인간 골격근의 글리코겐 분포를 정량화하기 위한 투과 전자 현미경

분지형 포도당 중합체인 글리코겐은 인간 골격근 내의 세포하근원섬유간, 근원섬유내 및 근막하 구획의 에너지 비축량입니다.

투과전자현미경(TEM)을 사용하여 세포내 글리코겐 분포를 정량화하기 위해 분리된 인간 골격근 조직을 얻습니다. 조직 구조를 보존하기 위해 글루타르알데히드로 고정합니다. 사산화오스뮴과 페로시안화칼륨 용액에 조직을 붙입니다.

환원된 오스뮴-페로시안화물 복합체는 글리코겐의 수산기에 결합하여 근육에서 글리코겐 입자의 대비를 향상시킵니다. 또한 막과 근질 소망(막에 결합된 소기관)이 염색됩니다.

에탄올 농도를 증가시켜 조직을 탈수합니다. 수지에 매립하여 단단한 블록을 형성합니다. 세로 방향의 근육 섬유가 있는 초박형 절편을 얻습니다. TEM 그리드로 전송합니다.

그리드를 우라닐 아세테이트, 중금속 용액에 담그십시오. 우라닐 이온은 음전하를 띤 지질과 단백질에 결합하여 전자 밀도가 높습니다. 구연산납 용액으로 염색합니다.

납 이온은 글리코겐 입자를 포함한 오스뮴 염색 영역에 결합하여 대비를 향상시킵니다. 그들은 또한 우라닐 아세테이트 반응 영역에 결합하여 전자 불투명도를 강화합니다.

TEM 이미징 중에 전자빔이 조직을 통과할 때 글리코겐을 포함한 염색된 전자 밀도 영역은 더 많은 전자를 산란시키는 반면 염색되지 않은 영역은 전자를 투과시킵니다.

생성된 고대비 TEM 이미지에서 글리코겐 입자는 뚜렷하고 어둡게 나타납니다. 염색되지 않은 영역은 더 밝게 나타나 근육의 세포 내 글리코겐 분포의 시각화 및 정량화를 용이

하게 합니다.

근육 생검 또는 전체 근육에서 작은 표본을 분리하는데, 이는 모든 방향으로 최대 직경이 1mm이고 단면보다 세로로 더 깁니다.

차가운 1차 고정 용액이 들어 있는 튜브에 표본을 넣습니다. 섭씨 5도에서 24시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 검체를 0.1몰 카코딜레이트나트륨 완충액으로 4회 세척합니다. 이송 피펫을 사용하여 검체를 그대로 두고 튜브에서 사용한 완충액을 제거하고 새 완충액을 추가합니다. 1% 사산화오스뮴 및 1.5% 페로시안화칼륨을 섭씨 4도에서 120분 동안 0.1몰 나트륨 카코딜레이트 완충액에 사후 고정합니다.

실온에서 이중 증류수로 표본을 두 번 헹굽니다. 실온에서 등급이 매겨진 일련의 에탄올에 담가 탈수합니다. 언급된 부피비를 사용하여 실온에서 프로필렌 옥사이드 및 에포시딕 수지 등급 혼합물로 시편에 침투시킵니다.

다음날 100% 신선한 에포시딕 레진에 시편을