바이러스 게놈을 정량화하기 위한 Dot Blot Assay

도트 블롯 분석을 사용하여 바이러스 DNA를 정량화하려면 분리된 바이러스 DNA 현탁액으로 시작합니다. 알칼리성 용액으로 처리하여 후속 혼성화를 위해 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 변성시킵니다.

도트 블롯 장치를 미리 습윤된 나일론 멤브레인으로 조립합니다. 변성 바이러스 DNA 및 선형화된 표준 플라스미드 DNA 용액을 웰에 로드합니다. 적절한 진공을 적용하여 정전기 상호 작용을 통해 양전하를 띤 막 표면에 효과적인 음전하를 띤 바이러스 단일 가닥 DNA 전달 및 결합을 촉진하여 도트 패턴을 형성합니다.

실행 후 멤브레인을 구연산나트륨 완충액으로 세척하여 분석 감도를 개선하는 데 도움이 됩니다. 건조 후 멤브레인을 자외선에 노출시켜 블롯된 DNA를 멤브레인에 가교시킵니다.

열변성, 비이종 DNA 단편 및 바이러스 게놈 특이적 방사성 인 표지 DNA 프로브 현탁액을 혼성화 완충액에 멤브레인에 첨가합니다. 배양하여 혼성화를 촉진합니다.

DNA 단편은 차단제 역할을 하여 나머지 막 영역에 결합하여 비특이적 프로브 결합을 최소화합니다. 방사성 프로브는 바이러스 단일 가닥 DNA의 상보적 서열과 혼성화됩니다.

혼성화되지 않은 프로브를 제거하기 위해 세척 완충액으로 세척합니다. 형광체 이미지 스캐닝 시스템을 사용하여 멤브레인의 바이러스 게놈에 혼성화된 방사성 프로브에서 방출되는 방사성 신호를 정량화하여 도트 블롯 신호를 얻습니다.

표준 곡선에서 멤브레인에 있는 각 점의 신호 강도를 사용하여 샘플의 바이러스 DNA의 양을 계산할 수 있습니다.

도트 블롯 분석을 수행하려면 AAV 벡터 게놈 플라스미드 DNA를 물 또는 Tris-HCl 완충액에서 마이크로리터당 10나노그램으로 희석하여 플라스미드 DNA 표준물질을 준비합니다. 희석된 플라스미드 DNA의 25마이크로리터 분취량을 신선한 튜브로 옮기고 50마이크로리터 반응 부피에서 적절한 제한 효소로 1시간 동안 선형화합니다.

소화된 플라스미드 DNA 표준물질이 들어 있는 튜브에 450마이크로리터의 물 또는 TE를 넣고 완전히 혼합합니다. 그런 다음 이 혼합물 70마이크로리터를 1,330마이크로리터의 물 또는 TE가 포함된 새로운 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮겨 희석된 플라스미드 표준물질을 만듭니다.

도트 블롯 장치를 설정하려면 가위를 사용하여 블로팅 멤브레인을 샘플 및 표준물질 수에 적합한 크기로 자릅니다. 멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓기 전에 물에 10분 동안