대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

이러한 방법의 전반적인 목표는 인간 노로바이러스 캡시드의 감염성 또는 무결성에 대한 치료의 효과에 대한 추가 통찰력을 얻는 것입니다. 이 방법은 비외피형 바이러스 불활성화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 주어진 치료 후 세포를 감염시키는 바이러스 캡시드의 능력에 무슨 일이 일어나고 있는지.

이러한 방법의 주요 장점은 바이러스에 대한 주어진 치료법의 작용에 대한 추가적인 기계론적 통찰력을 제공할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 인간 노로바이러스 불활성화 전략에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 리노바이러스 또는 간 A.To 염과 같은 다른 비외피형 바이러스에도 적용할 수 있는 잠재력이 있으며, 1X 인산염 완충 식염수에서 밀리리터당 50마이크로그램으로 캡시드로 조립된 묽게 정제된 인간 노로바이러스 주요 캡시드 단백질을 시작할 수 있습니다. 개별 캡이 있는 PCR 튜브에 최대 15마이크로리터의 용량을 사용하십시오.

튜브에 최소 600나노그램의 캡시드가 포함되어 있고 처리 리간드 조합당 600나노그램의 캡시드가 있는지 확인합니다. 다음으로, thermocycler를 원하는 열처리로 예열합니다. 그런 다음 즉각적인 냉각을 위해 추가 열순환기를 섭씨 4도로 예열합니다.

캡시드 용액이 있는 튜브를 원하는 시간 동안 thermocycler에 추가합니다. 가열 후 즉시 튜브를 예냉각된 섭씨 4도의 사이클러에 5분 동안 옮깁니다. 원심분리기의 튜브를 짧게 돌려 모든 물방울을 튜브 바닥으로 가져옵니다.

처리된 캡시드 용액과 PBS를 밀리리터당 3마이크로그램으로 희석합니다. 최소 200마이크로리터의 희석된 처리된 캡시드가 있는지 확인하십시오. 다음으로, 각 웰에 100마이크로리터의 캡시드 용액을 도포하여 처리당 최소 2개의 웰이 있는지 확인합니다.

또한 각 리간드에 대해 100마이크로리터의 PBS가 있는 두 개의 제어 웰을 포함합니다. 이것은 분석의 배경 흡광도를 제공합니다. 접시를 뚜껑으로 덮고 가장자리를 파라핀 필름으로 밀봉하여 증발을 줄입니다.

접시를 섭씨 4도의 진탕 인큐베이터에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 그대로 두십시오. 배양 후 플레이트에서 처리된 캡시드 용액을 제거합니다. 그런 다음 차단 버퍼의 웰당 200마이크로리터를 추가합니다.

실온에서 2시간 동안 배양하거나 밤새 섭씨 4도에서 밀봉하여 배양합니다. 한편, 비오틴화된 압타머를 뉴클레아제가 없는 물에서 1마이크로몰로 희석합니다. 각 처리에 대해 총 200마이크로리터에 대한 충분한 용액이 있는지 확인하십시오.

또한 선택한 비오틴화된 HPGA를 차단 완충액에서 밀리리터당 30마이크로리터로 희석합니다. 다시 말하지만, 각 처리에 대해 총 200마이크로리터의 용액에 충분한 용액이 있는지 확인하십시오. 배양 후 차단 버퍼를 제거하고 PBST 웰당 200마이크로리터로 플레이트를 세 번 세척합니다.

멸균된 종이 타월로 접시를 거꾸로 두드려 잔여 수분을 말리십시오. 다음으로, 리간드 결합 용액의 웰당 100마이크로리터에서 열처리 리간드 조합당 2개의 웰이 있도록 하고, 실온에서 1시간 동안 약 60RPM의 오비탈 셰이커에서 커버된 플레이트를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웰을 세척한 후 웰당 100마이크로리터, 밀리리터당 0.2마이크로그램의 스트렙타비딘, 홀스래디시 퍼록시다제 및 PBS를 추가합니다.

웰을 다시 세척하기 전에 오비탈 셰이커에서 부드럽게 흔들어 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 한 번 세척 한 후 TMB 기질 웰 당 100 마이크로 리터를 추가하고 5-15 분 동안 색상이 발현되도록합니다. 우물의 색깔을 관찰하십시오.

복제 플레이트 간에 동일한 시간 동안 일관되게 현상해야 하며 사용된 플레이트 리더의 흡광도 범위를 알고 있어야 합니다. 1 몰 인산의 웰 당 100 마이크로 리터로 반응의 진행을 중지하십시오. 즉시 450나노미터에서 플레이트를 읽습니다.

텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 DLS 기기 소프트웨어에서 새로운 크기의 표준 작동 절차를 생성합니다. 그런 다음 소프트웨어 내에서 녹색 실행 화살표를 선택하고 샘플의 이름을 지정합니다. 열처리된 바이러스 유사 입자 또는 VLP를 1X PBS에 1에서 10까지 희석하여 최종 농도를 밀리리터당 5마이크로그램으로 만듭니다.

그런 다음 1미크론 기공 크기로 샘플을 필터링하여 먼지 입자를 제거합니다. DLS는 큰 입자가 작은 입자보다 훨씬 더 많은 빛을 산란시키기 때문에 먼지에 매우 민감합니다. 희석된 VLP 50마이크로리터를 소량의 일회용 큐벳으로 옮깁니다.

큐벳을 s에 삽입합니다.amp기기의 챔버. 실행을 시작하고 correlogram 누적 피팅 및 전문가 조언 탭을 사용하여 데이터 품질을 평가합니다. 실행하는 동안 인덱스 값의 폴리 분산이 품질 측정을 나타내는 0.3 미만인지 확인합니다.

멀티뷰 탭에서 상관 계수가 일정하고 짧은 시간에 1을 넘지 않고 나중에 입자 크기의 특성인 0에서 급격히 떨어지는지 확인합니다. 전문가 조언 탭을 사용하여 측정 중 데이터 품질에 대한 피드백을 받을 수 있습니다. 측정이 완료된 후 인덱스 값의 폴리 분산이 0.3 미만인 경우 다시 확인하십시오.

누적 맞춤 라인이 누적 맞춤 탭의 데이터 포인트를 밀접하게 따르는지 확인합니다.텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 DLS 기기 소프트웨어에서 새 크기 표준 작동 절차를 만듭니다. 소프트웨어 내에서 실행 화살표를 선택하여 새 샘플을 열고 이름을 지정하고 기기가 온도 평형에 도달하도록 합니다.

VLP 현탁액을 소량의 석영 큐벳으로 옮기고 기포와 피펫을 큐벳 벽에 천천히 대지 마십시오. 기기가 온도 평형에 도달한 후 큐벳을 시료 챔버에 삽입합니다. 샘플 온도가 평형을 이룰 때까지 10초 동안 기다린 후 실행을 시작하고 동시에 타이머를 시작합니다.

첫 번째 측정이 끝나면 타이머를 중지합니다. 이 시간을 첫 번째 시점으로 삼으십시오. 소프트웨어에 의해 기록된 측정 시간에서 후속 시점을 얻습니다.

10밀리몰 힙, pH 7.4를 PBS로 대체하는 것을 제외하고는 이전과 같이 열처리를 수행하고 처리 후 캡시드를 더 이상 희석하지 마십시오. 다음으로, 처리된 캡시드 용액 15마이크로리터 전체를 파라핀 필름에 한 방울 떨어뜨립니다. 핀셋으로 그리드 가장자리를 잡고 가장자리를 닫아 그리드를 잡고 처리된 용액 방울 위에 그리드 탄소 면이 아래를 향하게 놓습니다.

캡시드가 그리드에 부착될 수 있도록 그리드를 10분 동안 배양합니다. 캡시드 제제의 순도에 따라, 처리된 캡시드 방울 뒤에 일렬로 배치된 10-15마이크로리터 방울 형태의 힙 용액 세척을 추가합니다. 10분 후 물방울이 있는 그리드를 선택합니다.

격자를 여과지 조각에 거의 수직으로 배치하여 물방울을 흡수합니다. 그런 다음 그리드를 사용하여 10-15마이크로리터 힙 버퍼의 방울을 선택하고 30초 동안 유지합니다. 30초 동안 세탁한 후 다른 여과지로 흡수합니다.

다음으로, 2% 우라닐 아세테이트 용액의 15마이크로리터 방울을 빈 공간의 파라핀 필름에 놓습니다. 그리드로 우라닐 아세테이트 방울을 집어 45초 동안 유지합니다. 그런 다음 우라닐 아세테이트를 심지로 제거하여 대부분의 용액을 제거하십시오.

그리드 탄소 면이 위로 향하게 하여 필터 종이 위에 놓고 그리드가 핀셋의 수분에 달라붙지 않도록 주의합니다. 그런 다음 그리드가 있는 여과지를 열린 유리 페트리 접시에 놓습니다. 모든 치료에 대해 이 과정을 반복한 후, TEM으로 관찰하기 전에 그리드와 함께 페트리 접시 반쪽을 데시케이터에 밤새 넣어 건조시킵니다.

다음 그래프는 섭씨 68도에서 처리했을 때 시간이 지남에 따라 인간 노로바이러스 캡시드의 결합 능력이 감소하는 것을 보여줍니다. 보시다시피 HPGA 바인딩은 완전히 사라지는 첫 번째 신호입니다. 이 시점에서, 용액에 있는 대다수의 캡시드는 숙주 세포 HPGA에 결합하는 능력을 상실하여 세포에 내재화될 수 없다고 가정합니다.

Aptamer 결합은 HBGA의 결합과 유사하지만 신호를 제거하려면 약간 더 많은 열처리가 필요합니다. 여기에 표시된 것은 양질의 데이터를 대표하는 DLS 상관 계수 곡선입니다. 0에 가까운 시간에서 correlogram은 1에 가깝지만 1보다 작은 값으로 일정합니다.

그런 다음 입자 크기의 특징인 한 번에 0으로 급격히 떨어집니다. 이 실험의 크기 결과는 신뢰할 수 있습니다. 반대로, 이 상관 계수 곡선은 품질이 낮은 데이터를 대표합니다.

correlogram은 1보다 큰 값에서 시작하여 점차 0으로 떨어집니다. 이 실험의 결과는 사용해서는 안 됩니다. 여기서, 입자 크기 데이터는 약 20분 후에 형성되는 슈퍼 응집체와 함께 섭씨 68도에서 처리된 캡시드에 대한 명확한 응집 프로파일을 보여줍니다.

슈퍼 응집이 발생하는 시간은 해당 처리에 대한 VLP의 감수성의 특성입니다. 이 그림은 인간 노로바이러스 캡시드의 열처리에 대한 TEM 결과를 시각화한 것입니다. 여기에서 캡시드는 왼쪽에서 오른쪽으로 섭씨 60도에서 80도에서 처리되고 있었습니다.

보시다시피, 캡시드 형태는 캡시드가 응집되고 변성됨에 따라 처리에 따라 명확하게 변화합니다. 섭씨 68도에서 0분에서 25분 동안 처리된 캡시드에서도 유사한 현상이 관찰됩니다. 이러한 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 1시간에서 24시간 이내에 완료할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 식품 바이러스학 분야의 연구자들이 인간 노로바이러스의 캡시드에 대한 불활성화의 메커니즘과 효과를 탐구할 수 있는 추가적인 길을 제공했습니다. 이 절차에 따라 RNase 전처리를 포함하거나 포함하지 않은 실시간 RT-PCR, 바이러스 캡시드의 STS 페이지 및 배양 가능한 대리 바이러스를 사용한 플라크 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 주어진 치료 후 바이러스 감소에 대한 보다 완전한 전반적인 관점을 얻을 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 리간드 결합, 동적 광 산란 및 투과 전자 현미경을 활용하는 방법을 잘 이해하여 인간 노로바이러스 캡시드에 대한 불활성화 처리의 효과에 대한 추가적인 기계론적 통찰력을 얻을 수 있습니다.

사용된 일부 시약으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비를 착용하고 실험실 안전 모범 사례를 따르는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.