투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

수정 된 고정 후 절차는 조직에서 글리코겐 입자의 대비를 증가시킵니다. 이 논문은 조직을 처리하고, 이미징을 수행하고, 입체 학적 방법을 사용하여 골격근에서 섬유 유형 별 세포 내 글리코겐 분포에 대한 편향되지 않은 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제공합니다.

단일 세포 및 아세포 조직에서 글리코겐 함량의 측정은 대부분의 세포 유형에서 단일 세포가 변화하는 생리적 조건 및 질병에 다르게 적응하기 때문에 중요합니다. 따라서이 기술의 가장 큰 장점은 투과 전자 현미경에서 매우 높은 해상도입니다. 이것은 국소화된 아세포 구조를 가질 가능성을 개선시키고, 또한 여기에서 이 기술에서의 이러한 함량에서, 글리코겐 염색이 항체가 없는 것이 중요하다.

따라서 우리는 걱정할 특이성이 없습니다. 글리코겐에 대한 더 나은 대조를 얻으려면 페로시아나이드 칼륨 대신 칼륨 페로시아나이드 1.5 %를 사용하십시오. 2 밀리리터 마이크로 센트레이션 튜브에서 0.1 몰 소듐 카코딜레이트 완충액에 2.5 % 글루타르 알데히드를 첨가하여 1.6 밀리리터의 1 차 고정 용액을 준비하십시오.

최대 14 일 동안 섭씨 5도에 보관하십시오. 근육 생검 또는 모든 방향에서 한 밀리미터의 최대 직경을 가지며 단면보다 세로 방향으로 더 긴 전체 근육에서 작은 표본을 분리하십시오. 시편을 차가운 일차 고정 용액이 들어있는 튜브에 넣으십시오.

24 시간 동안 섭씨 다섯 도에 보관하십시오. 그런 다음 시편을 0.1몰 소듐 카코딜레이트 완충액으로 네 번 세척한다. 전사 피펫을 사용하여 튜브에서 사용 된 버퍼를 제거하고 시편을 손대지 않은 상태로 유지하고 신선한 버퍼를 추가하십시오.

시편을 0.1몰 소듐 카코딜레이트 완충액에 1%오스뮴 테트록사이드와 1.5%칼륨 페로시아나이드로 섭씨 4도에서 120분 동안 고정시킨 후 고정시킨다. 시편을 실온에서 이중 증류수로 두 번 헹구십시오. 실온에서 등급화된 일련의 에탄올에 침수하여 탈수시킨다.

언급된 부피비를 사용하여 실온에서 프로필렌 옥사이드 및 에포시드 수지 등급화된 혼합물로 시편을 침윤시킨다. 다음날 시편을 몰드에 100 % 신선한 에포시 성 수지에 넣고 섭씨 60도에서 48 시간 동안 중합하십시오. 초미세 전극 홀더에 시편 블록을 장착하십시오.

면도날로 표면의 블록을 트리밍하여 조직 수준에 도달하십시오. 샘플 앞에 다이아몬드 나이프를 장착하고 샘플 표면을 나이프에 평행하게 정렬합니다. 샘플의 방향을 확인하기 위해 다이아몬드 나이프로 한 마이크로 미터 두께의 반 얇은 섹션을 제작하십시오.

가벼운 현미경으로 관찰하기 위해 톨루이딘 블루로 반 얇은 부분을 얼룩지게하십시오. 그런 다음 블록을 더 트리밍하여 관심 영역을 줄여 적절한 초박형 섹션을 얻으십시오. 두 번째 다이아몬드 나이프로 60 ~ 70 나노 미터 두께의 초박형 섹션을 자릅니다.

완벽한 루프를 사용하여 하나의 전체 구리 그리드에서 하나 ~ 두 개의 섹션을 수집합니다. 섹션을 대조하기 위해 그리드를 우라닐 아세테이트 용액에 20 분 동안 담그고 그리드를 이중 증류수로 세척 한 다음 그리드를 납 시트레이트에 15 분 동안 담근 다음 그리드를 이중 증류수로 다시 세척하십시오. 전송 전자 현미경 컴퓨터 및 이미지 녹화 소프트웨어를 켜고 디지털 슬로우 스캔 CCD 카메라 및 관련 이미징 소프트웨어로 디지털 이미지를 기록하십시오.

현미경 단계에서 여러 섹션이있는 그리드를 삽입 한 후 처음에는 낮은 배율로 그리드를 스크린하여 최상의 품질의 섹션을 선택하고 근육 섬유의 방향을 결정합니다. 다음으로, 30, 000 이상의 배율에서 이미지를 단면의 주변 섬유에 중심을 둔 빔과 함께 원하는 배율로 한 초 노출 시간으로 이미지를 기록합니다. 무작위 봇 체계적으로 이미지가 섬유의 길이와 너비에 걸쳐 분포되어 편향되지 않은 결과를 얻고 여섯 ~ 10개의 섬유가 이미징될 때까지 이미징을 반복하십시오.

파일을 클릭 한 다음 열어 이미지 J로 이미지를 가져옵니다. 분석을 클릭하여 이미지의 원래 크기와 일치하도록 전역 배율을 설정한 다음 배율을 설정합니다. 100 % 확대하려면 이미지를 클릭하고 확대 / 축소로 이동하여 클릭하십시오.

도구 메뉴에서 직선 도구를 사용하여 myofibrillar 공간의 이미지 당 하나의 Z 디스크의 두께를 측정하고 여섯 ~ 10 개의 섬유 각각의 평균 Z 디스크 두께를 계산하십시오. 세그먼트 선 도구를 사용하여 아사르콜렘말 영역 바로 아래에 보이는 최외곽 근피브릴의 길이를 측정합니다. 격자를 삽입하려면 분석을 클릭하고 도구를 선택한 다음 격자를 선택합니다.

이제 점 당 면적을 32, 400 평방 나노 미터로 설정하십시오. 십자가가 아사르콜렘말 글리코겐에 부딪히는 12개의 아사르콜렘말 이미지에서 사용 가능한 길이 내의 히트 수를 계산합니다. 분석을 클릭하여 그리드를 삽입 한 다음 도구를 선택한 다음 그리드를 선택하고 점당 면적을 160, 000 평방 나노 미터로 설정합니다.

십자가가 myofibrillar 내부 공간에 부딪히는 12 번째 myofibrillar 이미지에서 히트 수를 계산하십시오. 그런 다음 다시 그리드를 삽입하려면 분석을 클릭하고 도구를 선택한 다음 그리드를 선택하십시오. 이제 점 당 면적을 3, 600 평방 나노 미터로 설정하십시오.

십자가가 myofibrillar 내 글리코겐에 부딪히는 12번째 myofibrillar 이미지에서 히트의 수를 계산합니다. 분석을 클릭하여 그리드를 삽입 한 다음 도구를 선택한 다음 그리드를 선택하고 점당 면적을 32, 400 평방 나노 미터로 설정합니다. 십자가가 intermyofibrillar 글리코겐에 부딪히는 12번째 myofibrillar 이미지에서 히트의 수를 계산합니다.

32, 400 평방 나노 미터 그리드를 사용하여 글리코겐 입자를 무작위로 선택하고 왼쪽 상단 사각형으로 시작하여 필요한 경우 왼쪽으로 이동하십시오. 직선 도구를 사용하여 12개의 이미지 각각에 대해 각 풀의 무작위로 선택된 다섯 개의 글리코겐 입자의 직경을 측정하여 섬유당 풀당 평균 60개의 입자를 얻습니다. 이 그림은 세 개의 글리코겐 풀의 정상 값을 보여줍니다.

인터미오피브릴라 글리코겐 값이 정상에 가깝게 분포하는 것을 관찰할 수 있는 반면, 근박근 내 글리코겐과 아사르콜렘말의 글리코겐 둘 다 섬유가 때때로 과도한 양의 글리코겐을 갖는 비뚤어진 분포를 보인다. 모든 단계 중에서 칼륨 페로 시아 나이드를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 글리코겐의 분석은 미토콘드리온 및 지질 방울의 분석과 결합 될 수 있으며, 이는 다른 주요 대사 성분이 글리코겐 및 근육 건강과 어떻게 관련되는지에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.