유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

이 실험 절차의 전반적인 목표는 화학적 처리에 의해 바이러스 유전자 발현이 영향을 받는 단계를 식별하는 것입니다. 이를 위해 조직 배양 세포를 플레이트에 도말하고 세포가 합쳐질(confluent) 때까지 배양합니다. 그 후, 세포를 삼중 리포터 백시니아 바이러스 또는 대조군인 프로모터 결핍 바이러스로 감염시킵니다.

다음으로 처리 화합물을 적용하고, 바이러스 유전자 발현의 모든 단계가 완료될 수 있도록 세포를 18시간 동안 배양합니다. 그 후 플레이트 리더를 사용하여 생성된 형광을 측정합니다. 최종적으로 실험 화합물에 의해 유도된 발현의 상대적 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

단일 형광 융합 단백질을 발현하는 바이러스를 감염시키는 것보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 이 바이러스 세트가 특정 치료제가 바이러스 생애 주기 중 어느 단계에서 작용하는지에 대한 더 많은 정보를 제공하여 그 작용 기전에 대한 통찰력을 준다는 점입니다. 이 방법은 바이러스 감염 억제제를 식별하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 비허용성 세포주나 RNAi 스크리닝에서 바이러스 복제가 완료된 단계를 검출하여 감염에 필요한 세포 인자를 식별하는 데에도 사용될 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 세 가지의 스펙트럼적으로 구별되는 형광단이 단일 백시니아 바이러스의 이중 가닥 게놈에 통합된 트리플 바이러스 또는 TrpV 다단계 리포터 바이러스를 사용합니다.

이러한 각 형광단백질은 잘 정의된 단계 특이적 프로모터에 의해 제어됩니다. Venus의 초기 발현을 위한 C 11 R 프로모터, m-cherry 발현을 위한 G eight R 중간 프로모터, 그리고 tag BFP의 후기 단계 발현을 위한 F 17 R 프로모터가 그것입니다. 따라서 Venus, m-Cherry 및 tag BFP는 감염 과정 동안 순차적으로 발현됩니다.

대조군으로 프로모터가 없는 바이러스를 사용합니다. PLV는 TrpV와 유사한 Venus 구조물을 포함하고 있으나, 기능적인 전사 프로모터는 가지고 있지 않습니다.

10 cm 디쉬에서 배양한 HeLa 세포를 해리시키는 것으로 본 프로토콜을 시작합니다. 세포를 성장 배지로 희석하여 약 2.0 × 10⁵ cells/mL 농도로 맞춥니다. 그다음, 검은색 벽과 투명한 평평한 바닥을 가진 96-well 플레이트의 각 웰에 100 µL씩 분주합니다. 세포가 완전히 밀집될 때까지 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 바이러스를 희석하기 위해 TrpV와 PLV를 37 °C 항온수조에서 해동한 후, 5분간 초음파 처리하여 응집물을 제거합니다. 이어서, 37 °C로 예열한 감염 배지를 사용하여 바이러스 스톡을 1.0 × 10⁷ PFU/mL 농도로 희석합니다.

세포를 감염시키기 위해 성장 배지를 각 웰당 50 µL의 희석된 바이러스로 교체합니다. 각 처리군에 대해 세 개의 복제 웰에는 TrpV를, 다른 세 개의 웰에는 PLV를 감염시켜 각 처리에 특이적인 배경 형광을 고려합니다. 이 시점을 감염 후 0시간으로 정의합니다. 예를 들어, 50 µL씩 들어가는 6개의 96-웰 플레이트용으로 350 µL를 준비합니다. 화합물은 웰 내의 접종액 부피에 추가되므로 최종 농도의 2배로 희석해야 합니다. 다음으로 각 처리 조건에 대해, 실험 화합물 또는 PBS나 DMSO와 같은 용매 대조군을 모든 복제군 수에 하나를 더한 분량의 감염 배지에 희석하여 2배 농도의 마스터 믹스를 만듭니다. 이때 실험군과 벡터 전용 대조군 모두 용매 농도가 동일해야 함에 유의하십시오. 예를 들어, DMSO 내에서 1 µL/mL 농도의 IBT를 사용하는 경우, 벡터 대조군으로 DMSO만 1 µL/mL 농도로 사용해야 합니다. 바이러스를 첨가한 직후, 이 삽화에 표시된 대로 원하는 처리 화합물과 대조군 화합물이 포함된 감염 배지 50 µL를 각 웰에 첨가합니다.

각 화합물은 TrpV 및 PLV와 함께 3회 반복 시험하며, 각 바이러스에 대해 용매 대조군(vehicle control)을 3회 반복 시험함에 유의하십시오.

37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 18시간 동안 배양합니다. 다음 날, 각 웰에 이미 들어 있는 감염 배지에 8% paraformaldehyde 100 µL를 첨가하여 세포를 고정합니다. 빛이 차단된 상태에서 실온의 플레이트를 15분 동안 방치합니다.

감염 배지에 2x 또는 8%paraformaldehyde를 직접 첨가하면 바이러스의 에어로졸화를 방지할 수 있으며, 고정되지 않은 바이러스를 폐기 용기에 직접 뒤집어 넣을 경우 발생할 수 있는 위험을 막을 수 있습니다. 15분이 경과한 후, 플레이트를 폐기 용기에 뒤집어 고정액을 제거합니다. 그런 다음 상온의 PBS 100 µL를 첨가하고 광학 투명 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.

플레이트를 즉시 판독하지 않을 경우 4 °C에서 보관하십시오. 분광광도계 측정 시 응결 현상으로 인해 결과가 왜곡되는 것을 방지하려면, 밀봉된 플레이트를 판독하기 전에 반드시 상온으로 되돌리십시오.

바이러스 성장을 정량화하려면 분광광도계를 사용하여 최종 형광(endpoint fluorescence)을 측정하십시오. 각 채널에 대해 최적화된 게인(gain) 설정을 사용하여 웰당 4회씩 측정합니다. 이 영상에서 사용된 TECAN Infinite M 1000 Pro 플레이트 리더는 원시 형광 측정값을 Microsoft Excel 파일로 내보냅니다. 판독값이 얻어지면 Microsoft Excel에서 원시 데이터를 엽니다.

그런 다음 이를 GraphPad prism 결과 시트에 복사하여 붙여넣습니다. Prism에서 반복 측정된 TrpV 및 PLV 웰의 평균을 결정합니다. 이어서 각 처리군에 대해 TrpV 평균값에서 PLV 평균값을 뺍니다. 반복 실험과의 비교를 용이하게 하기 위해, 배경값이 제거된 데이터를 vehicle만 처리한 TrpV 웰 값으로 나누어 정규화합니다. 실험이 여러 번 반복되면, 각 채널에 대해 처리군 중 DMSO 처리군과 유의미한 차이가 있는 것이 있는지 확인하기 위해 일원 분산 분석(one-way analysis of variance 또는 one-way ANOVA) 테스트 및 다중 비교 사후 검정을 수행합니다. 키네틱 분석(kinetic assays)을 수행하려면 이전과 동일하게 세포를 감염시키고 시험 화합물을 처리하며, 특히 5% 이산화탄소 첨가 없이 적절한 pH를 유지하기 위해 완충 배지를 사용하는 것이 중요합니다.

접착 필름으로 플레이트를 밀봉한 후, 37°C로 평형화된 플레이트 리더 챔버에 넣습니다. 플레이트를 지속적으로 37°C로 유지하도록 각별히 주의해야 합니다. 이렇게 하면 불필요한 세포 스트레스와 결로 현상을 방지할 수 있습니다.

후반 시간대의 포화 상태를 방지하기 위해 플레이트 리더의 게인(gain)을 수동으로 설정하십시오. 감염 후 8시간에서 24시간 동안 매시간 측정값을 얻고, 종말점 분석(endpoint assay)과 동일한 방식으로 정규화하십시오. 개별 시간대의 측정값은 앞서 설명한 종말점 분석과 유사한 방법을 사용하여 통계적 유의성을 분석할 수 있습니다.

억제 지점을 비교하기 위해, TrpV 또는 PLV 백시니아 바이러스에 감염된 HeLa 세포를 폭스 바이러스 억제제인 AraC, IBT, Rifampicin, ST 246이 존재하는 조건에서 배양하였습니다. 이 타임랩스 영상은 대조군 세포 내 바이러스 성장 과정 동안 녹색, 적색, 청색 형광체가 순차적으로 발현되는 모습을 보여줍니다. DNA 복제 차단 약물인 AraC가 존재하는 상태에서 감염시켰을 때, 초기 녹색 형광체는 이전과 동일하게 생성되지만, 중간 및 후기 단계의 적색 및 청색 형광 생성은 일어나지 않습니다.

분광 분석을 통한 정량 분석 결과, araC 처리 세포에서 초기 유전자 발현은 210% 증가했으나 중간 및 후기 발현은 나타나지 않았습니다. 전사 읽기 통과(read through transcription)를 촉진하는 것으로 생각되는 IBT 존재 하에 감염된 세포는 대조군 수준의 24.7% 및 2.9%에 해당하는 중간 및 후기 발현 수준을 보였습니다. 비리온 조립 및 성숙 단계의 후기 유전자 발현 이후를 억제하는 ST246 및 rifampicin 존재 하에 감염된 세포는 대조군과 유의미한 차이가 없었습니다. 이러한 결과는 해당 화합물들의 알려진 작용 기전과 일치하며, TrpV 리포터 바이러스를 사용하여 미지의 화합물에 대한 바이러스 억제의 특정 단계를 식별할 수 있음을 시사합니다.

이 절차를 수행할 때 적절한 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 이는 결과의 적절한 정규화를 가능하게 할 뿐만 아니라, 실험 화합물의 잠재적 기전을 결정하는 데에도 도움이 됩니다. 백시니아 바이러스(vaccinia virus)를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하고 권장되는 BSL-2 밀폐 기술을 준수하십시오.