Name: In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 학습하세요 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위한 DNA에서 in situ 뉴클레오솜 조립 방법을. 이 프로토콜은 시약 사용량을 줄이고 준비 시간을 단축하여 천연 DNA 서열에서 뉴클레오솜 밀도를 쉽게 조절할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>단일 분자 연구를 위한 현장 뉴클레오솜 재구성

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+A+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+dynamics+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and dynamics are coming of age.</a> Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nucleosome+recognition+by+chromatin+factors+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes.</a> Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).</li>
<li>Fierz, B., Poirier, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biophysics of chromatin dynamics.</a> Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-molecule+techniques%3A+A+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: A laboratory manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Chua, G. N. L., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+force+met+fluorescence%3A+Single-molecule+manipulation+and+visualization+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions.</a> Annu Rev Biophys. , (2024).</li>
<li>Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+biological+single-molecule+applications+of+optical+tweezers+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy.</a> Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt Lett. 11, 288(1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+nucleosome+assembly+onto+oligomers+of+the+sea+urchin+5+S+DNA+positioning+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence.</a> J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).</li>
<li>Salt Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gradient+dialysis+reconstitution+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">gradient dialysis reconstitution of nucleosomes.</a> CSH Protoc. 2008, 5113(2008).</li>
<li>Leicher, R., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+interaction+between+chromatin+and+chromatin-associated+complexes+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers.</a> Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442, 772-778 (2006).</li>
<li>Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+positions+predicted+through+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleosome positions predicted through comparative genomics.</a> Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).</li>
<li>Chipev, C. C., Wolffe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+organization+of+Xenopus+laevis+oocyte+and+somatic+5S+rRNA+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo.</a> Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181, 1380-1394 (2020).</li>
<li>Vlijm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+assembly+and+handedness+dynamics+of+%28H3.3-H4%292+tetrasomes+to+canonical+tetrasomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes.</a> PLoS One. 10, e0141267(2015).</li>
<li>Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+nucleosome+assembly+by+histone+chaperone+NAP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1.</a> J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).</li>
<li>Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+chromatin+assembly+on+supercoiled+plasmid+DNA+by+nucleosome+assembly+protein-1+and+ATP-utilizing+chromatin+assembly+and+remodeling+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor.</a> J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).</li>
<li>Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+chaperone+Nap1+promotes+nucleosome+assembly+by+eliminating+nonnucleosomal+histone+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions.</a> Mol Cell. 37, 834-842 (2010).</li>
<li>Wu, R., Taylor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+analysis+of+DNA.+II.+Complete+nucleotide+sequence+of+the+cohesive+ends+of+bacteriophage+lambda+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA.</a> J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).</li>
<li>King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+structural+plasticity+of+stretched+DNA+under+torsional+constraint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint.</a> Nat Commun. 7, 11810(2016).</li>
<li>Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsionally+constrained+DNA+for+single-molecule+assays%3A+An+efficient%2C+ligation-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method.</a> Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).</li>
<li>Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers in single-molecule biophysics.</a> Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).</li>
<li>Diaz-Celis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+structural+transitions+during+mechanical+unwrapping+of+nucleosomes+and+their+disassembly+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+in+silico+dissection+of+the+interaction+between+Polycomb+repressive+complex+2+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).</li>
<li>Chua, G. N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+specify+MeCP2+function+at+methylated+DNA+and+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Brower-Toland, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+disruption+of+individual+nucleosomes+reveals+a+reversible+multistage+release+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).</li>
<li>McCauley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FACT+subunits+coordinate+to+catalyze+both+disassembly+and+reassembly+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes.</a> Cell Rep. 41, 111858(2022).</li>
<li>Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+force+on+mononucleosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Effect of force on mononucleosomal dynamics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-directed+replication+origin+licensing+independent+of+a+consensus+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence.</a> Nat Commun. 13, 4947(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+recognition+complex+harbors+an+intrinsic+nucleosome+remodeling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).</li>
<li>Harada, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+nucleosome+translocation+by+RSC+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes.</a> Elife. 5, e10051(2016).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).</li>
<li>Rogge, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nucleosomal+arrays+from+recombinant+core+histones+and+nucleosome+positioning+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA.</a> J Vis Exp. (79), e50354(2013).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+nucleic+acid+binding+and+coacervation+by+linker+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1.</a> Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x HR 버퍼</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>30 mM&nbsp; 트리스&nbsp; 아세테이트 pH 7.5, 20 mM 마그네슘 아세테이트, 50 mM 염화칼륨, 0.1 mg/mL BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>1x PBS (인산염 완충 식염수)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>137 mM 염화나트륨, 2.7 mM 염화칼륨, 10 mM 인산나트륨 이염기성, 1.8 mM 인산칼륨 단염기성&nbsp;</td></tr><tr><td>아세트산, 빙하</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0074-6</td><td>트리스 아세테이트를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-BIOX-S</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-14-dATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-835-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>비오틴-14-dCTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-956-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>용해 H2O에서 0.22 um 필터를 통해 실행</td></tr><tr><td>Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye</td><td>Cytiva</td><td>PA23031</td><td>Maleimide functionalized Cy3 fluorophore</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-414-051</td><td>냉각 에틸 알코올이 있는 탁상용 원심분리기</td></tr><tr><td>, Pure</td><td>Millipore Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>밀리포어 시그마</td><td>E9884</td>는 <td>H2O에서 0.5m까지</td></tr><tr><td>인간 히스톤 옥타머(H4, L50C; H2A, K119C)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>재조합 히스톤 단백질과 표지 돌연변이를 보유한 단백질은 앞서 설명한 바와 같이 사내에서 정제하였다(참고문헌 33, 34, 35, 36 참조). 간단히 말해서, 재조합 히스톤은 BL21 (De3) pLySS 세포 (Promega)에서 발현되었다. 개재체는 초음파 처리 후 분리되었고, 히스톤은 변성 조건에서 추출되었습니다. 히스톤을 완충액 A(7M 요소, 10mM 트리스 하이드로클로라이드 pH 8.0, 100mM 염화나트륨, 1mM EDTA 및 5mM 2-메르캅토에탄올)에 투석하고, 용액을 Q Sepharose Fast Flow(Cytiva)로 로드된 중력 컬럼에 첨가했습니다. 그런 다음 흐름을 SP Sepharose Fast Flow(Cytiva)가 로드된 중력 기둥에 첨가하고, 600mM 염화나트륨이 보충된 완충액 A를 첨가하여 히스톤을 기둥에서 용출시켰습니다. 표지 돌연변이(H4, L50C; H2A, K119C)를 정제한 다음 20:1 염료 대 단백질 몰 비율을 사용하여 말레이미드 기능성 염료(Cytiva, Lumidyne)를 통해 원하는 형광단에 접합했습니다(참조 문헌 33, 34 참조). 히스톤 옥타머는 변성 조건에서 각 야생형 또는 형광단 표지 히스톤의 동일한 몰 비율을 첨가하여 조립하고, 2M 염화나트륨을 함유하는 고염 완충액으로 투석한 다음, 앞서 설명한 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피로 정제했습니다(참조 36, 37 참조). 대안적으로, 개별 히스톤 단백질과 기성품 히스톤 옥타머를 상업적으로 구입할 수 있습니다(예: 에피피퍼).&nbsp;</td></tr><tr><td>이미지 버퍼</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>20 mM 트리스 염산염 pH 8.0, 100 mM 염화나트륨</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3' to 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA (dam-, dcm-)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SD0021</td><td>Methylation-free &lambda; DNA</td></tr>, <tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne Technologies</td><td>9</td><td>Maleimide functionalized LD655 fluorophore</td></tr><tr><td>Linker histone H1.4 (A4C)</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>자체 제작 정제 재조합 단백질(ref. 38 참조),</td></tr> <tr><td>LUMICKS C-Trap Dymo</td><td>LUMICX</td><td>N/A</td><td>이중 트랩 구성, 제조업체에서 제공하는 기기의 표준 재료</td></tr><tr><td>마그네슘 아세테이트 용액</td><td>Millipore Sigma</td><td>63052-100ML</td><td>HR 버퍼를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Klenow Fragment 키트에 포함</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>H2O에 용해하고 0.22 um 필터를 통과</td></tr> 염화<tr><td>칼륨</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>PBS 및 HR 버퍼를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>인산칼륨 단염기성</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662</td><td>PBS</td></tr><tr><td>S. cerevisiae Nap1</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Nap1을 만드는 데 사용: 앞서 설명한 바와 같이 사내에서 정제하였다(참고문헌 33, 34 참조). 대안적으로, Nap1은 상업적으로 구매될 수 있다(예를 들어, Active Motif).</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Millipore 시그마</td><td>241245</td><td>H2O에 용해 3m</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>PBS 및 이미지 버퍼를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763</td><td>PBS</td></tr><tr><td>SPHERO 비오틴 코팅 입자 (3.0-3.4 &micro; m)</td> <td>Spherotech</td><td>TP-30-5</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c 분광 광도계</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>NanoDrop 분광 광도계</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>H2O에 용해하고 적절한 pH로 조정; 이미지 버퍼 및 트리스 아세테이트를 만드는 데 사용</td></tr></tbody></table>

in situ nucleosome assembly for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

3단계(그림 1A)에 설명된 설정을 사용하여 DNA 테더를 따른 뉴클레오솜 형성을 2D 스캔(그림 1B, 왼쪽)에서 빨간색 형광 병소의 모양 또는 카이모그래프(그림 1B, 오른쪽)에서 시간 경과에 따른 궤적으로 시각화했습니다. 적절하게 래핑된 뉴클레오솜은 컨포칼 검출의 회절 한계(~300nm) 내에서 시간이 지남에 따라 정지된 형광 궤적을 생성했습니다. 특히, 회절 한계 하에서 서로 가까이 형성된 여러 뉴클레오솜은 공간적으로 분해될 수 없으며 더 밝은 초점 또는 궤적으로 나타납니다. 그럼에도 불구하고 개별 뉴클레오솜 궤적의 광표백 단계를 분석한 결과 1단계(그림 1C) 또는 2단계(그림 1D) 광표백 현상이 자주 나타났으며, 이는 이 샘플에서 H4 단백질의 약 70% 라벨링 속도를 감안할 때 병소에 대부분 단핵체가 포함되어 있음을 나타냅니다. 더욱이, 이 실험 조건에서 단일 LD655 형광단의 평균 광자 수를 기반으로 각 뉴클레오솜 궤적에서 표지된 H4 사본의 수를 추정하고 뉴클레오솜 유전자좌가 우세하게(&gt;75%) 1개 또는 2개의 표지된 H2A 사본을 포함하고 있음을 보여주었으며(그림 1E), 이들이 주로 공간적으로 분리된 단핵소체로 로드되었다는 개념과 일치합니다. 다른 더 밝은 병소에는 표지된 H4의 복사본이 3개 이상 포함되어 있으며, 이는 회절 한계 내에 있는 여러 뉴클레오솜을 나타낼 수 있습니다.
뉴클레오솜 형성은 또한 더 많은 DNA가 히스톤 옥타머를 감싸면서 OTs의 위치가 일정하게 유지될 때 테더를 따라 장력의 증가에 의해 모니터링되었습니다(그림 1B, 하단). Nap1이 없는 경우, 히스톤 옥타머는 여전히 DNA를 결합할 수 있지만 OT 위치가 유지될 때 관련 장력이 일정하게 유지되었기 때문에 대부분 감싸지 않은 상태로 남아 있습니다(그림 1F). DNA에 대한 히스톤 옥타머의 비특이적 결합은 Nap1의 존재 하에서도 발생할 수 있습니다. 또 다른 실험에서는 Cy3 표지 H2A를 포함하는 뉴클레오솜을 형성하기 위한 동일한 프로토콜이 수행되었으며, 이는 LD655 표지 H4(그림 1G)로 수행된 것과 유사한 결과를 산출했으며, 이는 온전한 옥타머가 뉴클레오솜으로 조립되었음을 나타냅니다.
4단계(그림 2A)에 설명된 설정을 사용하여 테더 거리가 증가함에 따라 시간이 지남에 따라 뉴클레오솜 해제를 키모그래프에서 시각화했습니다(그림 2B). 이전에 히스톤 옥타머는30,31 풀린 후에도 DNA에 묶인 상태로 남아 있는 경우가 많으므로 형광 궤적은 높은 장력에서도 종종 지속된다고 보고되었습니다. 뉴클레오솜 언래핑(nucleosome unwrapping)은 관련 FD 곡선에서도 모니터링되었습니다(그림 2C). FD 곡선의 정량화 가능한 특징은 뉴클레오솜(들)이 풀리는 힘(그림 2C 삽입물의 "전이 F" 참조)뿐만 아니라 히스톤 옥타머(그림 2C 삽입물의 "ΔL" 참조)에서 방출된 DNA의 길이를 포함하며, 이는 ~24nm의 배수로 존재하며, 개별 뉴클레오솜27의 DNA의 내부 회전의 독립적인 언래핑과 일치하며, 30입니다. 이러한 파라미터는 각 테더에 형성된 뉴클레오솜의 수를 추정하거나 뉴클레오솜 역학의 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 이와 같이, 기계적 당김 실험에서 얻어진 내회전 파열의 수는 단량체 강도를 기반으로 각 뉴클레오솜 궤적에서 라벨링된 H4 사본의 추정 수와 비교되었으며, 이는 수치가 대체로 일관됨을 보여주었습니다(그림 2D-G에 표시된 예). 그러나, 그림 1F와 같이 샘플에서 H4 단백질의 ~ 70 % 라벨링 효율과 DNA에 대한 잔류 Nap1 독립적 인 히스톤 결합으로 인해 완벽하게 일치하지 않는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 예상대로 Nap1 결합 베어 DNA 테더(히스톤 없음)를 늘리면 힘에 의한 전이가 생성되지 않으며(그림 2H), 이는 Nap1 단독으로 DNA를 크게 왜곡하지 않음을 나타냅니다.
5 단계 (그림 3A)에서 설명 한 설정을 사용하여 링커 히스톤 H1과 염색질 간의 결합은 염색질 테더를 따라 녹색 형광 초점의 출현으로 시각화되었습니다 (그림 3B). 특히, H1 결합 뉴클레오솜은 시간이 지남에 따라 정지해 있는 것처럼 보이는 이중 색상 궤적( 그림 3B의 흰색 화살표 참조)을 생성했습니다. 또한, 뉴클레오솜이 없는 DNA 영역에 걸쳐 확산되는 H1 궤적이 관찰되었습니다( 그림 3B의 녹색 별 참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig01.jpg"> 그림 1: Nap1 매개 in situ nucleosome 형성. (A) Nap1 매개 현장 뉴클레오솜 형성 프로토콜(3단계)에 설명된 실험 설정의 개략도. 한 쌍의 비드를 ch. 1에 광학적으로 포획하고, ch. 2에서 비오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 단일 λ DNA 분자를 비드 사이에 연결했습니다. 그런 다음 테더를 DNA 전체에 걸쳐 뉴클레오솜의 실시간 형성을 위해 LD655 표지된 히스톤 옥타머(빨간색) 및 Nap1을 포함하는 ch. 4로 이동했습니다. (B) LD655-H4 표지된 뉴클레오솜 함유 DNA 테더의 대표적인 2D 스캔(왼쪽) 및 카이모그래프(오른쪽). 관련 힘 판독값(하단)은 OT 위치가 일정하게 유지될 때 테더가 ch. 4로 이동하면 즉시 힘이 증가하며, 이는 뉴클레오솜 래핑을 나타냅니다. 더 밝은 궤적은 ~300nm의 회절 한계 내에 위치한 여러 개의 인접한 뉴클레오솜을 의미합니다. (C) LD655-H4를 포함하는 뉴클레오솜의 1단계 광퇴백 이벤트(흰색 화살표)를 보여주는 키모그래프의 예. (D) LD655-H4를 포함하는 뉴클레오솜의 2단계 광표백 이벤트(흰색 화살표)를 보여주는 키모그래프의 예. (E) 형광 강도에서 추정된 궤적당 LD655-labeled H4 수의 상대 주파수. (F) Nap1이 없는 경우 히스톤 옥타머로 결합된 테더의 대표 키모그래프. 관련 힘 판독 값 (하단)은 히스톤 옥타머가 DNA를 결합하더라도 변하지 않습니다. (G) Cy3-H2A 표지된 뉴클레오솜 함유 DNA 테더의 대표 키모그래프. 관련 힘 판독값(하단)은 테더가 ch. 4(옥타머 및 Nap1 포함)로 이동하자마자 힘이 증가함을 보여주며, 이는 OT 위치가 일정하게 유지될 때 뉴클레오솜이 형성되기 때문입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig02.jpg"> 그림 2: 뉴클레오솜 풀림 분석법. (A) 언래핑 뉴클레오솜 프로토콜(4단계)에 설명된 실험 설정의 개략도. 뉴클레오솜을 함유하는 DNA 테더를 단백질이 없는 이미지 버퍼를 포함하는 ch. 3으로 이동하여 비드 간 거리를 늘리고 뉴클레오솜을 풀었습니다. (B) 뉴클레오솜 함유 DNA 테더의 대표적인 키모그래프는 비드 간 거리를 점차적으로 증가시켜 높은 힘으로 당겨졌습니다. 하단 비드로 향하는 형광 강도의 감소는 DNA가 라인 스캐닝 초점에서 약간 기울어졌기 때문일 수 있습니다. (C) 8-37 pN 사이에서 발생하는 내부 회전 언래핑의 힘 유도 전이를 보여주는 관련 FD 곡선. 삽입물은 풀린 거리(개별 뉴클레오솜의 DNA 내부 회전에 대한 ΔL = ~24nm)와 전이 힘(전이 F)을 기록하고 추가로 분석할 수 있는 전이의 예를 확대하여 보여줍니다. 이 테더의 경우 26개의 뉴클레오솜이 풀렸고 테더는 카이모그래프의 흰색 점선으로 표시된 것처럼 ~65pN에서 파열되었습니다. (D,E) 예: LD655-H4 뉴클레오솜 함유 테더는 궤적당 H4의 수가 형광 강도를 통해 추정되고(카이모그래프, D에 표시됨) 래핑된 뉴클레오솜의 수는 힘에 의한 거리 변화의 크기(관련 힘-거리 곡선, E에 표시)를 통해 추정됩니다. (에프,지) (D,E)와 같은 또 다른 예입니다. (H) DNA 테더(n = 5)는 Nap1만 포함하는 채널에서 배양된 후 높은 힘으로 당겨집니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig03.jpg"> 그림 3: 단백질-염색질 상호 작용 시각화. (A) 염색질 프로토콜에 대한 단백질 결합 시각화(5단계)에 설명된 실험 설정의 개략도. 뉴클레오솜을 함유하는 DNA 테더를 10nM의 Cy3-표지된 링커 히스톤 H1(녹색)을 함유하는 ch. 5로 이동시켰다. (B) 뉴클레오솜 함유 DNA 테더에 결합하는 H1의 대표적인 2색 키모그래프. H1-뉴클레오솜 공동 국소화 이벤트는 흰색 화살표로 표시됩니다. 결합되지 않은 뉴클레오솜 궤적은 자홍색 화살표로 표시됩니다. 벌거벗은 DNA에 확산되는 H1 분자는 녹색 별표로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

in-situ-nucleosome-assembly-for-single-molecule-correlative-force

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

원자력 교통 단일 분자 이미징

이 비디오는 단일 분자 이미징을 사용하여 특정 유전자 자리에서 DNA 분자의 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이러한 응축물은 LCD-LCD 및 LCD-DBD 상호 작용으로 인해 형성되며, 이를 통해 RNA 중합효소 II를 동원하고 유전자 전사를 향상시킬 수 있습니다.

DNA 커튼에서 융합 단백질 응축물 어셈블리를 시각화하기 위한 단일 분자 이미징

이 비디오에서는 조립된 뉴클레오솜을 시각화하기 위한 정적 원자력 현미경을 시연합니다. 이 고해상도 이미징 기술을 통해 뉴클레오솜 구조를 연구할 수 있습니다.

조립된 뉴클레오솜을 시각화하고 특성화하기 위한 정적 원자력 현미경 검사

이 비디오에서는 뉴클레오솜 복합체의 역학을 연구하기 위한 고속 저속 원자력 현미경, AFM, 이미징 기술을 시연합니다. AFM 팁은 뉴클레오솜 표면을 스캔하면서 뉴클레오솜 높이의 변화를 감지하고 시간이 지남에 따라 DNA가 풀리는 것을 기록합니다.

뉴클레오솜 역학을 포착하기 위한 고속 타임랩스 원자력 현미경

방법은 재조합 핵심 히스톤에서 모델 뉴 클레오 어레이의 재구성 및 tandemly 반복 뉴 클레오 솜 위치의 DNA에 표시됩니다. 또한 분석에서 초 원심 침강 속도 실험, 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 재구성 후의 뉴 클레오 배열 포화 정도를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

재조합 핵심 히스톤에서 뉴 클레오 배열과 뉴 클레오 솜 위치 DNA의 조립

여기에서 우리는이 광학적으로 포획 된 마이크로 스피어 사이 일시 중지 하나의 DNA 분자와 상호 작용하는 하나의 형광 표지 단백질 분자를 검출하기위한 장비 및 방법에 대해 설명합니다.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

여기에서는 슬라이드 장착형 염색체에서 반복적인 이색성 염기서열을 시각화하기 위해 형광 DNA 제자리 혼성화(DNA ISH)를 수행하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 최소한의 시약만 필요하며 짧거나 긴 프로브, 다양한 조직, 형광 또는 비형광 기반 신호로 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

여기, 우리는 프로토콜 nucleosome 정적 및 시간 경과 원자 힘 현미경 (AFM) 이미징 기술을 사용 하 여 단일 분자 수준에서 입자의 특성을 제시. 설명 된 표면 기능화 방법 구조의 캡처 및에 nucleosomes의 역학에 대 한 수는 nanoscale에 고해상도.

구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사

본 프로토콜은 단일 분자 국소화 현미경 데이터, 알려진 부피, 게놈 크기 및 세포 주기 단계의 보로노이 테셀레이션을 사용하여 부착 세포 핵 내의 절대 DNA 밀도를 측정하는 방법을 설명합니다.

단일 분자 국소화 현미경을 사용한 세포 핵의 절대 DNA 밀도 매핑

이 프로토콜은 DNA 고유 형광 스펙트럼의 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 대한 상세한 작업을 제공합니다.

내재 대비를 이용한 DNA 분광학적 초해상도 영상

이 프로토콜은 최적화된 분리, 고정, 표지를 활용하여 분리된 애기장대 핵의 단일 분자 위치 현미경 영상을 효율적으로 수행하여 크로마틴과 RNA 중합효소 II의 신뢰성 있는 나노 규모 시각화를 달성합니다. 이 접근법은 고해상도 영상을 위한 다른 염색질 관련 단백질이나 히스톤 변형에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

애기장대 핵에서 단일 분자 위치 현미경을 위한 간소화된 프로토콜

학습하세요 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위한 DNA에서 in situ 뉴클레오솜 조립 방법을. 이 프로토콜은 시약 사용량을 줄이고 준비 시간을 단축하여 천연 DNA 서열에서 뉴클레오솜 밀도를 쉽게 조절할 수 있습니다.

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

더 많은 동영상 탐색