Name: 재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 광학 트랩과 TIRF 현미경을 이용해 재구성된 미세소관 다발 내 힘을 직접 측정하는 방법을. 이 기술은 세포골격 역학과 단백질 상호작용의 기계적 특성을 정량화하는 데 활용됩니다.

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저자는 R21 AG067436 (JP 및 SF), T32 AG057464 (ET) 및 Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (SF)의 지원을 인정하고자합니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

미세소관 네트워크는 본질적으로 근본적으로 기계적인 광범위한 작업을 수행하기 위해 무수한 세포 유형에 사용됩니다. 세포가 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 어떻게 기능하는지 설명하려면 이러한 미크론 규모의 네트워크가 집합적으로 구축하는 나노미터 크기의 단백질에 의해 어떻게 구성되고 조절되는지 이해하는 것이 중요합니다. 광학 핀셋과 같은 생물물리학적 도구는 이 규모에서 주요 단백질의 기계화학을 조사하는 데 매우 적합합니다. 미세소관 네트워크 기능의 다양성을 반영하여, 미세소관 팁 역학67,68의 힘 의존적 분석, 키네토코어 성분에 의한 힘 생성 69,70,71, 미세소관 필라멘트 역학을 조사하기 위한 2빔 덤벨 트랩 기하학72,73을 포함하여 광학 핀셋을 사용하는 복잡한 실험 기하학이 탐구되었습니다.<...

세포는 미세소관 네트워크를 사용하여 소포 수송 1,2,3에서 유사분열 4,5,6 동안 염색체 분리에 이르기까지 다양한 기계적 작업을 수행합니다. 분자 운동 단백질 키네신 및 다인(dynein)과 같이 미세소관과 상호 작용하는 많은 단백질은 힘을 생성하고 기계적 부하에 의해 조절됩니다. 이러한 중요한 분자가 어떻게 기능하는지 더 잘 이해하기 위해 연구자들은 광학 트래핑 및 TIRF 현미경과 같은 단일 분자 생물 물리학 적 방법을 사용하여 무부하 스테핑 속도, 처리 성 및 개별 단백질에 대한 힘-속도 관계와 같은 중요한 매개 변수를 직접 모니터링했습니다. 가장 일반적으로 사용되는 실험 기하학은 구형 기하학과 크기가 모터 구동 수송을 받는 소포를 모방한 트래핑 비드에 모터 단백질을 직접 부착하는 것이었습니다. 키네신 -1 7,8,9, 키네신 -2 10,11,12, 키네 신 -313,14,15,16 키네신 -517,18, 키네 신 -8 19,20, 다인 및 다인 복합체21,22, 23,24,25, 이러한 방법으로 연구되었습니다.
그러나 많은 세포 과정에서 운동 및 비 운동 단백질은 트랙 및화물26,27로 미세 소관을 사용합니다. 또한, 미세 소관 필라멘트가 고차 다발로 가교 결합되는 이러한 시나리오에서 이러한 단백질은 단일 단위가 아닌 앙상블로 기능합니다. 예를 들어, 분열하는 체세포 내에서, 조밀한 필라멘트 네트워크는 유사분열 방추 장치(28,29,30)를 구축하기 위해 자기 조직화된다. 극간 스핀들 미세 소관 네트워크는 매우 역동적이며 스핀들 극을 가리키는 마이너스 엔드와 스핀들 적도 근처에서 겹치는 플러스 엔드로 크게 배열됩니다. 스핀들 내의 필라멘트는 운동 단백질, 예컨대 키네신-5 31,32,33, 키네신-12 34,35,36 및 키네신-1437,38,39 또는 PRC140,41,42,43 또는 NuMA 44,45와 같은 비-운동 단백질에 의해 가교되고, 46. 그들은 극 플럭스와 같은 과정에서 또는 중기 동안 염색체 중심을 조정하는 동안 또는 아나 페이즈 47,48,49,50,51,52 동안 염색체 분리를 조정하는 동안 자주 움직이거나 기계적 스트레스를 경험합니다. 따라서 유사 분열을 통한 미크론 규모의 스핀들 장치의 무결성은이 상호 작용하는 필라멘트 네트워크에 의해 생성되고 유지되는 밀고 당기는 힘의 신중하게 조절 된 균형에 의존합니다. 그러나 이 기계적 조절을 조사하고 단백질 앙상블이 어떻게 함께 작동하여 미세소관 운동을 조정하고 스핀들을 적절하게 조립하는 데 필요한 힘을 생성하는지 설명하는 데 필요한 도구는 최근에야 개발되었으며 동적 미세소관 네트워크를 정의하는 생물물리학적 규칙을 이해하기 시작했습니다.
이 원고의 목표는 시험관 내에서 가교결합된 미세소관 쌍을 재구성하고, 미세소 관과 가교 단백질의 동시 형광 시각화 및 나노스케일 힘 측정을 허용하는 현미경 챔버에서 이러한 번들을 고정하고, 이러한 데이터를 강력하게 처리하는 데 필요한 단계를 시연하는 것입니다. 형광 표지 미세소관을 안정적으로 중합하고, 부착용 현미경 커버슬립을 준비하고, 광학 트래핑 실험을 위한 폴리스티렌 비드를 준비하고, 직접적인 생물물리학적 조작을 허용하면서 생체 내 기능을 보존하는 가교 필라멘트 네트워크를 조립하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>10W 이테르븀 파이버 레이저, 1064nm</td><td>IPG 포토닉스</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td></td></tr><tr><td>405/488/561/640nm 레이저 쿼드 밴드 세트 TIRF 애플리케이션용</td><td>Chroma</td><td>TRF89901v2</td><td></td></tr><tr><td>6x His Tag 항체, 비오틴 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>#MA1-21315-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>아세톤, HPLC 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-608-395</td><td></td></tr><tr><td>소 우유의 알파 카제인</td><td>시그마</td><td>1002484390</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>벤조나제</td><td>노바겐</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-PEG-SVA-5000</td><td>레이산 바이오, Inc.</td><td></td><td></td>NC0479433</tr><tr><td>BL21 (DE3) Rosetta Cells</td><td>Millipore Sigma</td><td>71-400-3</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>190311</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo 100X/1.49NA 오일 이멀젼 TIRF 대물렌즈</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>ACROS Organics</td><td>227920250</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 미니 랙, 8 커버슬립용</td><td>Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 작업 와이퍼</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>포도당 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3501</td><td></td></tr><tr><td>D-설탕</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Ecoline 침수 온도 조절기 E100(003 욕조</td><td>포함) LAUDA-Brinkmann</td><td>27709</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Corporation</td><td>32462-25GM</td><td></td></tr><tr><td>FIJI / Image J</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>젖빛 현미경 슬라이드</td><td>Corning</td><td>12-553-10</td><td>75mmx25mm, 두께 0.9-1.1mm</td></tr><tr><td>포도당 산화효소</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>195196</td><td>Type VII, 산소가 추가되지 않음</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>JBS-NU-405S</td><td>-20°C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다. C 및 -80에서 최대 1년 & deg; C</td></tr><tr><td>골드 씰 커버 유리</td><td>Thermo Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Fisher Scientific</td><td>03196-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>실험실 건조제</td><td>Bel-Art</td><td>999320237</td><td>190mm 플레이트 크기</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KIF5A K439 (aa:1-439)-6His</td><td>Gilbert Lab, RPI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182</td><td>Kimwipe Kimberley Clark</td><td>Z188956</td><td>보푸라기 없는 조직</td></tr><tr><td>Immersion Oil, Type</td><td>B Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 조직</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>LuNA 레이저 발사(4채널: 405, 488, 561, 640nm)</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>리소자임</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>100834</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 아세테이트 테트라하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP215-500</td><td></td></tr><tr><td>마이크로퓨지 18</td><td>벡크만 쿨터</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>MPEG-SVA MW-5000</td><td>레이산 바이오, Inc.</td><td></td><td></td>NC0107576</tr><tr><td>Neutravadin</td><td>Invitrogen</td><td>PI31000</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Nikon LuN4 레이저</td></tr><tr><td>Ni-NTA 수지</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGG</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>개방형 후벽 폴리카보네이트 튜브, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>343755</td><td></td></tr><tr><td>Optima-TLX 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>361544</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel (Taxol equivalent)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>ACROS Organics</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore</td><td>7110-5GM</td><td></td></tr><tr><td>돼지 세뇨관, 비오틴 라벨</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>돼지 세뇨관, HiLyte 647 Fluor</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M</td><td>원적색 표지</td></tr><tr><td>돼지 세뇨관, Rhodamine</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL590M</td><td></td></tr><tr><td>돼지 세뇨관, 세뇨관 단백질</td><td>세포골격, Inc.</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 아세테이</td>트 <td>Fisher Scientific</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B sCMOS 카메라</td><td>광도</td><td>측정 N/A</td><td></td></tr><tr><td>사분면 검출기 센서 헤드</td><td>ThorLabs</td><td>PDQ80A</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange Lightning Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>스퀘어 커버 안경</td><td>Corning</td><td>12-553-450</td><td>18mm x 18mm, 두께 0.13-0.17mm</td></tr><tr><td>Streptavidin Microspheres</td><td>Polysciences Inc.</td><td>24162-1</td><td></td></tr><tr><td>Superose-6 열</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0915--96</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100 고정 각도 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기(초음파 처리기)</td><td>Vevor</td><td>JPS-08A(DD)</td><td>304 스테인리스 스틸, 40kHz 주파수, 60W 전력</td></tr><tr><td>Vectabond APTES 솔루션</td><td>벡터 Laboratories</td><td>SP-1800-7</td><td></td></tr><tr><td>Windex 암모니아 -D</td><td>S.C. Johnson</td><td>SJN695237</td><td></td> 함유 강화 유리 세정제</tr></tbody></table>

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles

미세소관 네트워크는 소포 수송을 위한 트랙 역할을 하는 것부터 유사분열 동안 염색체 분리를 조절하기 위한 특수 어레이로 작동하는 것까지 광범위한 작업을 수행하기 위해 세포에 사용됩니다. 미세소관과 상호작용하는 단백질에는 활성력과 방향 운동을 생성할 수 있는 키네신 및 다인(dynein)과 같은 모터뿐만 아니라 필라멘트를 고차 네트워크로 가교결합하거나 필라멘트 역학을 조절하는 비모터 단백질이 포함됩니다. 현재까지 미세소관 관련 단백질에 대한 생물물리학적 연구는 소포 수송에 필요한 단일 운동 단백질의 역할에 압도적으로 초점을 맞추었으며, 키네신 및 다인인의 힘 생성 특성 및 기계화학적 조절을 밝히는 데 상당한 진전이 있었습니다. 그러나 유사분열 방추 내에서 필라멘트가 미끄러지는 동안과 같이 미세소관이 화물과 트랙 모두에서 작용하는 공정의 경우 관련된 가교 단백질 앙상블의 생물물리학적 조절에 대해서는 훨씬 덜 이해됩니다. 여기에서는 정제된 미세소관과 유사분열 단백질로 구성된 가교 미세소관 최소 네트워크 내에서 힘 생성 및 반응을 직접 프로빙하는 방법론에 대해 자세히 설명합니다. 미세소관 쌍은 관심 단백질에 의해 가교되고, 하나의 미세소관은 현미경 커버슬립에 고정되고, 두 번째 미세소관은 광학 트랩에 의해 조작됩니다. 동시 전반사 형광 현미경을 사용하면 필라멘트가 떨어져 힘을 생성할 때 이 미세소관 네트워크의 모든 구성 요소를 다채널 시각화할 수 있습니다. 또한 이러한 기술을 사용하여 키네신-5 앙상블이 가하는 미는 힘을 조사하는 방법과 유사분열 MAP PRC1에 의해 가교된 슬라이딩 미세소관 쌍 사이에서 점성 제동력이 어떻게 발생하는지 보여줍니다. 이러한 분석은 스핀들 조립 및 기능의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하며 뉴런 및 극성 상피 세포의 축삭 및 수상 돌기와 같은 다양한 맥락에서 조밀 한 미세 소관 네트워크 역학을 연구하는 데 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.

생물 물리학 적 분석에 적합한 미세 소관 번들의 준비는 몇 가지 주요 기준이 충족되면 성공한 것으로 간주됩니다. 첫째, 세 가지 색상의 이미징은 중첩 영역을 우선적으로 장식하는 가교 단백질 농도를 가진 두 개의 정렬 된 미세 소관을 나타내야합니다 (그림 5B, C 및 그림 6B). 이상적으로, 로다민 미세소관의 중첩 가장자리와 자유 단부 사이의 거리는 트래핑 빔과 형광 표지된 단백질 사이에 충분한 물리적 공간을 제공하기 위해 최소 5μm여야 합니다. 둘째, 비오티닐화된 원적색 미세소관이 없는 영역, 특히 가교 단백질이 표지된 동일한 채널에서 배경 형광 신호가 최소화되어야 합니다. 높은 배경 형광은 커버슬립 패시베이션이 불량하고 유리 결합 단백질의 농도가 높음을 나타내며, 이는 미세소관 또는 트래핑 비드와 비특이적으로 상호 작용할 가능성이 높습니다. 또한, 미세소관...

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as ...

우리의 프로토콜을 통해 연구자들은 정제 된 구성 요소에서 세포 골격 모티프를 구축하고 이러한 네트워크가 생성하는 힘을 직접 측정하여 세포의 기계적 구성 요소가 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 어떻게 기능하는지 이해할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 힘을 정량화하고 이러한 숫자를 직접 상관시켜 단백질 농도 및 밀도를 포함하여 관련된 단백질의 매개 변수를 유지할 수 있습니다. 일반적으로 셀 내에서 획득이 불가능한 매개 변수입니다.이 방법은 유사분열이나 신경 발달과 관련된 것과 같은 모든 유형의 세포골격 네트워크에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사용되는 이 특정 단백질을 단순히 교체함으로써 근육 수축 또는 세포 이동과 관련된 네트워크를 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 방법의 가장 까다로운 측면은 단일 빔 광학 트랩과 TIRF 현미경을 포함한 다양한 기술의 조정입니다.또한 단일 분자 실험은 커버 슬립과 같은 표면을 신중하게 준비해야 하므로 고품질 샘플을 준비하는 것이 가장 중요합니다. 빈 피펫 팁 상자의 바닥에 초순수를 적신 보푸라기가 없는 접힌 티슈를 배치하여 습도 챔버를 구성하는 것으로 시작하십시오. 채널의 한쪽 끝에서 액체를 피펫팅하고 반대쪽 끝에서 액체를 배출하여 모든 시약을 주입합니다.20 마이크로 리터 각도의 피펫 팁을 사용하여 밀리리터 당 0.5 밀리그램의 스트렙타 비딘 또는 NeutrAvidin의 10 마이크로 리터를 천천히 흘립니다. 커버 슬립이 아래를 향하도록 하여 습도 챔버에서 슬라이드를 4분 동안 배양합니다. 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 20마이크로리터의 1x BRB80을 사용하여 챔버를 플러시하여 액체를 꺼냅니다.흐르는 시약을 반복하고 1회 더 인큐베이션한 후, 10 마이크로리터의 0.5 밀리리터 카제인 블로킹 용액으로 플러시 단계. 10마이크로리터의 희석된 비오티닐화된 원적색 미세소관을 챔버로 흘린 다음 20마이크로리터의 1x BRB80으로 챔버를 플러시합니다. 시약을 흘려주고 이전에 입증된 바와 같이 인큐베이션한 후, 연구할 적절한 농도의 비운동 단백질 10 마이크로리터로 단계를 플러시한 다음, 10 마이크로리터의 로다민 마이크로소관에 유동시키고, 인큐베이션 및 플러싱을 반복한다.다음으로, 1마이크로리터의 리고르 키네신 코팅 비드와 19마이크로리터의 반응 완충액을 결합합니다. 투명한 매니큐어로 챔버의 양쪽 가장자리를 밀봉하고 광택제가 마를 때까지 기다리십시오. 전체 내부 반사 형광 이미징 기능이 있고 단일 빔 광학 트랩이 구성된 도립 현미경 기기를 사용하십시오.샘플 챔버의 커버 슬립에 침지 오일 1방울을 추가합니다. 샘플 챔버의 커버 슬립 쪽이 아래를 향하도록 하여 이미징할 샘플을 현미경 플랫폼에 놓습니다. 커버 슬립과 오일을 통한 대물렌즈 사이에 접촉이 있도록 대물렌즈를 천천히 들어 올립니다.샘플 챔버의 커버 슬립 표면에 초점이 맞춰지도록 대물 높이를 조정합니다. 세 채널 모두에서 샘플의 단일 프레임 이미지를 기록합니다. 여기서 실험하려면 100-200 밀리 초의 노출을 사용하십시오.레이저 출력을 조정하여 샘플에서 우수한 신호 대 잡음비를 달성하는 동시에 개별 번들을 분석할 때 2-5분에 걸쳐 광 표백을 최소화합니다. 시야당 미세소관 다발의 빈도는 챔버당 100마이크로리터 시야 x 100마이크로리터당 약 3-4개의 미세소관 다발이어야 합니다. 현미경에서 명시야와 100x 대물렌즈를 사용하여 샘플의 비드 밀도를 관찰합니다.비드가 평균적으로 서로 최소 10마이크로미터가 되도록 비드 농도를 사용하고 어떤 종류의 표면 구속 또는 클러스터링도 없는지 확인합니다. 비오티닐화된 원적색 미세소관이 커버 슬립 표면에 단단히 부착되어 있고 로다민이 눈에 띄는 브라운 움직임이 없는지 확인하십시오. 로다민 미세소관이 가교 지도를 통해 비오티닐화된 미세소관에 부착되고 자유 말단에서 눈에 띄게 변동하는지 확인합니다.두 개의 미세소관만 포함하는 적합한 미세소관 다발을 식별하고, 하나는 전체 표면 부착으로 비오티닐화되고 다른 하나는 용액이 부분적으로 없고 x축 또는 y축에 정렬된 비오티닐화 미세소관을 식별합니다. 광학 트랩을 사용하여 브라운 운동을 보여주는 자유 비드를 캡처합니다. 비드가 포획되면 비드를 선택한 미세소관 다발로 조심스럽게 옮겨 공정에서 다른 비드가 트랩으로 당겨지지 않도록 합니다.비드가 가교 단백질을 포함하는 중첩 영역으로부터 수 마이크론 떨어져 있는지 확인하십시오. 로다민 미세소관의 자유 세그먼트의 가장자리와 접촉할 때까지 z축의 비드를 조심스럽게 내립니다. 부드럽게 위로 당기고 미세소관 축에 수직으로 이동하여 로다민 미세소관이 구부러지는 것을 관찰하고 비드 위치를 따라 부착 여부를 확인합니다.나노 포지셔닝 단계를 이동하여 표면 부착 미세소관의 미세소관 축을 따라 로다민 미세소관을 조심스럽게 재정렬하고 미세소관 다발을 자동으로 당기기 위한 매개변수를 설정합니다. 미세 소관의 평행 축을 따라 방향을 설정하십시오. 오버랩 길이에 따라 원하는 당김 속도와 원하는 당김 시간을 설정합니다.초당 1-2 프레임의 속도로 3 개의 채널에 형광 데이터 기록을 시작합니다. 최적화 된 레이저 출력과 노출 시간을 사용하십시오. 자동 스테이지 모션을 시작하고 위치 감지 검출기 스테이지 및 전반사 형광 카메라 스테이지에서 트래핑 데이터를 기록합니다.트랩을 비활성화하여 비드를 해제하고 원하는 대로 실험을 반복합니다. 필수 유사분열 운동 단백질 키네신-5의 앙상블은 중첩 길이에 따라 선형으로 확장되는 밀기력과 제동력을 모두 생성하여 미세소관 슬라이딩을 조절할 수 있습니다. C-말단 테일 도메인은 효율적인 가교 및 힘 생성을 위해 필요하다는 것을 알 수 있었다.전장 단백질은 모든 운동 단백질이 개별 실속 력에 도달 할 때 정체되는 지속적인 힘을 생성 할 수 있습니다. 그러나 C- 단자 꼬리가없는 kinesin-5 모터는 크기가 거의 5 배 더 작은 최대 힘을 생성합니다. 비 운동 유사 분열 단백질 PRC1의 앙상블은 아나 페이즈 스핀들 중간 영역에서 미세 소관 미끄러짐에 저항하는 기계적 대시 포드로 작동합니다.저항력은 미세소관 쌍 사이의 중첩 영역 길이 또는 국소 가교제 밀도에 의존하지 않지만 결합된 PRC1 분자의 총 농도에 크게 의존합니다. 이 방법은 대체 단백질을 사용하여 미생물 조직 및 뉴런과 같은 다양한 생물학적 시스템을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 또한 액틴 기반 네트워크 형상을 분석하여 근육 수축 또는 세포 운동성을 연구하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.이 기술을 통해 필라멘트가 트랙 및화물이며 단백질의 작은 앙상블로 구성된 고유 한 세포 전체 기하학을 연구 할 수 있습니다. 이러한 기하학은 수많은 생물학적 과정에서 세포에서 일어나는 일을 더 잘 모방합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

미세 소관은 본질적으로 불안정 폴리머, 그리고 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 photoablatable 안정 캡으로 분할 미세 소관을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝 동작의 분석을 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다.

분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

진급하려면 성장 콘이 외부 환경에 대한 견인력을 발휘해야 합니다. 견인력의 생성은 액틴 역학 및 클러치 커플링에 의존합니다. 본 연구는 성장 콘 발전을 위한 액틴 역학, 클러치 커플링 및 견인력을 분석하는 방법을 설명합니다.

액틴 다이내믹스, 클러치 커플링, 성장 콘 발전을 위한 견인력 분석

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

배우세요 광학 트랩과 TIRF 현미경을 이용해 재구성된 미세소관 다발 내 힘을 직접 측정하는 방법을. 이 기술은 세포골격 역학과 단백질 상호작용의 기계적 특성을 정량화하는 데 활용됩니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

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