Name: 투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 투과 전자 현미경을 이용한 세포하 글리코겐 정량화 방법을 골격근섬유에 적용하여 무편향적 분포 분석을 수행하는 기법입니다. 이 프로토콜은 대사 연구에 필수적인 고해상도 시각화를 제공합니다.

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이 작업은 스웨덴 올림픽 위원회의 지원을 받았다.

인간 생검된 골격근 샘플을 사용하는 본 프로토콜은 남부 덴마크를 위한 건강 연구 윤리에 관한 지역 위원회(The Regional Committees on Health Research Ethics for Southern Denmark, S-20170198)에 의해 승인되었다. 근육 생검은 국소 마취 후 흡입과 함께 베르그스트롬 바늘을 사용하여 혈관측방 근으로부터 피부 절개를 통해 얻어졌으며 피하로 주어졌다(절개당 리도카인 1-3 mL 2%). 분리된 전체 래트 근육이 사용되면, 덴마크 오덴세 대학 병원의 동물 윤리위원회의 지침에 따라 근육 생검이 얻어지기 전에 자궁 경부 탈구에 의해 동물을 희생시켰다.
1. 1차 고정, 사후 고정, 임베딩, 단면화 및 대조
<ol><li>2 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 1.6 mL의 1차 고정 용액(0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액(pH 7.3) 중 2.5% 글루타르알데히드)을 준비한다. 최대 14 일 동안 5 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>근육 생검 또는 전체 근육에서 어떤 방향으로든 최대 직경이 1mm이고 단면보다 세로 섬유 방향으로 약간 더 긴 작은 표본을 분리하십시오 (방향 목적).</li>
	<li>시편을 차가운 일차 고정 용액이 들어있는 튜브에 넣으십시오. 5°C에서 24시간 동안 보관한다.</li>
	<li>시편을 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액 (pH 7.3)에서 네 번 (각 세척 사이에 15분) 세척한다. 전사 피펫을 사용하여 튜브에서 사용 된 버퍼를 제거하고 시편을 그대로 둔 다음 신선한 버퍼를 추가하십시오. 참고: 최종 세척 후, 시편은 수개월 동안 5°C의 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액에 저장될 수 있다11. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>4°C에서 120분 동안 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액(pH 7.3)에 1% 오스뮴 테트록사이드(OsO4) 및 1.5% 포타슘 페로시아나이드(K4Fe(CN)6)를 사용한 후술어. 참고: 1.5% 칼륨 페로시아나이드(K4Fe(CN)6)의 사용은 글리코겐 입자11,12,13의 최적 대비를 위해 필수적입니다.</li>
	<li>실온에서 이중 증류수(RT)로 두 번 헹구십시오.</li>
	<li>RT에서 등급화된 일련의 알코올(에탄올)에 침수하여 탈수시켜 다음 농도를 사용한다: 70%(10분), 70%(10분), 95%(10분), 100%(10분), 및 100%(10분). 참고 : 각 단계에서 시편은 에탄올에 잠겨 시편의 건조를 피하기 위해 부분적으로 만 제거됩니다. 마지막으로, 남은 에탄올은 버려진다.</li>
	<li>다음 부피비(프로필렌 옥사이드/에포시드 수지)를 사용하여 RT에서 프로필렌 옥사이드와 에포시드 수지의 등급화된 혼합물로 침윤: 1/0 (10 분), 1/0 (10 분), 3/1 (45 분), 1/1 (45 분), 1/3 (45 분), 0/1 (하룻밤). 다음날, 시편을 몰드의 100% 신선한 에포시드 수지에 내장하고 60°C에서 48시간 동안 중합한다. 참고: 이 등급이 매겨진 방법은 이전 프로토콜11,12에 따른 것입니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>세로 방향 섬유의 초박형 (60-70nm) 섹션을 자르고 다음과 같이 한 구멍 구리 그리드에 수집하십시오.<ol>
<li>초미세 전극 홀더에 시편 블록을 장착하십시오.</li>
		<li>조직의 수준에 도달하기 위해 면도날로 표면의 블록을 트림하십시오.</li>
		<li>샘플 앞에 다이아몬드 나이프(울트라컷 45)를 장착하고 샘플 표면을 나이프에 평행하게 정렬합니다.</li>
		<li>샘플의 방향을 확인하기 위해 다이아몬드 나이프로 반박형(1 μm) 섹션을 제작합니다. 가벼운 현미경으로 관찰하기 위해 톨루이딘 블루로 반 얇은 부분을 얼룩지게하십시오.</li>
		<li>적절한 초박형 섹션을 얻기 위해 관심 영역을 줄이기 위해 블록을 더 트리밍하십시오.</li>
		<li>초박형 (60-70nm) 섹션을 두 번째 다이아몬드 나이프 (울트라 컷 45)로 자릅니다.</li>
		<li>퍼펙트 루프를 사용하여 원홀 구리 그리드에 1-2개의 섹션을 수집합니다. 참고 : 원 홀 구리 그리드에는 Formvar 지원 멤브레인이있는 중간에 단일 구멍이 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>절편을 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트와 대조하여 상기 격자를 우라닐 아세테이트 용액 (이중 증류수 중 0.5 %)에 20 분 동안 침지시킨 다음 납 시트레이트 용액 (이중 증류수 중 1 %)에서 15 분 동안 침지시킨다. 두 얼룩 사이의 두 번 증류수로 그리드를 씻으십시오. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 이미징
<ol><li>투과 전자 현미경(80kV의 가속 전압에서 작동), 컴퓨터 및 이미지 녹화 소프트웨어를 켭니다. 디지털 슬로우 스캔 2k x 2k CCD 카메라 및 관련 이미징 소프트웨어로 디지털 이미지를 녹화합니다.</li>
	<li>현미경 단계에서 여러 섹션이있는 그리드를 삽입하십시오.</li>
	<li>초기에 그리드를 낮은 배율(예: x100)로 스크린하여 섹션(즉, 지지 멤브레인의 구멍, 파편 등)의 품질을 결정하고 최상의 품질의 섹션을 선택합니다. 낮은 배율에서 근육 섬유의 방향을 결정하십시오.</li>
	<li>다음으로, 단면의 주변 섬유를 중심으로 빔을 사용하여 배율을 높입니다. 30k 이상의 배율로 이미지를 집중하여 이미지에 충분한 미세한 디테일을 보장하고, 가능한 경우 실시간 고속 푸리에 변환으로 안내합니다. 마지막으로, 원하는 배율로 1 초 노출 시간으로 이미지를 녹화하십시오.</li>
	<li>무작위로 선택된 섬유의 총 24개의 이미지, 즉 myofibrillar 공간의 12개의 이미지와 10k와 40k 사이의 배율로 근자 하부 공간의 12개의 이미지를 획득한다. 이미지가 무작위화되었지만 체계적인 순서로 섬유의 길이와 너비에 걸쳐 분포되어 편향되지 않은 결과를 얻을 수 있는지 확인하십시오 (그림 1A). 참고: 최적의 배율은 사용 가능한 카메라 해상도와 현미경 사진의 크기에 따라 다릅니다. 목표는 최종 분해능을 달성하는 것이며, 여기서 글리코겐 입자 직경은 1 nm 단계 내에서 측정될 수 있고, 적어도 70 μm2의 myofibrillar 영역의 전체 면적 및 적어도 25 μm의 섬유의 총 길이가 섬유당 근피브릴라 공간의 12개의 이미지 및 섬유당 아석자 공간의 12개의 이미지로 분포되고, 각각. 섬유당 24개의 이미지는 인간, 래트 및 마우스 골격근으로부터의 개별 섬유에서 0.1 내지 0.2 사이의 글리코겐의 상이한 풀의 체적 함량의 정밀도(오차 계수)를 제공할 가능성이 가장 높다(도 2E).</li>
	<li>총 6-10개의 섬유가 이미징될 때까지 2.4단계와 2.5단계를 반복합니다. 필요한 경우 추가 단면을 절단하고(이미 이미징된 섬유의 겹침을 피하기 위해 최소 150μm로 분리) 1.9-2.5단계를 반복합니다.</li>
</ol>3. 이미지 분석
<ol><li>파일 > 열기를 클릭하여 이미지를 ImageJ로 가져옵니다.</li>
	<li>분석 > 배율 설정을 클릭하여 이미지의 원래 크기와 일치하도록 전역 배율을 설정합니다.</li>
	<li>이미지 > 확대 / 축소를 클릭하여 100 % 확대>십시오.</li>
	<li>도구 메뉴의 직선 도구를 사용하여 myofibrillar 공간의 이미지당 하나의 Z-디스크 두께(섬유당 12개)를 측정합니다(그림 1D). 각 6-10 섬유의 평균 Z 디스크 두께를 계산하십시오.</li>
	<li>가장 두꺼운 평균 Z 디스크를 가진 2-3 섬유를 유형 1 섬유로, 가장 얇은 평균 Z 디스크를 가진 2-3 섬유를 유형 2 섬유로 정의하십시오. 추가 분석을 위해 중간 2-4 섬유를 무시하십시오 (그림 1E). 참고: 다음 단계는 샘플의 4-6개 섬유 각각에 대해 반복됩니다. 글리코겐 부피 분획은 다른 곳에서 설명된 바와 같이 포인트 카운팅에 의해 추정된다25,26. 격자의 크기는 추정치의 만족스러운 높은 정밀도를 얻기 위해 선택됩니다. 이것은 종종 250 히트를 달성함으로써 얻어지며, 이는 필요한 총 포인트 수와 포인트 당 면적을 결정합니다.</li>
	<li>세그먼트 선 도구를 사용하여 아사르콜렘말 영역 바로 아래에 보이는 최외곽 근피브릴의 길이를 측정합니다(그림 2A). 참고: 이 길이는 표면적 당 아유육종 글리코겐을 발현하는데 사용된다 (즉, 최외곽 근피브릴의 길이에 절편(60 nm)의 두께를 곱한 값; 단계 4.5 참조). 따라서, 이 길이로 표현되는 아사르콜렘말 영역만이 분석에 포함된다.</li>
	<li>그리드에서 > 도구 분석을 클릭하여 그리드> 삽입하고 포인트당 면적을 32,400nm2로 설정합니다. 12개의 아사르콜렘말 이미지에서 사용 가능한 길이 내의 히트 수를 계산하며, 여기서 교차는 아사르콜렘말 글리코겐에 부딪칩니다(그림 2A). 히트는 십자가의 오른쪽 위 모서리에 존재하는 글리코겐 입자로 정의됩니다.</li>
	<li>그리드에서 > 도구 분석을 클릭하여 그리드> 삽입하고 포인트당 영역을 160,000nm2로 설정합니다. 십자가가 myofibrillar 내부 공간에 닿는 12개의 myofibrillar 이미지에서 히트 수를 계산합니다(그림 2B).</li>
	<li>그리드에서 > 도구 분석을 클릭하여 격자선을 삽입하고 점당 영역> 3,600nm2로 설정합니다. 12개의 myofibrillar 이미지에서 히트의 수를 계산하고, 여기서 크로스가 myofibrillar 내 글리코겐에 부딪칩니다(그림 2C).</li>
	<li>그리드에서 > 도구 분석을 클릭하여 그리드> 삽입하고 포인트당 면적을 32,400nm2로 설정합니다. 12개의 myofibrillar 이미지에서 히트의 수를 계산하고, 여기서 크로스가 인터미오피브릴라 글리코겐에 부딪칩니다(그림 2D).</li>
	<li>직선 도구를 사용하여 12 개의 이미지 각각에 대해 각 풀의 무작위로 선택된 다섯 개의 글리코겐 입자의 직경을 측정하여 섬유당 풀당 평균 60개의 입자를 얻습니다. 참고: 평균 60개의 입자는 섬유 내의 변화를 크게 커버합니다(그림 2F).</li>
</ol>4. 계산
<ol><li>근피브릴라 공간 당 근시브릴라 공간의 겉보기 면적 분율(AA)을 12개의 이미지로부터의 모든 점들의 합으로 나눈 모든 히트의 합으로서 계산한다(단계 3.8로부터).</li>
	<li>이미지 영역 당 근오피브릴라 글리코겐의 겉보기 영역 분율, 근피브릴라 면적 당 근교골 글리코겐, 및 이미지 영역 당 근자렘 아글리코겐의 겉보기 영역 분율을 12개의 이미지로부터의 모든 점의 합으로 나눈 모든 히트의 합으로서 계산한다(단계 3.7, 3.9, 및 3.10에서).</li>
	<li>myofibrillar, intermyofibrillar 및 subsarcolemmal 글리코겐의 체적 분율 (VV)을 각각 겉보기 면적 분율 (AA)에서 표면 밀도 (SV)의 곱을 뺀 부분 두께 (t)로 계산하십시오. 여기서 표면 밀도는 평균 입자 표면을 곱한 입자의 수치 밀도입니다. Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t 어디 Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H)) t = 0.06 μm H = 입자의 평균 직경(μm) 참고: 체적 분율은 슬라이스 바깥쪽에 중심을 둔 입자로부터의 캡의 기여로 인해 겉보기 영역 분율보다 작습니다25.</li>
	<li>근오피릴라 공간 당 근오피릴라 글리코겐을 발현시키기 위해, 근오피릴라 글리코겐의 면적 분획을 근피브릴라 공간의 영역 분획으로 분할한다(단계 4.2). 인터미오피브릴라 글리코겐은 이전 단계에서 계산된 바와 같이 근피브릴라 공간 당 발현된다(단계 4.3).</li>
	<li>섬유(VS)의 표면적(최외곽 myofibril) 당 아사르콜렘 글리코겐을 발현시키기 위해, 글리코겐의 부피 분율을 이미지의 부피(면적 및 단면 두께의 생성물)와 곱하고 평균 이용가능한 길이(단계 3.6부터)의 곱과 단면 두께(t)로 나눔으로써 절대량으로 변환한다.</li>
	<li>다음과 같이 단계 4.1, 4.4, 및 4.5로부터의 값을 사용하여 총 용적 글리코겐 함량을 추정한다: Myofibrillar 글리코겐 = Intermyofibrillar 글리코겐 + (myofibrillar 글리코겐 · 자궁내 근피브릴라 공간의 면적 분율) 평균 섬유 반경을 40 μm27로 가정하면 부피 대 표면 비율은 20 : 1이므로 총 글리코겐은 다음과 같습니다. 총 글리코겐 (VV) = 미오피브릴라 글리코겐 + (아사르콜렘말 글리코겐 (VS) / 20) 참고: 20:1의 부피 대 표면 비율은 실제 섬유 크기와 아사르콜렘 영역의 크기에 따라 섬유마다 다를 수 있습니다. 이것은 현재 프로토콜과 함께 고려되지 않습니다.</li>
	<li>이로부터, 각 풀로부터의 상대적 기여는 총 글리코겐의 분획으로서 계산된다: 인터미오피브릴라 글리코겐 / 총 글리코겐 = 인터미오피브릴라 글리코겐 / 총 글리코겐 Intramyofibrillar glycogen / Total glycogen = (Intramyofibrillar glycogen · intramyofibrillar space의 면적 분율) / Total glycogen 비단절하글리코겐 / 총 글리코겐 = 아사르콜렘말의 글리코겐 / 20 / 총 글리코겐</li>
	<li>각 글리코겐 풀에 대해, 이미지 수(n), 각 이미지에서의 총 십자가 수(x), 및 각 이미지(y)에서 관련 풀에서 글리코겐을 치는 십자가의 수를 기준으로 섬유 수준에서 글리코겐 추정치의 불확실성을 표현하는 오차 계수(CE)를 계산하면 다음과 같습니다28: 세륨 = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

이 방법의 중요한 단계는 고정 후 동안 칼륨 페로시아나이드에 의해 환원 된 오스뮴을 사용하는 것입니다. 글리코겐 검출을 위한 이 변형된 고정제의 선택성은 화학에 의해 완전히 설명될 수 없지만, 글리코겐이 없는 것으로 알려진 조직 또는 세포외 공간에서11에서 그러한 입자의 검출이 없음을 입증하는 실험 발견도 포함한다.
중요한 파라미터는 추정치의 정밀도와 섬유-섬유 변동입니다. 이미징을 위한 본 프로토콜에 따라, 섬유당 글리코겐의 상이한 풀의 추정치의 0.1 내지 0.2 사이의 오차 계수가 얻어진다. 이 오류 수준은 개별 섬유 간의 변동보다 훨씬 낮습니다(그림 3). 글리코겐의 체적 함량을 추정 할 때 그러한 정밀 추정치를보고하는 것이 좋습니다. 제시된 섬유 타이핑 방법은 미오신 ATPase isoform29에 대해 검증된다. Z-디스크 두께 및...

글리코겐 입자는 포도당과 다양한 관련 단백질1의 분지형 중합체로 구성되며 높은 대사 요구시 중요한 연료를 구성합니다2. 널리 인식되지는 않지만, 글리코겐 입자는 또한 국소 연료를 구성하며, 일부 세포 하부 공정은 혈장 글루코스 및 지방산과 같은 다른 더 오래 지속되는 연료의 가용성에도 불구하고 글리코겐을 우선적으로 이용한다3,4.
글리코겐을 세포내 특이적 국부적 연료로서 저장하는 것의 중요성은 여러 리뷰5,6에서 논의되었으며, 주로 투과 전자 현미경(TEM)7,8에 의한 글리코겐의 세포하 분포에 대한 초기 문서 중 일부에 기초한다. 첫 번째 연구는 조직 화학 염색 기술에서 음성 및 양성 염색에 이르기까지 글리코겐의 대비를 높이기 위해 다른 프로토콜을 사용했습니다.9,10. 중요한 방법론 적 개발은 칼륨 페로시아나이드 환원 osmium11,12,13,14를 사용한 정제 된 사후 고정 프로토콜이었으며, 이는 글리코겐 입자의 대비를 크게 향상 시켰습니다. 이 세련된 프로토콜은 운동으로 인한 글리코겐 고갈에 대한 선구적인 연구15에는 사용되지 않았지만 그레이엄과 동료들에 의해 다시 도입되었습니다16,17.
2차원 이미지에 기초하여, 글리코겐의 세포하 분포는 가장 흔히 세 개의 풀에 위치한 글리코겐 입자로서 기술된다: 아사르콜렘말(표면막 바로 아래), 인터미오피브릴라(myofibrils 사이), 또는 근오피브릴라(myofibrils 내). 그러나, 글리코겐 입자는 또한 예를 들어, 사르코플라스마 망상7 또는 nuclei18과 관련된 것으로 기술될 수 있다. 세포내 분포에 더하여, TEM-추정된 글리코겐 함량의 이점은 또한 단일 섬유 수준에서 정량화가 수행될 수 있다는 것이다. 이를 통해 섬유 대 섬유 변동성을 조사하고 미토콘드리아와 지질 방울과 같은 섬유 유형 및 세포 구성 요소와의 상관 관계 분석을 수행 할 수 있습니다.
여기에서, 골격근 섬유에서 TEM-추정된 섬유 유형-특이적 용적 함량에 대한 프로토콜은 골격근 섬유에서 글리코겐의 세 가지 공통 서브 세포 풀(subsarcolemmal, intermyofibrillar, and intramyofibrillar)에 대해 기술된다. 상기 방법은 인간19, rats20, 및 mice21로부터의 골격근에 적용되었다; 새와 물고기뿐만 아니라22; 및 래트로부터의 심근세포23.

<table><tbody><tr><td>1,2- 프로필렌 옥사이드</td><td>Merck</td><td>75-56-9</td><td></td></tr><tr><td>임베딩 812 수지 매체 키트</td><td>Taab</td><td>T031</td><td></td></tr><tr><td>글루 타르 알데히드 용액 25 %</td> <td>Merck</td><td>1.04239.0250</td><td></td></tr><tr><td>ITEM</td><td>올림푸스</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Leica EM AC20</td><td>Leica</td><td></td><td>자동 대비 시스템</td></tr><tr><td>OSIS Veleta 디지털 카메라</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 4% 용액</td><td>Polysciences</td><td>0972A</td><td></td></tr><tr><td>Philips CM 100 Transmission EM</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989-245G</td><td></td></tr><tr><td>sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4</td><td>Ampliqon.com</td><td>AMPQ40989.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome Leica UC7</td><td>라이카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrostain 리드 시트레이트 3%, 안정화 솔루션</td><td>라이카</td><td>16707235</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트 이수화</td><td>Polysciences</td><td>6159-44-0</td><td></td></tr></tbody></table>

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

투과 전자 현미경을 사용하면 개별 근육 섬유를 포함하는 고정 샘플의 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 이것은 부피 분율, 표면적 대 부피비, 형태학 및 상이한 아세포 구조의 물리적 접촉 부위와 같은 초구조적 측면의 정량화를 가능하게 한다. 1970년대에는 세포에서 글리코겐의 강화된 염색을 위한 프로토콜이 개발되었고, 투과 전자 현미경을 이용한 글리코겐 및 글리코겐 입자 크기의 세포내 국소화에 관한 일련의 연구를 위한 길을 열었다. 대부분의 분석은 글리코겐이 근육 섬유 내에 균질하게 분포되어 있는 것처럼 해석하고 단 하나의 값(예를 들어, 평균 농도)만을 제공하는 반면, 투과 전자 현미경 검사는 글리코겐이 별개의 세포 하부 구획에 위치한 분리된 글리코겐 입자로서 저장된다는 것을 밝혀냈다. 여기서, 조직 수집으로부터 개별 골격근 섬유의 별개의 세포내 구획에서 글리코겐의 부피 분획 및 입자 직경의 정량적 결정을 위한 단계별 프로토콜이 기재되어 있다. 1) 조직 표본 수집 및 얼룩 방법, 2) 이미지 분석 및 데이터 처리 수행, 3) 추정치의 정밀도 평가, 4) 근섬유 유형 차별, 5) 방법론적 함정 및 한계에 대한 고려 사항이 포함됩니다.

이 프로토콜을 사용하면 글리코겐 입자가 검고 뚜렷하게 나타납니다 (그림 1 및 그림 2). 글리코겐의 정상 값은 도 3에 묘사되어 있다. 이 데이터는 다른 이전 연구에서 수집 된 41 명의 건강한 젊은 남성의 총 362 섬유를 기반으로합니다.19,24,29,30,31. 여기서, 근오피브릴라 글리코겐 값이 정상에 가깝게 분포되어 있는 반면, 근교내 글리코겐과 아사르콜렘말의 글리코겐 모두 비뚤어진 분포를 보이며, 섬유는 때때로 과도한 양의 글리코겐을 가지고 있음을 알 수 있다. 정상 크...

수정 된 고정 후 절차는 조직에서 글리코겐 입자의 대비를 증가시킵니다. 이 논문은 조직을 처리하고, 이미징을 수행하고, 입체 학적 방법을 사용하여 골격근에서 섬유 유형 별 세포 내 글리코겐 분포에 대한 편향되지 않은 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제공합니다.

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

단일 세포 및 아세포 조직에서 글리코겐 함량의 측정은 대부분의 세포 유형에서 단일 세포가 변화하는 생리적 조건 및 질병에 다르게 적응하기 때문에 중요합니다. 따라서이 기술의 가장 큰 장점은 투과 전자 현미경에서 매우 높은 해상도입니다. 이것은 국소화된 아세포 구조를 가질 가능성을 개선시키고, 또한 여기에서 이 기술에서의 이러한 함량에서, 글리코겐 염색이 항체가 없는 것이 중요하다.따라서 우리는 걱정할 특이성이 없습니다. 글리코겐에 대한 더 나은 대조를 얻으려면 페로시아나이드 칼륨 대신 칼륨 페로시아나이드 1.5 %를 사용하십시오. 2 밀리리터 마이크로 센트레이션 튜브에서 0.1 몰 소듐 카코딜레이트 완충액에 2.5 % 글루타르 알데히드를 첨가하여 1.6 밀리리터의 1 차 고정 용액을 준비하십시오.최대 14 일 동안 섭씨 5도에 보관하십시오. 근육 생검 또는 모든 방향에서 한 밀리미터의 최대 직경을 가지며 단면보다 세로 방향으로 더 긴 전체 근육에서 작은 표본을 분리하십시오. 시편을 차가운 일차 고정 용액이 들어있는 튜브에 넣으십시오.24 시간 동안 섭씨 다섯 도에 보관하십시오. 그런 다음 시편을 0.1몰 소듐 카코딜레이트 완충액으로 네 번 세척한다. 전사 피펫을 사용하여 튜브에서 사용 된 버퍼를 제거하고 시편을 손대지 않은 상태로 유지하고 신선한 버퍼를 추가하십시오.시편을 0.1몰 소듐 카코딜레이트 완충액에 1%오스뮴 테트록사이드와 1.5%칼륨 페로시아나이드로 섭씨 4도에서 120분 동안 고정시킨 후 고정시킨다. 시편을 실온에서 이중 증류수로 두 번 헹구십시오. 실온에서 등급화된 일련의 에탄올에 침수하여 탈수시킨다.언급된 부피비를 사용하여 실온에서 프로필렌 옥사이드 및 에포시드 수지 등급화된 혼합물로 시편을 침윤시킨다. 다음날 시편을 몰드에 100 % 신선한 에포시 성 수지에 넣고 섭씨 60도에서 48 시간 동안 중합하십시오. 초미세 전극 홀더에 시편 블록을 장착하십시오.면도날로 표면의 블록을 트리밍하여 조직 수준에 도달하십시오. 샘플 앞에 다이아몬드 나이프를 장착하고 샘플 표면을 나이프에 평행하게 정렬합니다. 샘플의 방향을 확인하기 위해 다이아몬드 나이프로 한 마이크로 미터 두께의 반 얇은 섹션을 제작하십시오.가벼운 현미경으로 관찰하기 위해 톨루이딘 블루로 반 얇은 부분을 얼룩지게하십시오. 그런 다음 블록을 더 트리밍하여 관심 영역을 줄여 적절한 초박형 섹션을 얻으십시오. 두 번째 다이아몬드 나이프로 60 ~ 70 나노 미터 두께의 초박형 섹션을 자릅니다.완벽한 루프를 사용하여 하나의 전체 구리 그리드에서 하나 ~ 두 개의 섹션을 수집합니다. 섹션을 대조하기 위해 그리드를 우라닐 아세테이트 용액에 20 분 동안 담그고 그리드를 이중 증류수로 세척 한 다음 그리드를 납 시트레이트에 15 분 동안 담근 다음 그리드를 이중 증류수로 다시 세척하십시오. 전송 전자 현미경 컴퓨터 및 이미지 녹화 소프트웨어를 켜고 디지털 슬로우 스캔 CCD 카메라 및 관련 이미징 소프트웨어로 디지털 이미지를 기록하십시오.현미경 단계에서 여러 섹션이있는 그리드를 삽입 한 후 처음에는 낮은 배율로 그리드를 스크린하여 최상의 품질의 섹션을 선택하고 근육 섬유의 방향을 결정합니다. 다음으로, 30, 000 이상의 배율에서 이미지를 단면의 주변 섬유에 중심을 둔 빔과 함께 원하는 배율로 한 초 노출 시간으로 이미지를 기록합니다. 무작위 봇 체계적으로 이미지가 섬유의 길이와 너비에 걸쳐 분포되어 편향되지 않은 결과를 얻고 여섯 ~ 10개의 섬유가 이미징될 때까지 이미징을 반복하십시오.파일을 클릭 한 다음 열어 이미지 J로 이미지를 가져옵니다. 분석을 클릭하여 이미지의 원래 크기와 일치하도록 전역 배율을 설정한 다음 배율을 설정합니다. 100 % 확대하려면 이미지를 클릭하고 확대 / 축소로 이동하여 클릭하십시오.도구 메뉴에서 직선 도구를 사용하여 myofibrillar 공간의 이미지 당 하나의 Z 디스크의 두께를 측정하고 여섯 ~ 10 개의 섬유 각각의 평균 Z 디스크 두께를 계산하십시오. 세그먼트 선 도구를 사용하여 아사르콜렘말 영역 바로 아래에 보이는 최외곽 근피브릴의 길이를 측정합니다. 격자를 삽입하려면 분석을 클릭하고 도구를 선택한 다음 격자를 선택합니다.이제 점 당 면적을 32, 400 평방 나노 미터로 설정하십시오. 십자가가 아사르콜렘말 글리코겐에 부딪히는 12개의 아사르콜렘말 이미지에서 사용 가능한 길이 내의 히트 수를 계산합니다. 분석을 클릭하여 그리드를 삽입 한 다음 도구를 선택한 다음 그리드를 선택하고 점당 면적을 160, 000 평방 나노 미터로 설정합니다.십자가가 myofibrillar 내부 공간에 부딪히는 12 번째 myofibrillar 이미지에서 히트 수를 계산하십시오. 그런 다음 다시 그리드를 삽입하려면 분석을 클릭하고 도구를 선택한 다음 그리드를 선택하십시오. 이제 점 당 면적을 3, 600 평방 나노 미터로 설정하십시오.십자가가 myofibrillar 내 글리코겐에 부딪히는 12번째 myofibrillar 이미지에서 히트의 수를 계산합니다. 분석을 클릭하여 그리드를 삽입 한 다음 도구를 선택한 다음 그리드를 선택하고 점당 면적을 32, 400 평방 나노 미터로 설정합니다. 십자가가 intermyofibrillar 글리코겐에 부딪히는 12번째 myofibrillar 이미지에서 히트의 수를 계산합니다.32, 400 평방 나노 미터 그리드를 사용하여 글리코겐 입자를 무작위로 선택하고 왼쪽 상단 사각형으로 시작하여 필요한 경우 왼쪽으로 이동하십시오. 직선 도구를 사용하여 12개의 이미지 각각에 대해 각 풀의 무작위로 선택된 다섯 개의 글리코겐 입자의 직경을 측정하여 섬유당 풀당 평균 60개의 입자를 얻습니다. 이 그림은 세 개의 글리코겐 풀의 정상 값을 보여줍니다.인터미오피브릴라 글리코겐 값이 정상에 가깝게 분포하는 것을 관찰할 수 있는 반면, 근박근 내 글리코겐과 아사르콜렘말의 글리코겐 둘 다 섬유가 때때로 과도한 양의 글리코겐을 갖는 비뚤어진 분포를 보인다. 모든 단계 중에서 칼륨 페로 시아 나이드를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 글리코겐의 분석은 미토콘드리온 및 지질 방울의 분석과 결합 될 수 있으며, 이는 다른 주요 대사 성분이 글리코겐 및 근육 건강과 어떻게 관련되는지에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.

quantification-subcellular-glycogen-distribution-skeletal-muscle

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 세포 내 글리코겐 분포를 시각화하고 정량화하기 위해 인간 골격근 조직의 샘플 준비와 투과 전자 현미경을 위한 염색을 보여줍니다.

인간 골격근의 글리코겐 분포를 정량화하기 위한 투과 전자 현미경

우리는 여기에서 체외에서 글리코겐의 적정에 대한 정확한 재현하고 편리한 생화학 적 방법을 설명합니다. 이 기술은 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하여 형광 적정 포도당과 포도당 글리코겐의 연속적인 가수 분해에 기초한다.

글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

주기적 산 쉬프 염색은 조직의 다당류 함량을 시각화하는 기술입니다. 이 기사는 인간 정맥혈에서 정제된 말초 혈액 단핵 세포에 사용하도록 조정된 주기적인 산 Schiff 염색 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 샘플은 림프구와 면역 체계의 다른 백혈구를 위해 풍부합니다.

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

글리코겐 대사의 주요 효소의 활성을 측정하는 기술은 가시 범위에서 작동하는 간단한 분광 광도계를 사용하여 제시됩니다.

진핵 글리코겐 대사 연구를위한 분광 광도법

최적의 슈크로스 농도는 슈크로스 밀도 구배 원심분리를 사용하여 간 글리코겐의 추출을 위해 결정하였다. 글리코겐 분해 효소를 억제하기 위해 10분 끓는 단계를 추가하면 유익한 것으로 입증되었습니다.

글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출

본 프로토콜에서, 형광단-보조 탄수화물 전기영동(FACE) 기술은 글리코겐의 사슬 길이 분포(CLD) 및 평균 사슬 길이(ACL)를 결정하는데 사용된다.

형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE) 방법을 이용한 글리코겐의 글루칸 사슬 길이 분포 결정

증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

동물 조직 분석은 핵 섬광 검출을 활용하여 방사성 표지 포도당이 글리코겐에 혼입되는 것을 측정하여 글리코겐 합성효소의 효소 활성을 결정합니다.

동물 조직에서 글리코겐 합성효소 효소 활성의 방사화학적 평가

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

배우세요 투과 전자 현미경을 이용한 세포하 글리코겐 정량화 방법을 골격근섬유에 적용하여 무편향적 분포 분석을 수행하는 기법입니다. 이 프로토콜은 대사 연구에 필수적인 고해상도 시각화를 제공합니다.

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

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