조립된 뉴클레오솜을 시각화하고 특성화하기 위한 정적 원자력 현미경 검사

진핵 염색질의 기본 반복 단위인 뉴클레오솜은 히스톤 단백질의 코어를 감싸는 DNA 회전으로 구성됩니다.

정적 원자력 현미경으로 조립된 뉴클레오솜을 시각화하기 위해 AFM은 표면을 양전하를 띠도록 기능화된 얇은 운모 스트립으로 시작합니다. 스트립을 작은 사각형으로 자릅니다. 조립된 뉴클레오솜 현탁액을 피펫팅합니다.

뉴클레오솜에서 음전하를 띤 DNA는 정전기 상호 작용을 통해 기능화된 운모 스트립의 양전하를 띤 그룹에 결합합니다. 뉴클레오솜 과밀화를 방지하기 위해 완충액으로 세척하십시오.

시편 지지 디스크에 운모 스트립을 고정합니다. AFM 기기 스테이지에 장착합니다.

프로브 홀더를 기기의 광학 헤드에 부착합니다. 홀더에는 정점에 팁이 있는 사전 장착된 AFM 캔틸레버가 포함되어 있습니다.

정확한 편향 측정을 위해 레이저 빔을 캔틸레버 뒷면에 정렬합니다. 팁을 뉴클레오솜 함유 표면과 직접 접촉하도록 배치합니다.

접촉 모드 이미징 중에 캔틸레버 팁이 뉴클레오솜 표면을 가로질러 스캔할 때 팁의 원자와 샘플 사이의 상호 작용에 따라 반발력이 발생합니다. 이로 인해 캔틸레버가 구부러집니다. 레이저 빔은 다르게 반사되어 위치 민감성 광검출기로 향합니다.

피드백 루프는 스캔 중 수직 스캐너 움직임에 의해 일정한 캔틸레버 편향을 유지합니다. 이 피드백 신호는 지형 뉴클레오솜 이미지를 생성하는 데 추가로 사용됩니다. 뉴클레오솜 코어는 측면 DNA를 나타내는 얇은 팔이 있는 밝은 덩어리로 나타납니다.

정적 AFM 이미징을 위해 운모 표면을 준비합니다. 이를 위해서는 먼저 탈이온수에 50밀리몰 APS 원액을 준비합니다. 필요할 때까지 용액 1밀리리터 분취량을 섭씨 4도에서 보관하십시오.

원액에서 50밀리몰 APS 원액 50마이크로리터를 증류된 탈이온수 15밀리리터에 용해시켜 운모 변형을 위한 작업 APS 용액을 준비합니다. 용액을 혼합한 다음 큐벳에 용액을 채웁니다.

다음으로, 고품질 운모 시트에서 1 x 3cm 크기의 운모 스트립을 자릅니다. 큐벳에 대각선으로 놓을 때 조각이 맞는지 확인하십시오. 그런 다음 양면이 갓 절단되고 조각이 0.1mm만큼 얇아질 때까지 운모 층을 쪼개십시오.

운모 조각을 APS로 채워진 큐벳에 넣고 운모를 30분 동안 배양합니다. 운모 조각을 증류된 탈이온수로 채워진 큐벳에 옮기고 30초 동안 담가둡니다. 그런 다음 아르곤을 사용하여 APS-운모 스트립의 양면을 완전히 건조시킵니다.

여러 개의 마그네틱 백에 양면 접착 테이프를 붙이고 옆에 놓습니다. 그런 다음 APS-운모 기판을 1cm x 1cm 정사각형으로 자르고 깨끗한 페트리 접시에 덮습니다. 다음으로, pH 7.5에서 10밀리몰 HEPES와 4밀리몰 염화마그네슘을 포함하는 0.22미크론 여과 완충액을 사용하여 조립된 뉴클레오솜의 3회 희석액을 준비합니다.

낮은 최종 농도에서 뉴클레오솜의 손실을 제한하려면 APS-운모에 증착되기 직전에 희석을 한 번에 하나씩 수행해야 합니다.

APS-운모 조각의 중앙에 각 뉴클레오솜 샘플 5-10마이크로리터를 증착하고 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 2-3밀리리터의 증류된 탈이온수로 샘플을 부드럽게 헹구어 완충액 성분을 제거하고 증착된 샘플을 아르곤의 가벼운 흐름 하에서 건조시킵니다.

시작하려면 AFM 설정의 팁 홀더에 팁을 장착합니다. 그런 다음 첫 번째 샘플을 AFM 스테이지에 장착하고 샘플 표면에 닿지 않도록 주의합니다. 합이 최대가 될 때까지 캔틸레버 위에 레이저를 배치하고 수직 및 측면 편향 값을 0에 가깝게 조정합니다. 그런 다음 AFM 프로브를 조정하여 공진 주파수를 찾습니다. 드라이브 진폭을 조정하고 이미지 크기를 100 x 100 나노미터로 설정합니다. 설정이 완료되면 참여 버튼을 클릭하여 접근 방식을 시작합니다.

접근이 완료되면 샘플 표면이 명확하게 보일 때까지 진폭 설정점을 점진적으로 최적화합니다. 그런 다음 스캔 크기를 1미크론 x 1미크론으로 늘리고 해상도를 512 x 512픽셀로 늘립니다. 마지막으로 캡처 버튼을 눌러 이미지 획득을 시작합니다.