유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

이 절차의 전반적인 목표는 바이러스 유전자 발현이 화학적 처리에 의해 영향을 받는 단계를 식별하는 것입니다. 이를 위해 조직 배양 세포를 도말하고 배양합니다. 합류할 때까지 세포는 트리플 리포터 백시니아 바이러스 또는 대조 프로모터 목록 바이러스에 감염됩니다.

다음으로 처리 화합물을 적용하고 세포를 18시간 동안 배양하여 바이러스 유전자 발현의 모든 단계를 완료합니다. 그 결과 생성된 형광은 플레이트 리더를 사용하여 측정됩니다. 궁극적으로, 실험 화합물에 의해 야기된 발현의 상대적인 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

단일 형광 융합 단백질을 발현하는 바이러스에 감염되는 것에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 바이러스 세트가 바이러스 수명 주기에서 특정 치료 약물이 작용하는 위치에 대한 더 많은 정보를 제공하여 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 바이러스 감염 억제제를 식별하는 데 사용할 수 있지만, 비허용 세포주 또는 RNAi 스크리닝에서 완료된 바이러스 복제 단계를 감지하여 감염에 필요한 세포 인자를 식별하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 트리플 바이러스 또는 Trip V 다단계 리포터 바이러스를 활용하며, 이 바이러스에서는 스펙트럼이 뚜렷하게 구별되는 3개의 플루오로 4가 단일 정맥 바이러스의 이중선 가닥 게놈에 통합됩니다.

이러한 fluoro fours 각각은 잘 정의된 단계 특이적 프로모터에 의해 제어됩니다. 금성의 조기 발현을 위한 C11 R 프로모터, m 체리의 발현을 위한 G 8 R 중간 프로모터 및 태그 BFP의 후기 발현을 위한 F17 R 프로모터. 따라서, Venus m Cherry와 tag BFP는 감염 중에 순차적으로 발현됩니다.

대조군으로 프로모터 목록 바이러스가 사용됩니다. PLV는 Trip V.에서와 유사한 정맥 구조를 포함하고 있지만, 기능적 전사 프로모터는 없다. 분리하여 이 프로토콜을 시작합니다.

10cm 접시에서 자란 헬라 세포는 성장 배지에서 세포를 약 2.0 배 10에서 밀리리터 당 5 번째 세포로 희석합니다. 그런 다음 검은색 벽의 투명하고 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터를 분배하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 세포를 24시간 동안 배양하여 섭씨 37도의 수조에서 Tripp V 및 PLV를 해동하는 바이러스를 희석할 때까지 5분 동안 초음파 처리한 다음 5분 동안 초음파 처리하여 분해합니다. 다음으로, 세포를 감염시키기 위해 섭씨 37도로 예열된 감염 배지에서 바이러스 스톡을 1.0 곱하기 10으로 10 곱하기 7번째 PFU로 희석합니다.

성장 배지를 50마이크로리터의 희석된 바이러스로 각 처리에 대해 각 웰에 교체합니다. 3개의 복제 웰을 Tripp V로 감염시키고 다른 3개를 PLV로 감염시켜 각 처리에 특이적인 배경 형광을 설명합니다. 이것은 시간이 0시간과 같을 때 정의됩니다.

예를 들어, 감염 후에는 각각 50마이크로리터가 있는 6개의 96개의 웰에 대해 350마이크로리터를 만듭니다. 각 화합물은 이미 우물에 있는 접종물 부피에 추가되기 때문에 최종 농도의 두 배로 희석해야 합니다. 다음으로, 각 처리 조건에 대해 실험 화합물 또는 PBS 또는 DMSO와 같은 차량 제어 용매를 모든 복제에 대해 충분한 감염 배지로 희석하여 2 x 마스터 믹스를 만듭니다.

게다가 하나, 실험 대조군과 벡터 전용 대조군 모두에서 용매의 농도는 동일해야 합니다. 예를 들어, DMSO에서 1마이크로리터/mil로 IBT를 사용하는 경우 벡터 제어로 1마이크로리터/mil에서 DMSL만 사용해야 합니다. 바이러스를 첨가한 직후, 이 그림과 같이 원하는 치료제 및 대조 화합물을 포함하는 50마이크로리터의 감염 배지를 각 웰에 추가합니다.

각 화합물은 Tripp V 및 PLV로 3회 테스트되며, 차량 제어는 각 바이러스에 대해 3회 실행됩니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 18시간 동안 배양하고 이산화탄소를 5% 더 높입니다. 다음 날, 각 웰에 이미 있는 감염 배지에 8% 파라폼 알데히드 100마이크로리터를 첨가하여 세포를 고정하고 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.

감염 매체에 2개의 x 또는 8% 파라폼 알데히드를 직접 추가하면 바이러스의 에어로졸화를 방지할 수 있으며, 고정되지 않은 바이러스가 쓰레기통으로 직접 반전될 경우 발생할 수 있습니다. 15분이 지나면 접시를 쓰레기통에 뒤집어 고정제를 제거합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 실온 PBS를 추가하고 광학적으로 투명한 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.

플레이트를 즉시 읽지 못하면 섭씨 4도에서 보관하십시오. 응결로 인해 분광 광도계 측정이 왜곡되는 것을 방지하기 위해 밀봉된 플레이트를 읽기 전에 실온으로 되돌려 놓으십시오. 바이러스 성장을 정량화하려면 분광 광도계를 사용하여 종말점 형광을 측정합니다.

각 채널에 대해 최적화된 게인 설정을 사용하여 웰당 4개의 측정을 수행합니다. 이 비디오에 사용된 TAN Infinite M 1000 Pro 플레이트 리더는 원시 형광 측정값을 Microsoft Excel 파일로 내보냅니다. 판독값을 얻은 후 Microsoft Excel에서 원시 데이터를 엽니다.

그런 다음 복사하여 GraphPad 프리즘에 붙여넣습니다. Prism의 결과 시트는 반복 Tripp v 및 PLV 웰의 평균을 결정합니다. 그런 다음 각 처리에 대한 평균 Tripp V 값에서 평균 PLV 값을 뺍니다.

반복 실험과의 비교를 용이하게 하려면 배경에서 뺀 데이터를 차량 전용 Tripp v Wells로 나누어 데이터를 정규화합니다. 실험이 여러 번 반복되면 분산에 대한 일원 분석 또는 일원 NOVA 테스트 및 다중 비교 사후 테스트를 수행하여 처리 방법이 DMSO 처리와 크게 다른지 여부를 확인합니다. 각 채널이 역학 분석을 수행하고, 세포를 감염시키고, 이전과 같이 테스트 화합물을 적용하기 위해서는 5%의 이산화탄소를 추가하지 않고 적절한 pH를 유지하기 위해 완충된 배지를 사용하는 것이 특히 중요합니다.

접착 필름으로 플레이트를 밀봉한 후 섭씨 37도에서 평형을 이루는 플레이트 리더 챔버에 놓습니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 일관되게 유지하려면 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이렇게 하면 과도한 세포 스트레스와 결로 현상을 방지할 수 있습니다.

이후 시점의 포화를 방지하기 위해 플레이트 리더 게인을 수동으로 설정합니다. 감염 후 8시간에서 24시간 동안 시간별 판독값을 획득하고 정상화합니다. 종말점 분석의 경우, 앞서 설명한 종말점 분석과 유사한 방법을 사용하여 통계적 유의성에 대해 개별 시점을 분석할 수 있습니다.

억제 지점을 비교하기 위해, TPV 또는 PLV 백시니아에 감염된 힐라 세포는 수두 바이러스 억제제인 Aris, CIBT, Rifampicin 및 ST 2 46의 존재 하에서 성장시켰다. 이번에 랩스 영상은 DNA 복제 차단 약물 aee가 있는 상태에서 감염되었을 때 대조 세포에서 바이러스 성장 중 녹색, 적색, 청색 fluoro fours의 순차적 발현을 보여줍니다. 초기 녹색 fluoro four는 이전과 같이 생성되지만 적색 및 청색 형광의 중간 및 후기 생산은 발생하지 않습니다.

분광법에 의한 정량 분석은 초기 유전자 발현이 210% 증가한 것으로 나타났지만, IBT가 있는 상태에서 감염된 C 세포로 처리된 세포에서는 중간 및 후기 발현이 부족하여 촉진하는 것으로 생각됩니다. Read through transcription은 중간 및 후기 발현 수준이 대조군 수준의 24.7%와 2.9%였으며, virion 조립 및 성숙 중 후기 유전자 발현 후 늦은 유전자 발현을 억제하는 ST 2 46 및 rifampicin의 존재 하에 감염된 세포는 대조군과 크게 다르지 않았습니다. 이러한 결과는 이러한 화합물의 알려진 작용 메커니즘과 일치하며 Trip V 리포터 바이러스를 사용하여 알려지지 않은 화합물에 대한 바이러스 억제의 특정 단계를 식별할 수 있음을 시사합니다.

이 절차를 시도하는 동안 적절한 컨트롤을 포함해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 이를 통해 결과의 적절한 정규화를 수행할 수 있을 뿐만 아니라 실험 화합물의 잠재적 메커니즘을 결정할 수 있습니다. 백시니아 바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 말고 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 권장 BSL을 따르십시오.

두 가지 봉쇄 기술.