대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

이러한 방법들의 전반적인 목적은 처리가 인간 노로바이러스 캡시드의 감염력이나 무결성에 미치는 영향에 대해 더 깊은 통찰을 얻는 것입니다. 이 방법은 비외피 바이러스 불활성화 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 특정 처리 후에 바이러스 캡시드의 세포 감염 능력이 어떻게 변화하는지와 같은 질문입니다.

이러한 방법들의 주요 장점은 특정 처리가 바이러스에 작용하는 방식에 대해 추가적인 기전적 통찰을 제공할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 인간 노로바이러스 불활성화 전략에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 리노바이러스나 A형 간염 바이러스와 같은 다른 비엔벨로프 바이러스에도 적용될 가능성이 있습니다.

먼저, 캡시드로 조립된 정제된 인간 노로바이러스 주요 캡시드 단백질을 1X phosphate buffered saline에 50 µg/mL 농도로 희석하십시오. 캡이 있는 개별 PCR 튜브에 사용하는 최대 부피는 15 µL입니다.

튜브에 최소 600 nanograms의 캡시드가 포함되어 있는지, 그리고 처리 리간드 조합당 600 nanograms의 캡시드가 있는지 확인하십시오. 다음으로, 열 순환기를 원하는 열처리 온도로 예열하십시오. 그런 다음, 즉각적인 냉각을 위해 추가 열 순환기를 4 °C로 예열하십시오.

캡시드 용액이 들어있는 튜브를 써모사이클러에 넣고 원하는 시간 동안 반응시킵니다. 가열 후, 즉시 튜브를 4 °C로 사전 냉각된 사이클러로 옮겨 5분 동안 유지합니다. 원심분리기로 튜브를 짧게 스핀 다운하여 모든 액적이 튜브 바닥에 모이게 합니다.

처리된 캡시드 용액과 PBS를 3 µg/mL로 희석합니다. 희석된 처리 캡시드 용액이 최소 200 µL 확보되었는지 확인하십시오. 다음으로, 각 웰에 캡시드 용액 100 µL를 분주하며, 처리당 최소 2개의 웰을 확보하십시오. 또한, 각 리간드에 대해 PBS 100 µL가 담긴 대조군 웰 2개를 포함합니다. 이는 분석의 배경 흡광도를 제공합니다. 플레이트에 덮개를 덮고 가장자리를 파라핀 필름으로 밀봉하여 증발을 줄입니다. 플레이트를 4 °C의 진탕 인큐베이터에서 하룻밤 동안 두거나 실온에서 2시간 동안 둡니다.

배양 후, 처리된 캡시드 용액을 플레이트에서 제거합니다. 그런 다음, 웰당 200 µL의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 실온에서 2시간 동안 또는 4 °C에서 밀봉하여 하룻밤 동안 배양합니다.

그동안 비오틴화된 압타머(biotinylated aptamer)를 nuclease-free water로 1 µM 농도가 되도록 희석하십시오. 각 처리군당 총 200 µL의 용액이 충분히 준비되었는지 확인하십시오.

또한, 선택한 biotinylated HPGA를 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 사용하여 30 µL/mL 농도로 희석하십시오. 이때 각 처리군당 총 부피 200 µL에 충분한 양의 용액이 확보되었는지 다시 한번 확인하십시오.

인큐베이션 후, 블로킹 버퍼를 제거하고 웰당 200 µL의 PBST로 플레이트를 3회 세척합니다. 플레이트를 멸균 종이 타월 위에 뒤집어 놓아 잔류 수분을 제거합니다. 다음으로, 열처리된 리간드 조합당 2개의 웰이 배정되도록 리간드 결합 용액을 웰당 100 µL씩 분주한 후, 커버를 덮은 플레이트를 오비탈 쉐이커에서 상온으로 약 60 RPM으로 1시간 동안 인큐베이션합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웰을 세척한 후, PBS에 희석된 0.2 µg/mL streptavidin horseradish peroxidase를 웰당 100 µL씩 첨가하십시오.

웰을 다시 세척하기 전, 오비탈 쉐이커에서 부드럽게 흔들어주며 상온에서 15분 동안 배양합니다. 그 후 다시 한 번 세척하고, 웰당 100 µL의 TMB 기질을 첨가한 뒤 5분에서 15분 동안 발색시킵니다. 웰의 색상 변화를 관찰합니다.

반복 플레이트 간의 발색 시간을 일정하게 유지하고, 사용하는 플레이트 리더의 흡광도 측정 범위를 확인하십시오. 웰당 1 M 인산 100 µL를 첨가하여 반응 발색을 중단시킵니다. 즉시 450 nm에서 플레이트를 측정하십시오.

텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 DLS 기기 소프트웨어에서 새로운 크기 표준 작업 절차를 생성하십시오. 그런 다음, 소프트웨어 내의 녹색 실행 화살표를 선택하고 샘플 이름을 지정하십시오.

열처리된 바이러스 유사 입자(VLPs)를 1X PBS로 1:10 비율로 희석하여 최종 농도를 5 µg/mL로 맞춥니다. 그 다음, 먼지 입자를 제거하기 위해 1 µm 공극 크기의 필터로 샘플을 여과합니다. 큰 입자는 작은 입자보다 빛을 훨씬 더 많이 산란시키므로 DLS는 먼지에 매우 민감합니다. 희석된 VLP 50 µL를 소량용 일회용 큐벳에 옮깁니다. 큐벳을 기기의 샘플 챔버에 삽입합니다. 측정을 시작하고 correlogram cumulant fit 및 expert advice 탭을 사용하여 데이터 품질을 평가합니다. 측정 중에 polydispersity index 값이 0.3 미만인지 확인하여 측정 품질이 적절한지 판단합니다.

Multiview 탭에서 상관 계수가 짧은 시간대에는 일정하며 1에 가깝지만 1을 초과하지 않고, 이후 시간대에는 0으로 급격히 떨어지는지 확인하십시오. 이는 입자 크기의 전형적인 특성입니다. 측정 중 데이터 품질에 대한 피드백은 expert advice 탭을 이용하십시오. 측정이 완료되면 다분산 지수(polydispersity index) 값이 0.3 미만인지 다시 한번 확인하십시오.

cumulants fit 탭에서 적률 피팅 선이 데이터 포인트와 밀접하게 일치하는지 확인하십시오. 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 DLS 기기 소프트웨어에서 새로운 크기 표준 작업 절차를 생성하십시오. 소프트웨어 내의 실행 화살표를 선택하여 새 샘플을 열고 이름을 지정한 다음, 기기가 온도 평형에 도달할 때까지 기다리십시오.

VLP 현탁액을 소량용 석영 큐벳에 옮기되, 기포가 생기지 않도록 큐벳 벽면을 따라 천천히 피펫팅합니다. 기기가 온도 평형에 도달하면 큐벳을 샘플 챔버에 삽입합니다. 샘플 온도가 평형을 이룰 때까지 10초 동안 기다린 후, 측정을 시작함과 동시에 타이머를 작동시킵니다.

첫 번째 측정이 끝나면 타이머를 멈춥니다. 이 시간을 첫 번째 시점으로 설정합니다. 이후의 시점들은 소프트웨어에 기록된 측정 시간을 통해 얻습니다.

10 millimolar HEPES, pH 7.4를 PBS로 대체하고 처리 후 캡시드를 추가로 희석하지 않는 것 외에는 이전과 동일하게 열처리를 수행합니다. 다음으로, 처리된 캡시드 용액 15 microliter 방울 전체를 파라핀 필름 위에 피펫으로 분주합니다. 핀셋으로 그리드 가장자리를 잡아 그리드를 고정한 후, 처리된 용액 방울 위에 그리드의 탄소면이 아래로 향하게 놓습니다.

캡시드가 그리드에 부착될 수 있도록 10분 동안 배양합니다. 캡시드 시료의 순도에 따라, 처리된 캡시드 액적 뒤에 10~15 µL의 HEPES 용액 액적을 일렬로 배치하여 세척 과정을 추가합니다. 10분 후, 액적이 묻어 있는 그리드를 집어 올립니다.

필터 페이퍼에 그리드를 거의 수직으로 접촉시켜 액적을 흡수시킵니다. 그런 다음, 그리드를 사용하여 10 to 15 µL의 HEPES buffer 액적을 찍어 올리고 30초 동안 유지합니다. 30초의 세척 시간이 지난 후, 다른 필터 페이퍼 조각으로 액적을 흡수하여 제거합니다.

다음으로, 빈 공간의 파라핀 필름 위에 2% uranyl acetate 용액 한 방울(15 µL)을 떨어뜨립니다. 그리드로 uranyl acetate 방울을 집어 45초 동안 유지합니다. 그런 다음, 용액의 대부분이 제거되도록 uranyl acetate를 흡수시켜 제거합니다.

그리드의 탄소 면이 위로 향하게 하여 거름종이 위에 놓되, 그리드가 핀셋의 수분에 달라붙지 않도록 주의하십시오. 그다음, 그리드가 놓인 거름종이를 개방형 유리 페트리 접시에 넣습니다. 모든 처리군에 대해 이 과정을 반복한 후, 그리드가 담긴 페트리 접시 하단을 데시케이터에 넣어 하룻밤 동안 건조시킨 뒤 TEM으로 관찰하십시오.

다음 그래프는 68 °C에서 처리했을 때 시간에 따른 인간 노로바이러스 캡시드의 결합 능력 감소를 보여줍니다. 보시는 바와 같이, HPGA 결합이 가장 먼저 완전히 사라집니다. 이 시점에서 용액 내 캡시드의 대다수가 호스트 세포 HPGA와 결합하는 능력을 상실하여 세포 내로 유입될 수 없게 된 것으로 간주됩니다.

압타머 결합은 HBGA의 결합과 유사하지만, 신호를 제거하기 위해 약간 더 많은 열처리가 필요합니다. 여기에 양호한 품질의 데이터를 대표하는 DLS 상관 계수 곡선이 제시되어 있습니다. 시간이 0에 가까울 때, 상관도(correlogram)는 1에 가깝지만 그보다 낮은 값에서 일정하게 유지됩니다.

그 후 입자 크기의 특성 시간에 따라 0으로 급격히 떨어집니다. 이 실험에서 얻은 크기 결과는 신뢰할 수 있을 가능성이 높습니다. 반대로, 이 상관계수 곡선은 품질이 낮은 데이터를 나타냅니다.

코렐로그램(correlogram)은 1 이상의 값에서 시작하여 점차 0으로 떨어집니다. 이 실험의 결과는 사용해서는 안 됩니다. 여기에서 입자 크기 데이터는 68 °C에서 처리된 캡시드(capsid)의 뚜렷한 응집 프로파일을 보여주며, 약 20분 후에 초응집체(super aggregates)가 형성됩니다.

초응집(super aggregation)이 일어나는 시점은 해당 처리에 대한 VLP의 민감도를 나타내는 특성입니다. 이 그림은 인간 노로바이러스 캡시드의 열처리에 대한 TEM 결과를 시각화한 것입니다. 여기에서 캡시드는 왼쪽에서 오른쪽으로 60에서 80 °C의 온도에서 처리되었습니다.

보시는 바와 같이, 캡시드가 응집되고 변성됨에 따라 처리에 따라 캡시드 형태가 분명하게 변화합니다. 68 °C에서 0분부터 25분까지 처리한 캡시드에서도 유사한 현상이 관찰됩니다.

이 기술들을 숙달하고 올바르게 수행한다면, 1시간에서 24시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 기술은 개발 이후 식품 바이러스학 분야의 연구자들이 인간 노로바이러스 캡시드에 미치는 불활성화의 메커니즘과 효과를 탐구할 수 있는 추가적인 경로를 제공했습니다. 이 절차에 이어, RNase 전처리를 수행하거나 수행하지 않은 실시간 RT-PCR, 바이러스 캡시드의 SDS page, 배양 가능한 대리 바이러스를 이용한 플라크 분석과 같은 다른 방법들을 수행함으로써 특정 처리 후 바이러스 감소에 대한 보다 완전하고 종합적인 관점을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 리간드 결합, 동적 광산란 및 투과 전자 현미경을 활용하여 인간 노로바이러스 캡시드에 미치는 불활성화 처리 효과에 대한 추가적인 메커니즘적 통찰을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

사용되는 일부 시약은 위험할 수 있으므로, 본 실험 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장구를 착용하고 실험실 안전 수칙을 준수하는 등의 주의 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.