인간 골격근의 글리코겐 분포를 정량화하기 위한 투과 전자 현미경

분지형 포도당 중합체인 글리코겐은 인간 골격근 내의 세포하근원섬유간, 근원섬유내 및 근막하 구획의 에너지 비축량입니다.

투과전자현미경(TEM)을 사용하여 세포내 글리코겐 분포를 정량화하기 위해 분리된 인간 골격근 조직을 얻습니다. 조직 구조를 보존하기 위해 글루타르알데히드로 고정합니다. 사산화오스뮴과 페로시안화칼륨 용액에 조직을 붙입니다.

환원된 오스뮴-페로시안화물 복합체는 글리코겐의 수산기에 결합하여 근육에서 글리코겐 입자의 대비를 향상시킵니다. 또한 막과 근질 소망(막에 결합된 소기관)이 염색됩니다.

에탄올 농도를 증가시켜 조직을 탈수합니다. 수지에 매립하여 단단한 블록을 형성합니다. 세로 방향의 근육 섬유가 있는 초박형 절편을 얻습니다. TEM 그리드로 전송합니다.

그리드를 우라닐 아세테이트, 중금속 용액에 담그십시오. 우라닐 이온은 음전하를 띤 지질과 단백질에 결합하여 전자 밀도가 높습니다. 구연산납 용액으로 염색합니다.

납 이온은 글리코겐 입자를 포함한 오스뮴 염색 영역에 결합하여 대비를 향상시킵니다. 그들은 또한 우라닐 아세테이트 반응 영역에 결합하여 전자 불투명도를 강화합니다.

TEM 이미징 중에 전자빔이 조직을 통과할 때 글리코겐을 포함한 염색된 전자 밀도 영역은 더 많은 전자를 산란시키는 반면 염색되지 않은 영역은 전자를 투과시킵니다.

생성된 고대비 TEM 이미지에서 글리코겐 입자는 뚜렷하고 어둡게 나타납니다. 염색되지 않은 영역은 더 밝게 나타나 근육의 세포 내 글리코겐 분포의 시각화 및 정량화를 용이

근육 생검 또는 전체 근육에서 작은 표본을 분리하는데, 이는 모든 방향으로 최대 직경이 1mm이고 단면보다 세로로 더 깁니다.

차가운 1차 고정 용액이 들어 있는 튜브에 표본을 넣습니다. 섭씨 5도에서 24시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 검체를 0.1몰 카코딜레이트나트륨 완충액으로 4회 세척합니다. 이송 피펫을 사용하여 검체를 그대로 두고 튜브에서 사용한 완충액을 제거하고 새 완충액을 추가합니다. 1% 사산화오스뮴 및 1.5% 페로시안화칼륨을 섭씨 4도에서 120분 동안 0.1몰 나트륨 카코딜레이트 완충액에 사후 고정합니다.

실온에서 이중 증류수로 표본을 두 번 헹굽니다. 실온에서 등급이 매겨진 일련의 에탄올에 담가 탈수합니다. 언급된 부피비를 사용하여 실온에서 프로필렌 옥사이드 및 에포시딕 수지 등급 혼합물로 시편에 침투시킵니다.

다음날 100% 신선한 에포시딕 레진에 시편을 금형에 묻히고 섭씨 60도에서 48시간 동안 중합합니다.

초마이크로톰 홀더에 표본 블록을 장착합니다. 면도날로 표면의 블록을 다듬어 조직 수준에 도달합니다. 샘플 앞에 다이아몬드 나이프를 장착하고 샘플 표면을 칼과 평행하게 정렬합니다.

다이아몬드 나이프로 1마이크로미터 두께의 반박형 단면을 만들어 시료의 방향을 확인합니다. 광학 현미경으로 관찰하기 위해 반박 절편을 톨루이딘 블루로 염색합니다. 그런 다음 블록을 더 다듬어 관심 영역을 줄여 적절한 초박형 섹션을 얻습니다.

두 번째 다이아몬드 나이프로 60-70나노미터 두께의 초박형 절편을 절단합니다. Perfect Loop를 사용하여 1홀 구리 그리드에 1-2개의 섹션을 수집합니다. 절편을 대조하기 위해 그리드를 우라닐 아세테이트 용액에 20분 동안 담그고 그리드를 이중 증류수로 세척한 다음 그리드를 구연산납에 15분 동안 담근 다음 그리드를 이중 증류수로 다시 세척합니다.

투과 전자 현미경, 컴퓨터 및 이미지 기록 소프트웨어를 켭니다. 디지털 슬로우 스캔 CCD 카메라 및 관련 이미징 소프트웨어로 디지털 이미지를 기록합니다. 현미경 단계에서 여러 절편이 있는 그리드를 삽입한 후 처음에는 저배율로 그리드를 스크리닝하여 최고 품질의 절편을 선택하고 근육 섬유의 방향을 결정합니다.

그런 다음 빔이 섹션의 주변 광섬유를 중심으로 30,000 이상의 배율로 이미지에 초점을 맞추고 원하는 배율에서 1초의 노출 시간으로 이미지를 기록합니다. 이미지가 편향되지 않은 결과를 얻기 위해 무작위적이지만 체계적인 순서로 광섬유의 길이와 너비에 걸쳐 분포되어 있는지 확인하고 6-10개의 광섬유가 이미지화될 때까지 이미징을 반복합니다.

파일을 클릭한 다음 열기를 클릭하여 이미지를 imageJ로 가져옵니다. 분석을 클릭한 다음 크기를 클릭하여 이미지의 원래 크기와 일치하도록 전역 배율을 설정합니다. 100% 확대하려면 이미지를 클릭하고 확대/축소로 이동한 다음 입력을 클릭합니다.

도구 메뉴의 직선 도구를 사용하여 근원섬유 공간의 이미지당 하나의 Z-디스크의 두께를 측정하고 6-10개의 섬유 각각의 평균 Z-디스크 두께를 계산합니다. 세그먼트 라인 도구를 사용하여 근막하 영역 바로 아래에 보이는 가장 바깥쪽 근원섬유의 길이를 측정합니다.

그리드를 삽입하려면 분석을 클릭하고 도구를 선택한 다음 그리드를 선택합니다. 이제 포인트당 면적을 32,400제곱나노미터로 설정합니다. 십자가가 근막하 글리코겐에 부딪히는 12개의 근막하 이미지에서 사용 가능한 길이 내에서 적중 횟수를 계산합니다.

분석을 클릭하여 그리드를 삽입한 다음 도구, 그리드를 차례로 선택하고 포인트당 면적을 160,000제곱나노미터로 설정합니다. 십자가가 근원섬유 내 공간에 부딪히는 12개의 근원섬유 이미지에서 적중 횟수를 계산합니다.

그런 다음 다시 그리드를 삽입하려면 분석을 클릭하고 도구를 선택한 다음 그리드를 선택합니다. 이제 포인트당 면적을 3,600제곱나노미터로 설정합니다. 십자가가 근원섬유 내 글리코겐에 부딪히는 12개의 근원섬유 이미지에서 적중 횟수를 계산합니다.

분석을 클릭하여 그리드를 삽입한 다음 도구, 그리드를 차례로 선택하고 포인트당 면적을 32,400제곱나노미터로 설정합니다. 십자가가 근원섬유간 글리코겐에 부딪히는 12개의 근원섬유 이미지에서 적중 횟수를 계산합니다.

32,400제곱나노미터 그리드를 사용하여 글리코겐 입자를 무작위로 선택하고 왼쪽 상단 사각형부터 시작하여 필요한 경우 왼쪽으로 이동합니다. 직선 도구를 사용하여 12개의 이미지 각각에 대해 각 풀에서 무작위로 선택된 5개의 글리코겐 입자의 직경을 측정하여 섬유당 풀당 평균 60개의 입자를 얻습니다.