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도트 블롯 분석을 사용하여 바이러스 DNA를 정량화하려면 분리된 바이러스 DNA 현탁액으로 시작합니다. 알칼리성 용액으로 처리하여 후속 혼성화를 위해 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 변성시킵니다.
도트 블롯 장치를 미리 습윤된 나일론 멤브레인으로 조립합니다. 변성 바이러스 DNA 및 선형화된 표준 플라스미드 DNA 용액을 웰에 로드합니다. 적절한 진공을 적용하여 정전기 상호 작용을 통해 양전하를 띤 막 표면에 효과적인 음전하를 띤 바이러스 단일 가닥 DNA 전달 및 결합을 촉진하여 도트 패턴을 형성합니다.
실행 후 멤브레인을 구연산나트륨 완충액으로 세척하여 분석 감도를 개선하는 데 도움이 됩니다. 건조 후 멤브레인을 자외선에 노출시켜 블롯된 DNA를 멤브레인에 가교시킵니다.
열변성, 비이종 DNA 단편 및 바이러스 게놈 특이적 방사성 인 표지 DNA 프로브 현탁액을 혼성화 완충액에 멤브레인에 첨가합니다. 배양하여 혼성화를 촉진합니다.
DNA 단편은 차단제 역할을 하여 나머지 막 영역에 결합하여 비특이적 프로브 결합을 최소화합니다. 방사성 프로브는 바이러스 단일 가닥 DNA의 상보적 서열과 혼성화됩니다.
혼성화되지 않은 프로브를 제거하기 위해 세척 완충액으로 세척합니다. 형광체 이미지 스캐닝 시스템을 사용하여 멤브레인의 바이러스 게놈에 혼성화된 방사성 프로브에서 방출되는 방사성 신호를 정량화하여 도트 블롯 신호를 얻습니다.
표준 곡선에서 멤브레인에 있는 각 점의 신호 강도를 사용하여 샘플의 바이러스 DNA의 양을 계산할 수 있습니다.
도트 블롯 분석을 수행하려면 AAV 벡터 게놈 플라스미드 DNA를 물 또는 Tris-HCl 완충액에서 마이크로리터당 10나노그램으로 희석하여 플라스미드 DNA 표준물질을 준비합니다. 희석된 플라스미드 DNA의 25마이크로리터 분취량을 신선한 튜브로 옮기고 50마이크로리터 반응 부피에서 적절한 제한 효소로 1시간 동안 선형화합니다.
소화된 플라스미드 DNA 표준물질이 들어 있는 튜브에 450마이크로리터의 물 또는 TE를 넣고 완전히 혼합합니다. 그런 다음 이 혼합물 70마이크로리터를 1,330마이크로리터의 물 또는 TE가 포함된 새로운 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮겨 희석된 플라스미드 표준물질을 만듭니다.
도트 블롯 장치를 설정하려면 가위를 사용하여 블로팅 멤브레인을 샘플 및 표준물질 수에 적합한 크기로 자릅니다. 멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓기 전에 물에 10분 동안 담그십시오. 그런 다음 사용하지 않는 우물을 덮습니다. 샘플을 적재할 우물에 물을 추가합니다. 진공청소기를 적용하고 우물을 통해 물을 끌어당기고 오류가 있는지 확인한 다음 나사를 다시 조입니다. 필요한 경우 다시 테스트하십시오.
각 웰에 400마이크로리터의 희석된 플라스미드 DNA 표준물질을 적용하고 표준 희석액을 4개 레인으로 실행합니다. 표준 다이제스트의 두 개의 개별 분취량을 사용하고 각각 이중으로 로드합니다. 그런 다음 각 바이러스 DNA 샘플의 웰당 200마이크로리터를 도포합니다. 부드러운 진공을 적용하여 웰을 통해 DNA 용액을 모으십시오. 그런 다음 모든 우물이 비워지면 3방향 밸브를 조정하여 진공을 해제합니다.
각 웰에 400마이크로리터의 1X 알칼리성 용액을 추가합니다. 그런 다음 5분 동안 기다렸다가 진공을 다시 적용하여 우물을 비웁니다. 진공을 다시 적용하고 도트 블롯 장치를 분해합니다. 그런 다음 멤브레인을 제거하고 2X SSC로 헹굽니다.
DNA가 결합된 면이 위를 향하도록 멤브레인을 깨끗한 종이 타월 위에 놓아 과도한 완충액을 제거합니다. 적절한 UV 가교제를 사용하여 블로밍된 DNA를 멤브레인에 UV 가교합니다. 이제 멤브레인은 혼성화를 위한 준비가 되었습니다.
DNA가 결합된 면이 위로 향하도록 멤브레인을 혼성화 병에 넣습니다. 5-10밀리리터의 예열된 혼성화 완충액으로 멤브레인을 헹구고 완충액을 버립니다. 그런 다음 예열된 하이브리드화 완충액 10밀리리터를 넣고 섭씨 65도로 설정된 회전식 하이브리드화 오븐에 병을 넣습니다. 병을 최소 5분 동안 돌립니다.
변성된 정자 DNA와 방사성 프로브를 병의 혼성화 완충액에 빠르게 넣고 10초 동안 흔들어 혼합합니다. 병을 섭씨 65도 오븐에 다시 넣고 섭씨 65도에서 최소 4시간 동안 회전하면서 배양합니다.
하이브리드화가 완료되면 회전을 멈추고 하이브리드화 병을 제거한 다음 방사성 프로브 용액을 누출 방지 플러그 씰 캡이 있는 50밀리리터 원추형 튜브에 붓습니다. 멤브레인을 세척하려면 20-30마이크로리터의 예열된 세척 완충액을 하이브리드화 병에 넣고 5분 동안 회전시킵니다. 이 세탁을 두 번 더 반복합니다.
세 번째 세척 후 혼성화 병에서 멤브레인을 제거하고 종이 타월을 사용하여 멤브레인에서 과도한 완충액을 제거합니다. 그런 다음 멤브레인을 투명한 플라스틱 종이 홀더에 넣습니다. 가이거 계수기를 사용하여 멤브레인의 방사성 신호를 확인하십시오.
[트릴링]
지워진 형광체 이미징 스크린을 멤브레인에 노출시킨 후 형광체 이미지 스캐닝 시스템을 사용하여 스크린을 스캔하고 각 도트의 신호 강도에 대한 데이터를 얻습니다.
