 수동으로 검토하여 정확성을 확인하십시오. 각 펩타이드와 비율을 적절한 안정 동위원소 표지 내부 표준물질과 비교하여 분석하십시오.

고처리량 CSF 분석에서 확인된 주요 펩타이드 마커의 크로마토그램이 여기에 제시되어 있습니다. 데이터는 관련 안정 동위원소 표지 내부 표준물질에 대한 표준화된 비율을 제공하며, 이를 통해 CSF의 절대 농도를 결정하고 임상 시료의 변화를 통계적으로 분석할 수 있습니다. 본 CSF 분석에 포함된 74종의 펩타이드를 정량 분석한 결과, 치매 환자의 CSF에서 25종이 유의하게 변화한 것으로 나타났으며, 치매 마커인 pro-orexin 및 YKL chitinase-3-like protein의 결과가 여기에 표시되어 있습니다.

ApoE4는 알츠하이머병의 알려진 위험 인자이며, ApoE 동형단백질의 검출은 E2 및 E4 동형단백질의 아미노산 변화에 해당하는 펩타이드의 검출을 기반으로 합니다. 각 동형단백질 조합에 대해 예상되는 피크 패턴이 여기에 제시되어 있습니다. 방법이 설정되면, 적절히 수행될 경우 하루 만에 분석을 완료할 수 있습니다. 본 방법의 개발 이후, 높은 분석 민감도와 특이성을 가진 새로운 바이오마커 세트를 측정하는 것이 가능해졌으며, 이는 연구자들이 새로운 방식으로 신경퇴행성 질환을 평가할 수 있게 해줄 것입니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 민감도와 특이도를 위해 MRM 분석법을 설계하고 최적화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. DTE, 흰개미, formic acid 및 인체 조직을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 장갑 착용과 같은 예방 조치를 반드시 적용해야 함을 잊지 마십시오.