Name: 대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 학습하세요 인간 노로바이러스 캡시드 무결성 평가를 위한 앱타머 결합, 동적광산란 및 투과전자현미경 기법을 활용한 바이러스학 연구 방법론입니다.

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이 작품은 NoroCORE 프로젝트를 통해 농업 및 식품 연구 주도권 경쟁 부여 번호 2011-68003-30395 미국 농 무부, 식품 및 농업에 의해 지원 되었다. 오픈 액세스 비용 자금 미국 농 무부에 의해 제공 했다. 우리는 로버트 Atmar (베일 러 대학의과 대학, 휴스턴, TX) 친절 하 게 우리가 제공 하 고 순화 capsids 발레리 라 팜 가장 이미지와 함께 그녀의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 제시 하는 실험을 시작 하는 데 도움에 대 한 프랭크 N. 배리 감사 하 고 싶습니다.

1. 구조에 대 한 평가 손실의 더 높은 순서 노로바이러스 Capsid 바인딩 분석 결과 플레이트 기반 참고: 여기에 매우 비슷한 ELASA 프로토콜 게시 29 되었습니다 그리고 유사한 ELASA 분석 이전 연구의 일부 기사 17 , , 18 22 다른 곳으로 보고 되었습니다.
<ol><li>인간의 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids의 열 처리 <ol><li>얻을 순화 인간의 노로바이러스 GII.4 시드니의 주요 capsid 단백질 (VP1) (가입: JX459908) 조립 capsids. 
		참고: 연구에서 Capsids R. Atmar (베일 러 대학의과 대학, 휴스턴, 텍사스)의 입수 했다.</li>
		<li>Dilute capsids 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.2) 개인 15 µ L의 최대 볼륨을 x 1에 50 µ g/mL를 PCR 튜브 출장. 적어도 600 튜브에 포함 되어 있는지 확인 capsid의 ng. 600는 확인 치료 ligand 조합 당 capsid의 ng.</li>
		<li>예 열 원하는 열 처리에 열 cycler. 
		참고:이 프로토콜을 서로 다른 시간에 대 한 68 ° C에서 치료의 목적을 위해 (0-25 분) 선정 되었다.</li>
		<li>즉시 냉각 4 ° C에 추가 열 cycler 예 열. 원하는 시간에 대 한 열 cycler에 capsid 솔루션 튜브를 추가 합니다. 가 열 후 5 분에 대 한 사전 냉각된 4 ° C cycler 즉시 전송.
		변성된 capsid 컨트롤로 <ol><li>포함 95 ° C 5 분에 대 한 치료. 긍정적인 통제로 치료 (23 ° C) capsid 솔루션을 포함 합니다. 추가 부정적인 컨트롤로 아무 capsid PBS 포함.</li>
		</ol></li> <li>짧게 스핀 다운 튜브의 하단에 모든 방울 고 3 µ g/ml PBS에 치료 capsid 솔루션을 희석을 원심 분리기에서. 희석, 대우 capsid (100 µ L/잘)의 적어도 200 µ L 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>적용 100 µ L 처리 당 적어도 2 개의 우물 보장 각 잘 capsid 솔루션의. 또한, 각 ligand;에 대 한 100 µ L PBS 가진 2 제어 우물을 포함 이 분석 결과의 배경 흡 광도를 제공 한다. 커버 뚜껑 접시, 4 ° C에서 또는 실내 온도에서 2 h 떨고 인큐베이터에 인감 파라핀으로 가장자리를 줄이기 위해 증발, 영화와 떠나 하룻밤.</li>
	<li>블로킹 버퍼 PBS에 0.05%와 5% 탈지 우유 고체 (w/v)를 함으로써 준비 트윈 20 (PBST).</li>
	<li>접시에서 치료 capsid 솔루션을 제거합니다. 블로킹 버퍼의 200 µ L/잘 추가 합니다. 실 온에서 2 h에 대 한 품 어 또는 하룻밤, 4에서 봉인 ° c.</li>
	<li>준비는 ligand 바인딩 biotinylated aptamer M6-2 18 , 29에 대 한 솔루션 및 biotinylated 합성 HBGA 혈액형 A 또는 biotinylated 유형 헤
	<li>Dilute nuclease 무료 물에서 1 µ m biotinylated aptamer <ol>. 각 치료에 대 한 총 200 µ L에 대 한 충분 한 솔루션 인지 확인 합니다. 선택한 biotinylated HBGA 블로킹 버퍼에서 30 µ g/mL를 희석. 각 치료에 대 한 200 µ L 전체 볼륨에 대 한 충분 한 솔루션 인지 확인. 
		참고: 사용 하려면 적은 HBGA, 10 µ g/mL HBGA의 0.25% 탈지 우유-PBST에 교체하실 수 있습니다. Biotinylated M6 2를 HBGA 농도 이전 최적화 되었고 보고.</li>
	</ol></li> <li>블로킹 버퍼를 제거 하 고 3 번으로 200 µ L/잘 PBST 접시를 세척. 잔류 수 분을 건조 살 균 종이 타 올에 거꾸로 접시를 두 드려.</li>
	<li>추가 100 µ L/잘은 ligand의 바인딩 솔루션, 열 처리-ligand 조합 당 2 웰 스는 확인. 품 어 실 온에서 1 시간에 약 60 rpm에서 궤도 통에 뚜껑으로 덮여 접시. 
	참고: 각각 2 웰 스 각 치료 capsids 그리고 각 리간드에 대 한 완전 하 게 변성된 capsids의 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 포함 해야 합니다. 또한, 2는 &#34; 아무 capsid &#34; 웰 스는 격판덮개로 각 리간드에 대 한 배경 컨트롤.</li>
	<li>는 Ligand 솔루션을 제거 하 고 세척 3 번 200 µ L/잘 PBST와 우물. 잔여 수 분을 건조 살 균 종이 타 올에 접시를 거꾸로 팻.</li>
	<li>추가 100 µ L/잘 0.2의 해결책의 µ g/mL streptavidin-와 사비 PBS에 과산화 효소. 궤도 셰이 커에 부드러운 진동으로 실 온에서 15 분 동안 품 어. 
	참고: 다른 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 어원이 같은 말 다른 농도 있을 것 이다. 사용자 문의 &#39; 효소의 ELISA 응용 프로그램에 대 한 농도의 이상적인 범위에 대 한 s 설명서 그리고 그것은 최적의.</li>
	<li>어원이 솔루션을 제거합니다. 200 µ L/잘 PBST 3 번 씻어. 잔여 수 분을 건조 살 균 종이 타 올에 접시를 거꾸로 팻.</li>
	<li>추가 100 µ L/잘 3, 3 &#39;, 5, 5 &#39;-tetramethylbenzidine (TMB) 기판 색을 개발 하는 5-15 분 관찰 부정적인 제어 웰 스에 대 한 색상 및 복제 판 사이의 같은 시간 동안 지속적으로 개발 해야 하 고. 뿐만 아니라 사용 하는 플레이트 리더의 흡 광도 범위에 유의. 
	참고: 개발 시간 ligands/시 약 사용의 품질에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>100 µ L/잘 1 M 인산에 대 한 반응의 개발을 중지합니다. 즉시 450에서 격판덮개를 읽을 nm. 데이터를 저장. 
	참고: 산의 소개 일반적으로 크게 반응 속도가 느려집니다 하지만 완전히 그것을 중지 하지 않습니다. 흡수도 읽기 전에 시간의 연장된 금액에 대 한 중지 접시를 두지 마십시오.</li>
</ol> 2. 플레이트 기반 분석 결과의 분석 <ol><li>스프레드시트 프로그램에서 원시 흡 광도 데이터 저장. 특정 치료와 리간드 잘 각 쌍에 대 한 평균 absorbances를 생성 합니다. 이 평균을 사용 하 여 모든 후속 분석. 
	참고: 비교 아무 쌍 우물의 크게 이질적인 값은 다는 것을 반드시 하 두 잘 absorbances.</li>
	<li>의 원시 흡 광도, 절대 capsid 무결성 (모든 바인딩)을 분석 하는 &#34; 아무 capsid &#34; 다른 모든 샘플 흡 광도 값에서 제어. 
	참고: 또는, 더 높은 순서 (2 차, 3 차, 4 급) 구조의 손실로 인해 바인딩의 손실 직접 분석할 수 있습니다. 네거티브 (capsid) 제어의 흡 광도 빼기 대신 완전히 변성된 capsid 컨트롤의 값을 뺍니다. 모든 바인딩 일반적인 장치에 바인딩 수 있으므로 capsid 시퀀스 인해 바인딩 신호이 제거 합니다. HBGA 및 aptamer M6 2 비슷한 결과 생성 하는 방법 중 하나 그래서 완전히 변성된 capsid 작은 바인딩을 표시 합니다. 일반적인 aptamer 바인딩에 거짓 긍정적인 신호는 분석 사용을 선택할 때 고려해 야 합니다.</li>
	<li>는 음수 또는 변성 제어 조정 absorbances, 함께 나누어 그들의 각각 긍정적인 (치료)에 의해 absorbances absorbances 제어 및 증식 치료 100. 이 치료 컨트롤에 상대적인 치료 capsid의 신호 비율을 제공 합니다.</li>
	<li>Capsid 시퀀스에 기인 각 ligand 바인딩 신호의 정도 예측 하려면 빼기는 &#34; 아무 capsid &#34; 초기 absorbances에서 제어를 제외 하 고 변성된 capsid의 조정된 흡 광도. 긍정적인 제어 신호의 조정된 흡 광도 의해 이것을 분할 하 고 100을 곱하십시오. 이 때문에 변성된 capsid/capsid 시퀀스에 ligand 바인딩 신호의 명백한 비율 제공.</li>
</ol> 3. 열 처리 후 바이러스 집계 감지에 대 한 DL 참고: 다음 단계는 소프트웨어와 관련 있을 수 있습니다 및 악기 사용, 하지만 적응 하 고 수 유사한 장치에 적용.
<ol><li>만들기는 DL에 새로운 크기 SOP 악기 소프트웨어 사용: 자료 = 단백질, Dispersant PBS, 온도 = = 25 ° C, 평형 시간 = 0 초, 셀 일회용 베트 (작은 볼륨, ZEN0040), 측정 각도 = = 173 ° 후방 산란 측정 기간 = 자동 측정의 수 = 3, 측정 간격 = 0 초, 데이터 처리: 분석 모델 = 범용 (일반 해상도). 다른 모든 매개 변수에 대 한 기본 설정을 사용 하 여.</li>
	<li>소프트웨어, 녹색 실행된 화살표를 선택 하 고 이름을 샘플.</li>
	<li>단계 VLPs의 열 처리에 대 한 1.1.4 통해 1.1.1.</li>
	<li>Dilute 열 처리 VLPs 1시 10분 5 µ g/mL의 최종 농도 대 한 1 x PBS. (선택 사항) 먼지 입자;를 제거 하는 1 µ m 기 공 크기와 샘플 필터링 DL은 매우 민감한 먼지, 큰 입자는 작은 입자 보다 훨씬 더 많은 빛을 흩어.</li>
	<li>일회용 작은 볼륨으로 희석된 VLPs의 전송 50 µ L 베트. 악기의 샘플 챔버에는 멧 삽입.</li>
	<li>실행을 시작 하 고 사용는 &#39; Correlogram &#39;, &#39; Cumulants 맞춤 &#39;, 및 &#39; 전문가 조언을 &#39; 데이터 품질 평가를 탭.
	<ol><li>실행 하는 동안 확인 증가할수록 인덱스 값이 0.3, 대표는 품질 측정.에서 보다는 &#8216; 분할 &#8217; 탭, 상관 계수는 상수와 가까이, 그러나 이상의 1, 짧은 시간에 다는 것을 확인 그리고 나중에, 입자 크기의 특성 0 급격히 떨어져 상품. 사용은 &#8216; 전문가 조언을 &#8217;를 측정 하는 동안 데이터 품질에 대 한 피드백에 대 한 탭.</li>
		<li>측정 완료 후 증가할수록 인덱스 값이 0.3 보다 작은 다시 확인 합니다. cumulants 라인 다음과 데이터 포인트에 밀접 하 게 맞는 다는 것을 확인은 &#8216; Cumulants에 맞는 &#8217; 탭</li>
	</ol></li> <li>걸릴 각 샘플의 입자 크기 각 측정에 대 한 Z-평균 입자 직경의 평균 보고. ° C.에에서 온도 대 nm의 직경을 플롯</li>
</ol> 4. 실시간에서 감지 바이러스 집계에 대 한 DL 참고: 다음 단계는 소프트웨어와 관련 있을 수 있습니다 및 악기 사용, 하지만 적응 하 고 수 유사한 장치에 적용.
<ol><li>만들기는 DL에 새로운 크기 SOP 악기 소프트웨어 사용 하 여: 소재 단백질, Dispersant = = PBS, 온도, 평형 시간 = = 0 초, 셀 석 영 cuvette, 측정 각도 = = 173 ° 후방 산란 측정 기간 자동, = 측정의 수 = 50 (증가 또는 감소에 따라 집계 속도 수 있습니다), 측정 간격 = 0 초, 데이터 처리: 분석 모델 = 여러 좁은 모드 (높은 해상도). 다른 모든 매개 변수에 대 한 기본 설정을 사용 하 여.</li>
	<li>이름을 새로운 샘플을 열고 소프트웨어 실행된 화살표를 선택 하 고 허용 온도 평형에 도달 하는 악기.</li>
	<li>사이 200-500 µ L. 볼륨과 5 µ g/mL의 농도에서 microcentrifuge 튜브에 1 X PBS에는 VLPs를 중단 소용돌이 정지.</li>
	<li>드 가스 탁상 원심 분리기에 5-10 s VLP 정지 아래로 회전 합니다. 이 크기 측정을 방해 하는 열 처리 중 거품 형성을 방지 하는 데 도움이.</li>
	<li>전송은 VLP 서 스 펜 션 작은 볼륨 석 영 cuvette 방지 거품 하 고는 베트의 벽에 천천히 플라스틱. 악기 온도 평형에 도달 하면, 샘플 챔버에는 베트를 삽입.</li>
	<li>기다려 10 s equilibrate, 샘플 온도 대 한 실행을 시작 합니다. 실행의 시작에 타이머를 시작 합니다. 첫 번째 측정의 끝에 타이머를 중지 합니다. 첫 번째 시간으로이 시간이 걸릴. 소프트웨어에 의해 기록 측정 시간에서 후속 시간 포인트 얻기.</li>
	<li>실행을 시작 하 고 correlogram, 맞는, 배포 및 데이터 품질을 평가 하기 위해 전문가 조언을 모니터링. 
	참고:는 PDI 반드시 되지 않습니다 이러한 측정 샘플으로 0.3 보다는 더 적은 polydisperse 집계 될 것으로 예상 된다.
	<ol><li>상관 계수 상수와 가까이, 하지만 짧은 시간에, 이상의 1 하 고 하나 이상의 최신 시간, 입자 크기의 특성에서 크게 떨어져 상품.</li>
		<li>분포 선 다음과 같이 데이터 포인트 밀접 하 게 맞는 있는지 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>크기 데이터를 분석.
	각 측정 및 초기 시간 포인트 사이의 시간 차이에서 <ol><li>결정 때마다 포인트. 측정 기간 모두 정확 하 게 동일 않습니다.</li>
		<li>강도 분포를 사용 하 여 각 측정/시간 지점에 대 한 가장 큰 지역으로 봉우리의 크기 기록.</li>
		<li>대 분에 시간 nm에서 최대 직경 플롯</li>
	</ol></li></ol> 5. TEM 샘플 준비 가장을 위한 <ol><li>얻기 탄소 지원 영화 (니켈) 격자. 
	참고: 시설 현미경으로 권장된 시 약 및 사용에 대 한 그들의 처리에 핵심 시설 문의. 방 습 제 나 습기에 노출을 최소화 하기 위해 진공 챔버를 포함 하는 상자에서 격자를 저장 하십시오.</li>
	<li>필터 종이 약 5 c m x 5 cm 조각 눈물. 유리 접시를 가져오고 핀셋 현미경 검사 법에 사용 하기 위해 설계 된 반전 적절 한 자기-폐쇄.</li>
	<li>는 파라핀 필름의 약 2.5 c m x 5 cm 조각 잘라. 벤치탑에.</li>
	<li>노로바이러스 GII.4 시드니 capsids의 열 처리 <ol><li>단계 1.1.1-1.1.5 제외 하 고 위에서 설명한 대로 정확 하 게 열 처리 절차에 따라: PBS 대신 치료를 위해 10 mM HEPES (pH 7.4)을 사용 하 고 더 capsids 희석 하지 않습니다 치료 (50 µ g/mL에서 유지 솔루션) 후. 파라핀 필름에 대우 capsid 솔루션의 전체 ~ 15 µ L 드롭 플라스틱.</li>
	</ol></li> <li>그리드 가장자리는 그리드를 가장자리에를 핀셋으로 잡아 및 치료 솔루션 방울 위에 그리드 탄소-사이드-아래로 놓습니다. Capsid는 격자에 연결할 수 있도록 10 분 동안 품 어 보자.
	<ol><li>Capsid 준비의 순도 따라 추가 10 mM HEPES 솔루션의 세척 처리 capsid 방울 후 라인에 배치 하는 10-15 µ L 방울의 형태로 필요한 경우.</li>
		<li>후 10 분은 물방울과 그리드를 선택 합니다. 장소 필터 종이에 거의 수직 그리드는 물방울을 멀리 심지. 그리드와 10-15 µ L HEPES 버퍼의 방울을 데리, 워시 필터 종이의 또 다른 조각으로 30 s, 다음 심지 멀리 잡아</li>
	</ol></li> <li>빈 영역에서 파라핀 영화에 2 %uranyl 아세테이트 솔루션의 15 µ L 드롭릿 장소.
	<ol><li>그리드와 uranyl 아세테이트의 방울을 데리 누르고 45 s. 윅 거리에 대 한 uranyl 아세테이트, 솔루션의 대부분을 제거 해야 되 고. 필터 종이, 표 하지 않는 주의에 그리드 탄소-측면 장소 &#34; 스틱 &#34; 핀셋에 습기. 오픈 유리 페 트리 접시에에서 그것에 그리드와 필터 종이 놓습니다. 
		참고: 사용 하지 마십시오 플라스틱 접시, 격자 정전 그들에 게 매력 있을 것입니다 하 고 붙어 될 요리.</li>
	</ol></li> <li>모든 치료에 대 한 반복. TEM으로 관찰 하기 전에 건조 하룻밤 desiccator 격자와 페 트리 접시 반쪽 장소.</li>
	<li>상담 각 기관에서 현미경 시설 준비 격자 관찰에 관한. 일부 시설 허용 그들의 시설의 운영에 관한 훈련을 사용자 &#39; s 악기. 설치 및 특정 현미경의 관찰에 대 한 특정 세부 정보는 beyond이이 글의 범위.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

프로토콜 및 여기에 설명 된 기술을 인간의 노로바이러스 capsid 무결성/기능을 평가 하는 수단을 제공 합니다. 이러한 방법은 기계적 통찰력 비활성화는 바이러스에 대 한 치료의 효과 얻기 위해 사용할 수 있습니다 그리고 잠재적으로 더 전통적인 비활성화 평가 방법 RT 정량 또는 상 패 분석 결과 등을 보충할 수 있다. 예를 들어, 혼자 패 분석 실험에 의해 화학적 또는 물리적 비활성화의 평가 바이러스 비활성화의 정도의 측정만 하지 그 비활성화의 기본 메커니즘을 제공합니다. 또한, 바이러스 집계 titer의 과소 발생 하 고 따라서 치료 효능30을 대 평가 수 있습니다. 이러한 방법을 더 노로바이러스 capsid의 무결성에 대 한 치료의 효과 대 한 정보를 제공 하 여 이러한 연구를 알릴 수 있습니다. 최근, 두 생체 외에서 (세포 배양) 경작 방법 인간의 노로바이러스에 대 한 보고5,<sup class="x...

인간의 노로바이러스는 상당한 공중 보건 부담에 대 한 세계적으로, 대략 685 백만 질병 및 212,000의 죽음을 일으키는 매년1, 수십억 달러2,3의 비용에. 오늘, 노로바이러스 검출 및 정량화 게놈 증폭 및 리간드 기반 플랫폼 포함 됩니다. 이전은 일반적으로 선호 더 민감한, 양적 정보를 제공 하는 거짓 긍정적인 결과4의 일반적으로 낮은 위험이 있다. 가장 일반적인 노로바이러스 검출 및 정량화 게놈 증폭 기술은 역전사 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량) 이다. 때문에 대상 인간의 노로바이러스 게놈의 작은 세그먼트를 증폭, RT-정량 혼자는 감염 사이 차별의 수와 비 전염 성 입자, 무료 게놈 RNA로 손상 capsids 게놈를 포함 하 고와 capsids 치명적 유전자 돌연변이 잘립니다 여전히 실시간 정량 Pcr에 의해 증폭 될 수 있습니다. 두 가지 새로운 체 외에서 재배 방법을 인간 노로바이러스5,6 최근에 보고 되었다, 그러나 둘 다 여전히 바이러스 정량화에 대 한 실시간 정량에 의존 하 고는 아직 일상적인 임상/환경에 대 한 실현 방법 인간의 noroviruses에 대 한 테스트. 따라서, 실시간 정량 임상/환경 테스트에 대 한 황금 표준 남아 있습니다.
다른 시험관에 방법 더 나은 노로바이러스 입자의 infectivity 상태를 추정 하기 위해에서 개발 되었습니다. 이러한 메서드는 일반적으로 노로바이러스 capsid의 무결성 및 게놈 무결성 평가로 분류할 수 있습니다. 전 방식은 더 많은 인기입니다. 일반적으로 사용 되는 방법은 이전 바이러스 성 게놈 RNA의 추출 RNase 전처리 인데이 바이러스 성 입자를 그대로 유지 하지만 호스트 수용 체/공동-요인, 바인딩할 능력 부족 뿐만 아니라가지고 심각 하 게 변이 된 바이러스 성 입자에 대 한 고려 하지 않습니다 또는 잘린 또는 소폭 손상 유전자7. Capsid 무결성 또한 평가 될 수 있습니다 인간의 노로바이러스 공동-receptor/공동-요인, 탄수화물에 바인딩할 바이러스의 능력에 따라 histo 혈액 그룹 항 원 (HBGAs)로 알려진. HBGAs는 glycoproteins 또는 glycolipids (중 여러 다른 조직)의 일환으로 호스트 장 상피 세포에 존재 하 고 타 액 같은 체액에 분 비 될 수 있습니다. 그들의 표면에 HBGA 같은 물질을 포함 하는 장 박테리아도 인간의 노로바이러스8,,910, 바인딩할 표시 되었습니다 그리고 그런 상호 작용 노로바이러스 감염5를 홍보 수 있습니다. HBGA 바인딩을 활용의 기본 개념은 세포를 감염 바이러스 성 입자는 상 상속 수용 체/공동-factor를 바인딩 수만 가능할. 여러 연구 제안 구슬 기반 HBGA 바인딩 선행 하는 핵 산 증폭 infectivity 차별11,12,,1314, 유망한 방법입니다. 15,16. HBGAs에 대 한 주요 도전이 이다 단일 HBGA 형식이 없으므로 모든 인간의 노로바이러스 genotypes을 바인딩할 수 있습니다. 이 해결 하기 위해 돼지 위 mucin, HBGAs를 포함 하는 합성, 일관성, 그리고 비용 절감된의 용이성을 위하여 순화 HBGA 탄수화물 대신 사용 되었습니다.
무어 그 외 여러분 에 의해 최근 간행물 17 인간 노로바이러스 capsid 무결성을 추정 하기 위한 새로운 기술 세트를 소개 했다. HBGAs, 무어 외. 대신 17 광범위 하 게 반응 핵 산 aptamer (M6-2)18 및 열 처리 GII.4 시드니 노로바이러스 capsids 바이러스 같은 입자 (VLPs)를 광범위 하 게 반응 단일 클론 항 체 (NS14)19 바인딩을 조사 하 고이 비교 합성 HBGAs binding입니다. 핵 산 aptamers는 짧은 (20 ~ 80 nt) 단일 좌초 핵 산 (ssDNA 또는 RNA) 순서 결과로 고유한 3 차원 구조로 이동 하 고 바인딩 대상. 왜냐하면 그들은 핵 산, 그들은 더 적은 비용; 쉽게 화학적 합성, 정제, 수정; 고 열에 안정. Aptamers noroviruses에 대 한 생성의 몇 가지 보고서 존재, 그들 중 일부와 함께 다양 한 변종18,20,,2122광범위 한 반응성을 보여주는. 예를 들어, 무어 외. 17 그 aptamer M6 2 순화, 조립 인간의 노로바이러스 capsids (VLPs)에 바인딩된와 마찬가지로 HBGA에 대 한 더 높은 순서 (예를 들어, 2 차 및 3 차) 단백질 구조를 유지 하기 위해 바이러스 성 capsid에 대 한 의존도에 행동 시연 발생 하는 바인딩. 다른 한편으로, 노로바이러스 VLP 바인딩 항 체의 상당한 비율이 NS14 후 남아 capsids 변성 완전히 했다. 노로바이러스 바인딩 무어 외에 의해 연구에서의 평가 17 이루어졌다 aptamers 항 체 대신 사용 하는 예외와 유사한 ELISA, 간단 하 고, 플레이트 기반 메서드를 사용 하 (따라서 메서드가 호출 ELASA). 이 높은 처리량 실험적인 방법 노로바이러스 capsid, 물리적 또는 화학적 스트레스에 노출 되 면 바이러스 성 비활성화의 메커니즘을 이해 하기 위한 귀중 한 작품에 다른 처리의 효과 평가 하기 위해 사용 되었다. 그러나,이 방법은 하나의 단점은 낮은 감도 일반적인 바인딩 aptamers에 의해 일으키는 원인이 되는 높은 수준에서 매트릭스 관련 오염 물질에 대 한 참을성의 부족입니다.
무어 외. 17 열 처리에 대 한 응답에서 바이러스 성 입자의 집계 모니터링 하 다른 방법, 동적 빛 산란 (DL)을 사용. DL은 일반적으로 나노 정지의 크기를 평가 하 고 단백질23,24 및 바이러스25,,2627확장 되었습니다. 솔루션에서 입자에 의해 뿌려 진 빛의 강도 확산 계수 그리고 확고 공식을 사용 하 여 입자 직경의 계산을 허용 하는 입자 크기의 기능으로 변동. DLS 기술은 분산 된 바이러스, 개별 capsid 단백질 또는 이합체, 크기27에 따라 바이러스 집계의 검출을 허용 하는 나노 스케일으로 분산 된 입자의 유체역학 직경을 구분할 수 있습니다. 바이러스 집계, 입자 크기의 증가 의해 표시 나타내는 capsid 무결성의 손실입니다. capsid 변성 및 구조 중단, 소수 성 잔류물 노출 되 고 함께 집계를 형성 하는 입자를 일으킬. DL은 지정된 치료 또는 실시간으로17,28집계의 활동 후 입자 크기를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 방법은 솔루션에서 capsid 행동의 관측을 허용의 이점이 있다 하지만 필요한 정화 capsid의 높은 농도 자연 상태에서 바이러스의 완전히 대표 하지 않을 수 있습니다.
마지막 방법은 무어 외 활용 17 전송 전자 현미경 (TEM) 했다. 이 방법은 감도 부족 하 고 양적 데이터를 생성 하지 않습니다, 하지만 그것은 바이러스 성 capsid 구조에 다른 처리의 효과의 시각화 수 있습니다. 비록 아직 임상/환경 설정에 대 한 좋지 않은, 조합에서 이러한 방법의 사용은 인간의 노로바이러스 비활성화 이해에 중요 합니다. 이 문서의 목적은 플레이트 기반 바인딩 분석 결과 (ELASA), DL에 대 한 깊이 있는 프로토콜을 제공 하 고 가장 준비 방법 하는 데 사용 capsid에 치료 효과의 맥락에서 노로바이러스 capsid에 열 치료의 효과 조사 무결성 무어 외 에 제시 17.

<table><tbody><tr><td>고차 노로바이러스 캡시드 구조의 손실 평가를 위한 Plate-based binding assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well, medium-binding polystyrene EIA plate</td><td>Fisher (Costar)</td><td>07-200-36</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate용 뚜껑</td><td>Thermo Fisher</td><td>3098</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin film (Parafilm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (산도 7.2)</td><td>Life Technologies</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>폴리소르베이트 20</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS(pH 7.2) + 0.05% 폴리소르베이트 20</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> 정제<tr><td>, 조립된 인간 노로바이러스 GII.4 캡시드</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>개별 0.2ml PCR 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-154G</td><td></td></tr><tr><td>2 열순환기</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>탁상용 미니 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>탈지 우유 고형분</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0031B</td><td></td></tr><tr><td>합성 조직혈액형 A형 이당류, 비오틴화</td><td>글리코테크</td><td>01-017</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 압타머 M6-2 (재고 농도 100 &마이크로; M: 뉴클레아제가 없는 물): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3'</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), 우리는 Life Technologies SNN2004</td><td>Life Technologies</td><td>SNN2004</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 기질, 실온</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>1 M phosphoric acid</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader를 사용합니다. 읽을 수 있는 450nm</td><td>Tecan</td><td>Infinite m200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>Comments<</td></tr><tr><td>strong>Analysis of Plate-Based Assay Results</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel or similar program</td><td>N/</td><td></td><td>A 해당 없음</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering Experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer ZSP 또는 이와 유사한 입자 크기 분석 기기</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientifc</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>Hellma</td><td>104-002-10-40</td><td></td></tr><tr><td>소량 일회용 큐벳 (VLP 사용을 줄이기 위해)</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN0040</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Transmission 전자 현미경 샘플 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탄소 지지 필름이 있는 니켈 전자 현미경 그리드</td><td>Ladd Research</td><td>10880-100</td><td></td></tr><tr><td>자동 폐쇄 역 전자 현미경 핀셋</td><td>Ted Pella</td><td>5372-NM</td><td></td></tr><tr><td>정성 여과지</td><td>Sigma-Aldrich (Whatman)</td><td>WHA1002055</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455743</td><td></td></tr><tr><td>100 mM 재고 HEPES 용액 (pH 7.2)</td> <td>N/A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>2 % 우라닐 아세테이트</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

대체 체 외에 바이러스 성 capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

인간의 노로바이러스 exacts 상당한 공중 보건 및 경제적 손실을 전세계. 생체 외에서 신흥 재배 발전 적용 되지 않습니다 아직 일상적인 바이러스의 검출에 대 한. 현재 탐지 및 정량화 기술, 핵 산 증폭에 주로 의존 하는 비 전염 성 바이러스 성 입자에서 전염 성 차별을 하지 않습니다. 이 문서의 목적은 최근 바이러스 성 입자의 infectivity 상태에 대 한 정보를 더 얻기 위해서는 함께 사용 되는 기술 발전에 구체적인 내용을 제시 하. 1 개의 기술은 capsids에 노로바이러스 ssDNA aptamer의 바인딩을 평가 포함 됩니다. Aptamers 쉽게 합성 하 고, 수정 되 고의 이점이 있고 저렴 하 고 안정적 이다. 또 다른 기술, 동적 빛 산란 (DL) 솔루션에서 capsid 행동 관찰의 이점이 있다. 전자 현미경 검사 법은 바이러스 성 capsids의 구조적 무결성의 시각화에 대 한 수 있습니다. 비록 유망한, 각 기술, 일반적인 aptamer 바인딩 같은 긍정적으로 위탁 한 분자를 샘플 행렬에서 DL에 대 한 정화 capsid의 요구와 가난한 감도 전자 현미경 검사 법에 대 한 몇 가지 단점이 있다. 그럼에도 불구 하 고, 조합에서 이러한 기술을 사용 하는 생산 데이터의 본문 보다 포괄적인 정보를를 제공 합니다 노로바이러스 capsid 무결성 infectivity의 정확한 평가 위해 필수적인 정보를 유추 하는 데 사용할 수 있습니다. 비활성화 방법 또는 바이러스 탐지의 해석입니다. 이 문서는 이러한 방법을 사용 하 여 인간의 노로바이러스 감염 입자를 차별에 대 한 프로토콜을 제공 합니다.

인간의 노로바이러스 GII.4 시드니 capsids (VLPs)의 구조적 무결성 무어 외 에 의해 발표로 여러 가지 새로운 방법을 사용 하 여 평가 했다 17. 먼저, 실험에서 행 해졌다는 상 상속 수용 체/공동 factor (HBGA) 또는 바인딩 ssDNA aptamer (M6-2)을 그들의 능력의 기능으로는 capsids의 무결성 비교 (그림 1). 표시 되는 결과 이전 무어 외. 에 의해 제시 된 17, aptamer M6-2-capsid 바인딩 동작의 다양 한 노출 시간에 대 한 68 ° C 열 처리에 노출 시 바이러스 HBGA 바인딩 비슷 했다 입증 하 고. 동안 HBGA 바인딩 신호 손실 약간 이전 보다 aptamer M6-2의 m 6-2 VLPs 65 ° C에 드러낸 후에 다양 한 시간에...

일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

이러한 방법들의 전반적인 목적은 처리가 인간 노로바이러스 캡시드의 감염력이나 무결성에 미치는 영향에 대해 더 깊은 통찰을 얻는 것입니다. 이 방법은 비외피 바이러스 불활성화 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 특정 처리 후에 바이러스 캡시드의 세포 감염 능력이 어떻게 변화하는지와 같은 질문입니다.이러한 방법들의 주요 장점은 특정 처리가 바이러스에 작용하는 방식에 대해 추가적인 기전적 통찰을 제공할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 인간 노로바이러스 불활성화 전략에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 리노바이러스나 A형 간염 바이러스와 같은 다른 비엔벨로프 바이러스에도 적용될 가능성이 있습니다.먼저, 캡시드로 조립된 정제된 인간 노로바이러스 주요 캡시드 단백질을 1X phosphate buffered saline에 50 µg/mL 농도로 희석하십시오. 캡이 있는 개별 PCR 튜브에 사용하는 최대 부피는 15 µL입니다.튜브에 최소 600 nanograms의 캡시드가 포함되어 있는지, 그리고 처리 리간드 조합당 600 nanograms의 캡시드가 있는지 확인하십시오. 다음으로, 열 순환기를 원하는 열처리 온도로 예열하십시오. 그런 다음, 즉각적인 냉각을 위해 추가 열 순환기를 4 °C로 예열하십시오.캡시드 용액이 들어있는 튜브를 써모사이클러에 넣고 원하는 시간 동안 반응시킵니다. 가열 후, 즉시 튜브를 4 °C로 사전 냉각된 사이클러로 옮겨 5분 동안 유지합니다. 원심분리기로 튜브를 짧게 스핀 다운하여 모든 액적이 튜브 바닥에 모이게 합니다.처리된 캡시드 용액과 PBS를 3 µg/mL로 희석합니다. 희석된 처리 캡시드 용액이 최소 200 µL 확보되었는지 확인하십시오. 다음으로, 각 웰에 캡시드 용액 100 µL를 분주하며, 처리당 최소 2개의 웰을 확보하십시오. 또한, 각 리간드에 대해 PBS 100 µL가 담긴 대조군 웰 2개를 포함합니다. 이는 분석의 배경 흡광도를 제공합니다. 플레이트에 덮개를 덮고 가장자리를 파라핀 필름으로 밀봉하여 증발을 줄입니다. 플레이트를 4 °C의 진탕 인큐베이터에서 하룻밤 동안 두거나 실온에서 2시간 동안 둡니다.배양 후, 처리된 캡시드 용액을 플레이트에서 제거합니다. 그런 다음, 웰당 200 µL의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 실온에서 2시간 동안 또는 4 °C에서 밀봉하여 하룻밤 동안 배양합니다.그동안 비오틴화된 압타머(biotinylate

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

우리는 감염된 세포로부터 고순도 herpesvirus nucleocapsid DNA를 분리하는 과정을 설명합니다. 솔루션에서 촬영한 마지막 DNA는 이상적으로 높은 처리량 시퀀싱, 높은 충실도 PCR 반응, 새로운 바이러스 recombinants 생산 transfections에 적합하고, 높은 집중력과 순결입니다.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Uncoating는 HIV - 1 수명주기의 초기 단계에 필수적인 단계이며 capsid 쉘의 해체와 바이러스 ribonucleoprotein 복합 (vRNP)의 출시로 정의됩니다. 여기, 우리는 HIV - 1 virions에서 그대로 코어를 분리 및 그들의 uncoating을 quantifying 기술을...

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

를 통해 식물 세포에 여러 바이러스 구성 요소의 배포를 동기화하는 간단하고 효율적이며 강력한...

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서</em바이러스 조립 유학을위한> 접근법

TEM용으로 설계된 탄소 지지막(니켈) 그리드를 준비한다.

투과전자현미경을 이용한 열처리된 바이러스 캡시드의 시각화

출처: Gao, Y., et al. 호흡기 세포융합 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드 생성 및 조립. J. Vis. Exp. (2021)본 영상에서는 정제된 RNA-free 뉴클레오단백질-인단백질 복합체로부터 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드를 시험관 내(in vitro)에서 조립하는 방법과 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 정제 과정, 그리고 조립된 입자 내의 전체 길이 바이러스 RNA 검증 과정을 보여줍니다.

바이러스 뉴클레오캡시드 유사 입자의 인비트로(In Vitro) 재구성 및 정제

여기에서는 새로운 항바이러스제를 식별하고 평가하기 위해 바이러스 진입의 특정 단계를 검사하는 프로토콜을 제시합니다.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

아레나바이러스 수명 주기의 첫 번째 단계는 바이러스 입자를 숙주 세포에 부착하는 것입니다. 아레나바이러스 부착 이벤트의 초고감도 검출 및 정량화를 위한 정량적 (q)RT-PCR 기반 분석을 보고합니다.

Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석

바이러스가 숙주 세포에 들어가는 동안 인플루엔자 A 바이러스 코어를 분해하는 것은 다단계 과정입니다. 우리는 바이러스 비코팅의 초기 단계를 분석하기 위한 시험관 내 방법을 설명합니다. 이 접근 방식에서는 속도 구배 원심분리를 사용하여 정의된 조건에서 코팅 해제를 시작하는 단계를 생화학적으로 해부합니다.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 메서드는 이전 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에 의해 선택 된 셀에 전자 현미경 (EM)를 통해 바이러스-유도 된 세포내 구조 이미지에 적용 됩니다. LM 및 EM 바이러스-호스트 상호 작용의 통합된 보기를 달성 하기 위해 하이브리드 이미징 접근으로 결합 됩니다.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

학습하세요 인간 노로바이러스 캡시드 무결성 평가를 위한 앱타머 결합, 동적광산란 및 투과전자현미경 기법을 활용한 바이러스학 연구 방법론입니다.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

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