Name: 유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 배우세요 삼중 형광 리포터 백신바이러스를 이용하여 화학처리가 영향을 미치는 바이러스 유전자 발현 단계를 실시간으로 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 항바이러스 약물 개발에 활용됩니다.

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우리는 ST-246를 제공 SIGA 기술 (코 밸리 스, 오리건) 감사합니다. DKR는 보스턴 대학 (5T32AI 7309)에 면​​역학의 NIH 교육 교부금에 의해 지원되었다. 이 작품은 P41 086180에 의해 부분적으로 지원되었다, NIH RO1AI1096159-01, 및 RO3 (JHC에).

1. 플레이트 세포 <ol><li> 판에서 HeLa 세포를 떼어 놓다 약 2.0 × 10 5 세포 / ml로 성장 배지 (DMEM, 2 MM의 L-과잉, 10 % FBS)에 희석. 검은 벽, 분명 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 (20,000 세포 / 웰)에 100 μL / 잘 분배. </li><li> + 5 % CO 2 37 ° C 배양기에 합류 할 때까지 24 시간 동안 세포를 품어. </li></ol> 2. 세포를 감염 <ol><li> 바이러스를 희석하고 세포를 감염. <ol><li> 해동 TrpV (트리플 바이러스, 조기 금성, 중급 mCherry, 늦은 TagBFP)과 PLV (발기인없는 비너스) 형광 바이러스와 5 분 동안 초음파를 사용하여 해리하는. 또한, 원유 바이러스 주식 감염 매체에 0.25 ㎎ / ㎖ 트립신 1:1로 혼합하여 30 분 동안 37 ° C에서 배양 할 수있다. </li><li> 37 ° C 감염 미디어 (DMEM, 2 MM의 L-과잉, 2 % FBS)에서 원유 바이러스 주식을 희석. 높은 MOI 감염 (10 PFU / 셀)의 경우, PFU는 / ㎖ 5 × 4 가정 1.0 × 10 7 바이러스 주식을 희석잘 세포 / 50 μL의 접종 볼륨. TrpV 각각 처리하고 각 치료에 특정 배경 형광을 설명하는 PLV와 같은 치료를위한 또 다른 3 복제 우물 3 복제 우물을 감염에 대한 계획. </li><li> 감염 매체에 50 μL / 잘 희석 바이러스를 추가하여 우물을 감염. 이것은 시간 = 0 시간 게시물 감염 (0 HPI)로 정의된다. </li></ol></li><li> 감염 매체에 원하는 치료 화합물을 희석. 모든 치료에 대한 하나의 배 마스터 혼합 희석이 만든 우물 (50 ㎕를 각각 여섯 96 우물에 대한 예를 들어, 350 ㎕의 총 부피) 복제에 적용해야합니다. <ol><li> 감염 매체로 실험 화합물을 희석. </li><li> 감염 매체로 차량 제어 용매 (예를 들어, PBS, DMSO)를 희석. 참고 : 실험 화합물 (예를 들면 적용로 IBT 재고가 DMSO로 만든 최종 concentratio에 사용하는 경우 차량 제어 용매 비슷한 최종 농도가 사용되어야한다1 μL의 NS는 /​​ ㎖, 다음 차량 제어로 1 μL / ㎖)에 혼자 DMSO를 사용합니다. </li><li> 감염 매체로 제어 화합물을 희석. 추천 제어 화합물은 다음을 포함한다 : 3.6 μM (1 ㎍ / ㎖) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (ARAC), 50 μM (11.7 ㎍ / ㎖) 이사 틴 β-thiosemicarbazone (IBT), 60 μM (50 ㎍ / ㎖) 리팜피신, 또는 5 μM (1.9 ㎍ / ㎖) ST-246 8,15,16. 기대 효과에 대한 대표 결과를 참조하십시오. 참고 :이가 아니라 이미 볼륨에 1:1 비율로 첨가되어 있기 때문에 두 배 (2 배) 원하는 최종 농도를 희석합니다. </li></ol></li><li> 즉시 바이러스를 첨가 한 후, 단계 2.2에 희석 원하는대로 처리 및 컨트롤을 포함하는 50 ㎕의 감염 미디어를 추가 할 수 있습니다. 참고 : 초기 단계 표현하기 전에 억제를위한 분석 실험하기 위해, 화합물 (들) 중 하나를 희석 바이러스 접종 물 (단계 2.1.2)에 직접 추가 할 수 있습니다 또는 (단계 2.1.3 전) 감염하기 전에 세포를 호스트 할 수 있습니다. </li><li> 37 &amp; #에 6-24 시간을 품어176, C 배양기 + 5 % CO 2. </li></ol> 3. 셀 수정 <ol><li> 물론 이미 각 감염 미디어에 100 μL에게 8 % 파라 포름 알데히드를 첨가하여 세포를 고정합니다. 빛으로부터 보호 된 15 분 동안 실온에서 배양한다. 참고 :이 높은 역가 미디어는 이전의 고정 폐기물 접시에 직접 반전 경우 발생할 수있는 전염성 우두의 에어로졸을 방지하기 위해 직접 감염 미디어에 배 PFA (8 %)를 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> 폐기물 접시에 반전 판에 의해 정착을 제거합니다. </li><li> 실내 온도 PBS 100 μl를 추가합니다. </li><li> 광학적으로 명확한 접착 필름과 플레이트를 밀봉. 참고 : 바로 읽을 경우 플레이트가 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 분광 측정을 왜곡에서 응축을 방지하기 위해 읽기 전에 실온에 밀봉 판을 반환해야합니다. </li></ol> 4. 바이러스의 성장을 정량화 <ol><li> 엔드 포인트 mCherry 금성, 587:610에 대한 515:53​​0에서 형광 및 415:457 F를 측정또는 TagBFP (흥분 : 뉴 멕시코에있는 발광 파장). 네 측정은 각 채널에 최적화 된 게인 설정을 사용하여 잘 당 평균되어야한다. 주 : 해당 발광 파장이 플레이트 리더의 특정 모델 및 필터 특성에 따라 다를 수 있습니다. 이것은 각각의 채널에 대한 TrpV 및 PLV 간의 큰 차이가있는 점을 결정하는 발광 파장 스캔을 수행하여 경험적으로 결정될 수있다. </li><li> 실험의 비교를 용이하게하기 위해 원시 데이터를 정규화. <ol><li> 각 채널 복제 TrpV과 PLV 우물의 평균을 결정합니다. </li><li> 각 치료에 대한 평균 TrpV에 감염된 실험 측정에서 평균 PLV-감염 배경 측정을 뺍니다. </li><li> 물론 차량 전용 값함으로써 각각 배경 차감 값으로 나누어 정규화 데이터. </li><li> 실험을 여러 번, 분산 단방향 분석 (일방 ANOVA) 시험 및 체류 C 반복되면omparison 사후 테스트는 치료의 각각의 채널에 대한 차량 전용 처리에서 통계적으로 유의 한 차이를 반영하는 경우를 결정하기 위해 수행 될 수있다. </li></ol></li></ol> . 5 대체 프로토콜 : 운동 플레이트 분석 실험 <ol><li> 치료의 추가를 통해 모든 단계를 수행 (2.3 단계). </li><li> 플레이트 리더 실에서 접착 필름 및 장소 인감 플레이트는 37 ℃로 평형 참고 : 특별한주의가 과도한 세포 스트레스 및 응축을 방지하기 위해 37 ° C에서 지속적으로 번호판을 유지하기 위해주의해야합니다. 운동 분석을 위해, 5 % CO 2의 첨가없이 적당한 pH를 유지하도록 완충 매체 (중탄산 나트륨 및 HEPES)를 사용하는 것이 특히 중요하다. </li><li> 고정 플레이트 리더는 나중에 포인트의 포화를 방지하기 위해 수동으로 얻을 수 있습니다. 참고 : 정확한 이득 최적화는 유사한 조건 하에서 끝점 세이를 수행함으로써 획득 될 수있다. </li><li> 8-24 HPI에 대한 시간별 측정 값을 수집하고 시미를 사용하여 정상화엔드 포인트 분석에서와 같이 LAR 절차 (4.2 단계). </li><li> 개별 시점은 전술 종점 분석법으로 유사한 방법을 이용하여 통계적인 유의성을 분석 할 수있다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도하지 않으며 특허는 바이러스 나 검사 방법에 대해 보류중인되지 않습니다.

여기, 우리는 바이러스 복제의 재현, 실시간 피드백 조치를 제공하는 다단계 우두 기자 바이러스 (TrpV)의 실제 사용을 설명했다. 잘 정의 된 폭스 바이러스 억제제를 사용하여, 우리는 TrpV 각 억제제에 대한 행동의 이해 메커니즘에 부합하는 방식으로 응답하는 것을 보여줄 수 있었다. TrpV 바이러스는 바이러스 스테이지 진행에 대한 가장 포괄적 인 정보를 제공하고 있지만, 두 단계 (IREV, LREV) 및 단일 단계 (EV, IV, LV) 바이러스는 또한 최적의 단백질 폴딩을 활용, 유사하게 이용 될 수있다, 안정성, 금성의 형광 물질과 우수한 신호 대 잡음비. 이 프로토콜의 개념 증명 분석은 간단하고, 높은 처리량 플레이트 분석에서 알려진 폭스 바이러스 억제제에 의해 영향을 바이러스 성 유전자 발현의 단계를 식별의 가능성을 나타냅니다. 이 분석은 신속하고 종합적인 심사를 완료하도록 확장 할 수 있습니다알 수없는 화학 물...

전통적으로, 바이러스 발현 분자 생물학 기술 (예를 들면 북부 블로 팅, 웨스턴 블롯, 마이크로 어레이 하이브리드 등)를 사용하여 공부한다. 이러한 방법은 개인의 mRNA 또는 단백질의 발현 변화를 범주화에 대해 상세한 정보를 제공 할 수 있지만, 그들은 일반적으로 실시간 및 높은 처리량 프로세스에 순종하지 않다. 폭스 바이러스 작업을 할 때 형광 기반의 기자를 사용하여 다른 방식의 접근은 이전에 적용되었습니다; 그러나, 자신의 개발과 사용은 다양한 목적에 의해 동기 부여를하고있다. 몇 가지 이러한 방법은 재조합 바이러스 2,3의 선택을 위해 설계되었습니다. 이 기술은 적절한 결합 재조합 우두 클론에서 외래 DNA의 발현에 EGFP을 표현한다. 마찬가지로, 여러 우두 균주 안정적으로 용해 EGFP을 표현하거나 기본 우두 프로모터에서 표현 GFP - 태그 단백질은 널리 사용되어왔다. 이들은 일반 있습니다ically 바이러스 항목 및 복제 항체 기반의 중화 분석하는 동안, 화학 억제, 또는 항 바이러스 효과 4-6의 비교를 정량화하는 데 사용됩니다. 이 바이러스가 유용한 입증하는 동안, 그들은 하나 때문에 모호한 말 / 초기 바이러스 성 프로모터의 자신의 사용을 억제 포인트에 대한 자세한 정보를 제공 할 수있는 능력이 제한되어있다. 이전의 방법은 또한 차선 신호 대 잡음 특성 EGFP 단백질을 살린있다. 때문에 폭스 바이러스 복제 및 바이러스 유전자 발현의 실시간 변화를 분석 실험 할 수 기존 도구의 부족의 복잡성 때문에, 우리는 단일 및 다중 단계 기자 바이러스 7,8의 제품군을 개발했습니다. 이전의 출판물에서 설명한 바와 같이,이 바이러스는 감염 초기, 중간, 또는 늦은 단계 중 한 개, 두 개, 또는 네이티브 우두 프로모터로부터 3 스펙트럼 별개의 형광 단백질을 표현한다. 이 바이러스는 우리가 될 수형광 현미경을 사용하여 바이러스 복제 진행의 지표로 ED 그들은 높은 처리량 판과 리더를 기반으로 분석을위한 동등하게 적합하다. 이러한 바이러스는 동등한 역가 7에 도달하는 유사한 동역학으로 성장, 야생형 바이러스의 장소에서 사용하기 쉽다. 계획과 이러한 바이러스의 작성 중에 많은주의가 식 (금성, mCherry 및 TagBFP)의 변화에​​ 신속하게 피드백을 신뢰할 수있는 정량을 용이하게하기 위해 뛰어난 폴딩 효율 높은 신호 배경 특성이 형광을 선택에서 촬영했다. 또한, 바이러스 성 프로모터의 조합은 모호한 대조적으로, 고 충실도, 명확한 단계 특정 식 (C11R의 프로모터) 초기의 전체 범위에 대한 정보를 제공하고, 중간 (G8R 프로모터)와 후기 (F17R 프로모터) 유전자 발현을 생산하는 선택 하였다 일찍 / 늦게 발기인. 이러한 바이러스 INVE위한 도구로 사용할 수원형 폭스 바이러스, 우두 바이러스의 수명주기를 stigating. 대부분은 연구의 오랜 역사에도 불구하고 여전히 호스트 바이러스 상호 작용에 대한 알 수 없습니다. 우두는 면역하고 반목하는 호스트 중 많은 200 개 이상의 고유 한 단백질을 생산, 복잡합니다. 감염되면, 우두 바이러스는 즉시 초기 mRNA의 전사를 시작한다. 이는 비리 포장하는 동안 바이러스 게놈로드 및 후속 감염 될 때까지 일시 중지 된 상태로 유지 된 RNA 중합 효소 및 전사 인자에 의해 촉진된다. 이 초기의 표현은 주로 숙주 면역 시스템 (mRNA의 decapping, dsRNA에 격리 및 미끼 수용체 단백질뿐만 아니라 세포 사멸의 억제, 스트레스 반응,, 수신자, IL 및 NF-κB 신호)와 게놈 복제의 억제에 필요한 단백질을 생산한다. 조기 발현은 중간 표현에 필요한 전사 인자를 생성합니다. 중간 표현은 말기 전사 인자의 발현을 포함한다. 이표현 계단식 성숙한 우두 비리의 전체 어셈블리에 필요한 감염의 후반 단계 동안 구조 및 효소 바이러스 단백질의 생산에 이르게한다. 형광 기자 바이러스의 우리의 세트는 폭스 바이러스 생물학의 이해를 할 수있는 빠른 진행이 가능합니다. 바이러스학 분야에서 가장 일반적으로 시간이 많이 소요되는 방법 중 하나는 성장 분석이다. 이것은 일반적으로, 세포를 감염에 감염된 세포를 용균에 의해 처리, 수확 바이러스의 시리즈를 제정하고, 플라크의 분석에 의해 생성 된 바이러스 역가를 정량화 포함한다. 여기에 설명 된 리포터 바이러스를 사용하여 쉽게 정량과 병렬로 수행 수많은 치료 사이에 비교 될 수있는 바이러스 성장의 실시간 측정을 허용한다. 우리는 시약의이 세트는 약물 치료, RNAi의 K에 응답하여 바이러스의 유전자 발현의 변화를 확인하기위한 다양한 프로토콜에 사용될 예견nockdown, 또는 호스트 범위 제한. 이 방법은 그 구체적으로 정의 된 목표 단계에 대한 높은 처리량 항 바이러스 약물 스크린을 허용 이전에 사용할 수보다 더 큰 규모로 높은 콘텐츠 분석을 할 수 있습니다. 폭스 바이러스 감염을 방지하기 위해 다수의 잠재적 인 처리가 확인되었지만, 유일한 FDA는 폭스 바이러스 감염 치료를위한 효과적인 치료가 비 환식 포스 뉴 클레오 시드, 시도 포비 및 우두 면역 글로불린 9,10 치료입니다 승인했다. 1977 11 천연두의 박멸에도 불구하고, 폭스 바이러스는 인간의 건강 (12)에 큰 위협이 남아있다. 천연두 바이러스에 대한 광범위한 예방 접종의 중단은 다른 폭스 바이러스 (13)에 대한 감수성을 증가되었다. 예를 들어, 이전에 예방 접종에 의해 보호 중앙 아프리카 지역은 monkeypox에 바이러스 감염 14의 급증을 경험하고 있습니다. 중요한 문제도있다천연두 바이러스의 의도적 방출에 잠재 된 감수성에 관한 올렸다. 때문에 현재 사용 가능한 제한된 치료로, 신규 치료법의 개발이 절실히 요구되고있다. 이 기자의 바이러스는 바이러스 복제의 특정 단계의 억제를위한 신속하고 높은 처리량 작은 분자 억제제 검사를 할 수 있습니다. 억제의 현재 사용하지 대상 바이러스 발현 단계를 대상으로 억제제의 확인이 증가 힘과 함께 치료의 개발을 촉진 할 것이다. 대부분은 각 단계의 유전자 발현의 변화를 관찰하여 백시 세포 생물학에 대한 많은 정보를 수집 할 수 있습니다. 화학 물질 또는 감염된 숙주 세포의 유전자 조작에 의한 감쇠는 일반적으로 감소 바이러스 역가 표현된다. 그러나, 바이러스 성 발현 캐스케이드의 각 단계에서 변화를 비교함으로써, 하나는 바이러스가 적당 충격 방법의 더욱 완전한 이해를 얻을 수있다특히 처리에 의해 에드. 이러한 데이터는 기존의 바이러스 역가 출력과 상관 관계가 있지만,보다 상세한 기계론 정보뿐만 아니라 높은 처리 능력 (7)을 제공하는 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-글루타민, (L-글럿)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear Bottom Black 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>384 웰 플랫 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 TC 처리 마이크로 플레이트</td><td>Corning</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 2X, 멸균, 방사선 조사</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>TRLVMF</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드, 세포 배양(DMSO)</td><td>미국 생물분석</td><td>AB03091</td><td></td></tr><tr><td>1-&베타;-D-아라비노푸라노실시토신&nbsp; (AraC), MW= 280g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>isatin &beta; -thiosemicarbazone(IBT), MW= 234g/mol</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9075202</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin, MW= 823g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ST-246, MW= 376g/mol</td><td>SIGA Labs, Corvallis, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% 파라포름알데히드(포름알데히드) 수용액</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>TempPlate RT 광학 투명 필름</td><td>USA Scientific</td><td>2978-2700</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 저감 세럼 미디엄</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

폭스 바이러스 활성 인간과 같은 monkeypox에 같은 병원체, 전염성의 contagiousum 및 Contagalo 바이러스를 포함 이중 가닥 DNA 바이러스의 가족입니다. 이 제품군은 또한 천연두 바이러스, 천연두를 포함한다. 인해 폭스 바이러스 복제의 복잡성, 많은 질문들은 여전히​​ 유전자 발현 전략에 대하여 남아있다. 이 문서에서 우리는 높은 처리량 형식의 바이러스 유전자 발현의 단일 및 다중 단계의 실시간 측정을 가능하게 재조합 우두 바이러스의 개념화 및 사용에 대해 설명합니다. 이것은 바이러스 복제의 세 단계 각각에 대한 기자로서 스펙트럼 별개의 형광 단백질의 사용을 통해 사용할 수 있습니다. 스테이지 별 발현 패턴, 가능하게 플레이트 - 기반 분석법 및 바이러스 전파 및 복제의 현미경 관찰을 유지하면서 이러한 바이러스는 높은 신호 대 잡음비를 제공한다. 이 도구는 바이러스 검색, 바이러스 호스트 상호 작용의 연구, 진화 생물에 대한 용도가의 뜻.

이러한 바이러스의 일반적인 사용의 예로서, 삼중 형광 리포터 바이러스는 몇개의 잘 정의 된 폭스 바이러스 억제제의 억제의 점과 비교하기 위해 사용되었다. 헬라 세포는 검은 벽으로 둘러싸인 맑은 평면 바닥 96 - 웰 플레이트를 처리하고 하룻밤 배양 조직 문화에서 도금했다. (TrpV, 표 1) 합류 단층은 트리플 기자 바이러스를 사용하여 10의 감염의 다중성 (MOI)에 감염 또는 프로모터 이하 금성 판지도 (그림 1)에 설명 된대로 (PLV). 치료를 함유 감염 매체는 0.1 % DMSO, 3.6 μM (1 ㎍ / ㎖)의 최종 농도를 얻기 위해 추가되었다 ARAC, 50 μM (11.7 ㎍ / ㎖) IBT, 5 μM (1.9 ㎍ / ㎖) ST-246 또는 60 μM 세중 (50 ㎍ / ㎖) 리팜피신. 모든 주식은 DMSO에 1 μL / ml로 사용 된 이후 억제제 0.1 % DMSO가 차량 제어로서 사용 하였다. ...

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 화학적 처리에 의해 바이러스 유전자 발현이 영향을 받는 단계를 식별하는 것입니다. 이를 위해 조직 배양 세포를 플레이트에 도말하고 세포가 합쳐질(confluent) 때까지 배양합니다. 그 후, 세포를 삼중 리포터 백시니아 바이러스 또는 대조군인 프로모터 결핍 바이러스로 감염시킵니다.다음으로 처리 화합물을 적용하고, 바이러스 유전자 발현의 모든 단계가 완료될 수 있도록 세포를 18시간 동안 배양합니다. 그 후 플레이트 리더를 사용하여 생성된 형광을 측정합니다. 최종적으로 실험 화합물에 의해 유도된 발현의 상대적 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.단일 형광 융합 단백질을 발현하는 바이러스를 감염시키는 것보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 이 바이러스 세트가 특정 치료제가 바이러스 생애 주기 중 어느 단계에서 작용하는지에 대한 더 많은 정보를 제공하여 그 작용 기전에 대한 통찰력을 준다는 점입니다. 이 방법은 바이러스 감염 억제제를 식별하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 비허용성 세포주나 RNAi 스크리닝에서 바이러스 복제가 완료된 단계를 검출하여 감염에 필요한 세포 인자를 식별하는 데에도 사용될 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 세 가지의 스펙트럼적으로 구별되는 형광단이 단일 백시니아 바이러스의 이중 가닥 게놈에 통합된 트리플 바이러스 또는 TrpV 다단계 리포터 바이러스를 사용합니다.이러한 각 형광단백질은 잘 정의된 단계 특이적 프로모터에 의해 제어됩니다. Venus의 초기 발현을 위한 C 11 R 프로모터, m-cherry 발현을 위한 G eight R 중간 프로모터, 그리고 tag BFP의 후기 단계 발현을 위한 F 17 R 프로모터가 그것입니다. 따라서 Venus, m-Cherry 및 tag BFP는 감염 과정 동안 순차적으로 발현됩니다.대조군으로 프로모터가 없는 바이러스를 사용합니다. PLV는 TrpV와 유사한 Venus 구조물을 포함하고 있으나, 기능적인 전사 프로모터는 가지고 있지 않습니다.10 cm 디쉬에서 배양한 HeLa 세포를 해리시키는 것으로 본 프로토콜을 시작합니다. 세포를 성장 배지로 희석하여 약 2.0 × 10⁵ cells/mL 농도로 맞춥니다. 그다음, 검은색 벽과 투명한 평평한 바닥을 가진 96-well 플레이트의 각 웰에 100 µL씩 분주합니다. 세포가 완전히 밀집될 때까지 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 바이러스를 희석하기 위해 TrpV와 PLV를 37 °C 항온수조에서 해동한 후, 5분간 초음파 처리하여 응집물을 제거합니다. 이어서, 37 °C로 예열한 감염 배지를 사용하여 바이러스 스톡을 1.0 × 10⁷ PFU/mL 농도로 희석합니다.세포를 감염시키기 위해 성장 배지를 각 웰당 50 µL의 희석된 바이러스로 교체합니다. 각 처리군에 대해 세 개의 복제 웰에는 TrpV를, 다른 세 개의 웰에는 PLV를 감염시켜 각 처리에 특이적인 배경 형광을 고려합니다. 이 시점을 감염 후 0시간으로 정의합니다. 예를 들어, 50 µL씩 들어가는 6개의 96-웰 플레이트용으로 350 µL를 준비합니다. 화합물은 웰 내의 접종액 부피에 추가되므로 최종 농도의 2배로 희석해야 합니다. 다음으로 각 처리 조건에 대해, 실험 화합물 또는 PBS나 DMSO와 같은 용매 대조군을 모든 복제군 수에 하나를 더한 분량의 감염 배지에 희석하여 2배 농도의 마스터 믹스를 만듭니다. 이때 실험군과 벡터 전용 대조군 모두 용매 농도가 동일해야 함에 유의하십시오. 예를 들어, DMSO 내에서 1 µL/mL 농도의 IBT를 사용하는 경우, 벡터 대조군으로 DMSO만 1 µL/mL 농도로 사용해야 합니다. 바이러스를 첨가한 직후, 이 삽화에 표시된 대로 원하는 처리 화합물과 대조군 화합물이 포함된 감염 배지 50 µL를 각 웰에 첨가합니다.각 화합물은 TrpV 및 PLV와 함께 3회 반복 시험하며, 각 바이러스에 대해 용매 대조군(vehicle control)을 3회 반복 시험함에 유의하십시오.37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 18시간 동안 배양합니다. 다음 날, 각 웰에 이미 들어 있는 감염 배지에 8% paraformaldehyde 100 µL를 첨가하여 세포를 고정합니다. 빛이 차단된 상태에서 실온의 플레이트를 15분 동안 방치합니다.감염 배지에 2x 또는 8%paraformaldehyde를 직접 첨가하면 바이러스의 에어로졸화를 방지할 수 있으며, 고정되지 않은 바이러스를 폐기 용기에 직접 뒤집어 넣을 경우 발생할 수 있는 위험을 막을 수 있습니다. 15분이 경과한 후, 플레이트를 폐기 용기에 뒤집어 고정액을 제거합니다. 그런 다음 상온의 PBS 100 µL를 첨가하고 광학 투명 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.플레이트를 즉시 판독하지 않을 경우 4 °C에서 보관하십시오. 분광광도계 측정 시 응결 현상으로 인해 결과가 왜곡되는 것을 방지하려면, 밀봉된 플레이트를 판독하기 전에 반드시 상온으로 되돌리십시오.바이러스 성장을 정량화하려면 분광광도계를 사용하여 최종 형광(endpoint fluorescence)을 측정하십시오. 각 채널에 대해 최적화된 게인(gain) 설정을 사용하여 웰당 4회씩 측정합니다. 이 영상에서 사용된 TECAN Infinite M 1000 Pro 플레이트 리더는 원시 형광 측정값을 Microsoft Excel 파일로 내보냅니다. 판독값이 얻어지면 Microsoft Excel에서 원시 데이터를 엽니다.그런 다음 이를 GraphPad prism 결과 시트에 복사하여 붙여넣습니다. Prism에서 반복 측정된 TrpV 및 PLV 웰의 평균을 결정합니다. 이어서 각 처리군에 대해 TrpV 평균값에서 PLV 평균값을 뺍니다. 반복 실험과의 비교를 용이하게 하기 위해, 배경값이 제거된 데이터를 vehicle만 처리한 TrpV 웰 값으로 나누어 정규화합니다. 실험이 여러 번 반복되면, 각 채널에 대해 처리군 중 DMSO 처리군과 유의미한 차이가 있는 것이 있는지 확인하기 위해 일원 분산 분석(one-way analysis of variance 또는 one-way ANOVA) 테스트 및 다중 비교 사후 검정을 수행합니다. 키네틱 분석(kinetic assays)을 수행하려면 이전과 동일하게 세포를 감염시키고 시험 화합물을 처리하며, 특히 5% 이산화탄소 첨가 없이 적절한 pH를 유지하기 위해 완충 배지를 사용하는 것이 중요합니다.접착 필름으로 플레이트를 밀봉한 후, 37°C로 평형화된 플레이트 리더 챔버에 넣습니다. 플레이트를 지속적으로 37°C로 유지하도록 각별히 주의해야 합니다. 이렇게 하면 불필요한 세포 스트레스와 결로 현상을 방지할 수 있습니다.후반 시간대의 포화 상태를 방지하기 위해 플레이트 리더의 게인(gain)을 수동으로 설정하십시오. 감염 후 8시간에서 24시간 동안 매시간 측정값을 얻고, 종말점 분석(endpoint assay)과 동일한 방식으로 정규화하십시오. 개별 시간대의 측정값은 앞서 설명한 종말점 분석과 유사한 방법을 사용하여 통계적 유의성을 분석할 수 있습니다.억제 지점을 비교하기 위해, TrpV 또는 PLV 백시니아 바이러스에 감염된 HeLa 세포를 폭스 바이러스 억제제인 AraC, IBT, Rifampicin, ST 246이 존재하는 조건에서 배양하였습니다. 이 타임랩스 영상은 대조군 세포 내 바이러스 성장 과정 동안 녹색, 적색, 청색 형광체가 순차적으로 발현되는 모습을 보여줍니다. DNA 복제 차단 약물인 AraC가 존재하는 상태에서 감염시켰을 때, 초기 녹색 형광체는 이전과 동일하게 생성되지만, 중간 및 후기 단계의 적색 및 청색 형광 생성은 일어나지 않습니다.분광 분석을 통한 정량 분석 결과, araC 처리 세포에서 초기 유전자 발현은 210% 증가했으나 중간 및 후기 발현은 나타나지 않았습니다. 전사 읽기 통과(read through transcription)를 촉진하는 것으로 생각되는 IBT 존재 하에 감염된 세포는 대조군 수준의 24.7% 및 2.9%에 해당하는 중간 및 후기 발현 수준을 보였습니다. 비리온 조립 및 성숙 단계의 후기 유전자 발현 이후를 억제하는 ST246 및 rifampicin 존재 하에 감염된 세포는 대조군과 유의미한 차이가 없었습니다. 이러한 결과는 해당 화합물들의 알려진 작용 기전과 일치하며, TrpV 리포터 바이러스를 사용하여 미지의 화합물에 대한 바이러스 억제의 특정 단계를 식별할 수 있음을 시사합니다.이 절차를 수행할 때 적절한 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 이는 결과의 적절한 정규화를 가능하게 할 뿐만 아니라, 실험 화합물의 잠재적 기전을 결정하는 데에도 도움이 됩니다. 백시니아 바이러스(vaccinia virus)를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하고 권장되는 BSL-2 밀폐 기술을 준수하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 1.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 파트 3 찬란 염료의 아미노 알릴 결합에 의해 두 호스트 및 바이러스 샘플에서 증폭된 RNA를 라벨링 과정을 설명합니다. 3 부 3.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

바이러스 감염에 관련된 소설 호스트 요소는 기능 RNAi 심사의 셀 기반의 게놈 전체의 손실을 통해 확인할 수 있습니다.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

이 비디오는 재조합 HBV 리포터 시스템을 통해 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 검출하는 체외 기술을 보여줍니다. 숙주 세포를 감염시키면 재조합 바이러스 게놈은 루시퍼라제 리포터 효소를 발현하며, 이 효소는 기질을 산화시킬 때 생물 발광을 생성하여 바이러스 감염을 감지하는 데 도움이 됩니다.

바이러스 감염 검출을 위한 체외 재조합 바이러스 리포터 시스템

이 비디오는 폭스 바이러스에 감염된 세포의 번역 조절을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 감염되지 않은 세포와 바이러스에 감염된 세포를 반딧불이 루시퍼라제(Fluc) 및 레닐라 루시퍼라제(Rluc)를 암호화하는 mRNA와 함께 형질주입했으며, Fluc mRNA는 5' 폴리(A) 리더 염기서열을 포함했습니다. 용해된 세포에 생물 발광 기질을 추가할 때 두 루시퍼라제의 신호를 측정하여 리더 염기서열에 의해 부여되는 바이러스 감염 세포에서 Fluc mRNA의 번역 이점을 식별합니다.

폭스바이러스 감염 세포의 번역 조절을 연구하기 위한 Luciferase Reporter 분석

과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용 하 여 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구 하기 위한 프로토콜을 제시 합니다. 분석 법은 5 '-미 번역 지역 (UTR) 및 3 '-UTR를 포함 하 여 mRNA의 cis요소에 의해 번역 조절을 연구 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 변환 시작 모드를 검사할 수도 있습니다.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

이 프로토콜은 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하는 데 필요한 2차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 루시페라아제 및 형광 발현 재조합 (r)SARS-CoV-2 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용하는 바이러스 감염의 역학을 기술한다.

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 게놈 복제의 정확한 정량화는 매우 중요하지만 표준화된 프로토콜은 아직 확립되지 않았습니다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈 역가를 신뢰성 있게 정량화하기 위해 정제된 AAV 샘플을 준비하고 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd_PCR)을 수행하기 위한 검증된 방법을 설명합니다.

Digital Droplet Polymerase Chain Reaction에 의한 정제된 벡터 샘플의 Adeno-Associated Viral Genomes 정량화

배우세요 삼중 형광 리포터 백신바이러스를 이용하여 화학처리가 영향을 미치는 바이러스 유전자 발현 단계를 실시간으로 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 항바이러스 약물 개발에 활용됩니다.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

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