Name: 진핵 글리코겐 대사 연구를위한 분광 광도법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 분광 광도법을 이용한 글리코겐 합성효소 활성 측정 방법을. 방사성 동위원소 없이 저렴하고 안전하게 진핵 세포의 글리코겐 대사를 연구할 수 있습니다.

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저자는 Karoline Dittmer와 Andrew Brittingham의 통찰력과 많은 유용한 토론에 감사드립니다. 이 작업은 아이오와 정골 요법 교육 및 연구 기금 (IOER 03-17-05 및 03-20-04)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

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<li>Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+glycogen+branching+and+debranching+enzymes+from+the+parasitic+protist+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis.</a> Biochimie. 186, 59-72 (2021).</li>
</ol>

이 작업과 관련하여 알려진 이해 상충은 없으며 결과에 영향을 미칠 수 있는 이 작업에 대한 재정적 지원이 없었습니다.

일반적으로 제시된 모든 방법의 주요 장점은 저렴한 비용, 용이성, 속도 및 특수 장비에 대한 의존도가 없다는 것입니다. 모두 공유하는 주요 단점은 사용 가능한 다른 방법에 비해 민감도입니다. NADH / NADPH의 생산 또는 소비와 관련된 절차의 민감도는 쉽게 추정 할 수 있습니다. NADH / NADPH의 흡광 계수가 6.22 M이라는 것을 감안할 때-1 cm-1, 간단한 산술은 ~ 10-20 μM 농도의 변화를 쉽게 감지 할 수 있음을 나타냅니다. 현재 기사에 설명 된 분석 부피를 사용하면 ~ 10-20 nmol 범위의 양을 측정 할 수있는 능력에 해당합니다. 틀림없이 이것은 상당히 민감합니다. 그러나, 방사성 표지 기판의 특정 활성을 조절하여 감도가 분광 광도계 분석의 한계를 넘어 매우 쉽게 증가 될 수 있습니다. 분지 효소 분석과 글리코겐 분지의 정성 평가는 모두 요오드와 α1,4-연결된 포도당 중합체 사이의 복합체 형성에 의존하지만 각 분석의 출력은 다르며 감도도 마찬가지로 다릅...

글리코겐은 자연에 널리 분포되어 있으며 화합물은 박테리아, 많은 원생 생물, 곰팡이 및 동물에서 발견됩니다. 미생물에서 글리코겐은 영양소가 제한적일 때 세포 생존에 중요하며 포유류와 같은 고등 유기체에서는 글리코겐의 합성 및 분해가 혈당 수치를 완충하는 역할을합니다 1,2,3. 따라서 글리코겐 대사에 대한 연구는 미생물학 및 포유류 생리학과 같은 다양한 분야에서 중요합니다. 글리코겐 대사를 이해하려면 글리코겐 합성(글리코겐 합성효소 및 분지 효소)과 글리코겐 분해(글리코겐 인산화 효소 및 탈분지 효소)의 핵심 효소를 연구해야 합니다. 글리코겐 합성 효소, 인산화 효소, 분지 효소 및 분지 효소 활성의 황금 표준 분석은 방사성 동위 원소를 사용합니다. 예를 들어, 글리코겐 합성 효소는 일반적으로 UDP- [14 C] 포도당 (동물 및 곰팡이 효소의 경우) 또는 ADP- [14C] 포도당 (박테리아 효소의 경우)의 포도당을 글리코겐 4,5로 통합 한 후 중단 된 방사 화학 분석에서 측정됩니다. 유사하게, 글리코겐 인산화 효소는 [14C] 포도당 -1- 인산에서 글리코겐6으로 포도당을 통합 한 후 글리코겐 합성 방향으로 측정됩니다. 분지 효소는 글리코겐 인산화 효소7에 의해 포도당 -1- 인산에서 α1,4- 연결된 사슬로 [14C] 포도당의 혼입을 자극하는이 효소의 능력을 측정하여 분석되며, 탈 분지 효소 활성은 [14C] 포도당을 글리코겐8에 통합하는 효소의 능력에 따라 결정됩니다. . 방사성 기질은 매우 민감하여 효소 활성이 낮은 조세포 추출물에 사용할 수 있지만 고가이며 방사성 동위 원소 사용에 수반되는 규제 요구 사항이 적용됩니다. 이러한 장벽으로 인해 특정 분석법을 사용하는 것이 많은 작업자의 손이 닿지 않는 곳에 있습니다. 그러나, 수년에 걸쳐, 이들 효소의 측정에 대한 인상적인 다양한 분광 광도계 접근법이 기술되었다. 일반적으로 이러한 접근법은 궁극적으로 NADH / NADPH의 생산 또는 소비 또는 글리코겐과 요오드 사이의 착색 된 복합체 생성을 측정하는 데 의존합니다. 따라서 간단하며 텅스텐 또는 크세논 플래시 램프 만 장착 된 간단한 분광 광도계를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
글리코겐 합성 효소의 분광 광도계 분석은 포도당이 성장하는 글리코겐 사슬 9,10에 첨가됨에 따라 당 뉴클레오티드 공여체로부터 방출되는 뉴 클레오 시드 디 포스페이트를 측정하는 것에 의존합니다. 아래 프로토콜의 섹션 1에 설명된 글리코겐 합성효소 활성을 측정하는 절차는 Wayllace et al.11에 의해 요약된 것을 수정한 것이며 결합 계획은 다음과 같습니다.
(포도당) n + UPD- 포도당 → (포도당) n + 1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + 포스포에놀피루브산→ 피루브산 + ATP
피루 베이트 + NADH + H + → 젖산 + NAD +
글리코겐 합성 효소는 UDP- 포도당의 포도당을 글리코겐에 추가합니다. 이 과정에서 생성 된 UDP는 ADP를 생성하는 반응에서 뉴 클레오 시드 디 포스페이트 키나아제 (NDP 키나아제)에 의해 UTP로 전환됩니다. ADP는 차례로 포스포에놀피루베이트를 인산염 공여체로 사용하여 ADP를 인산화하는 피루브산 키나아제의 기질 역할을 합니다. 생성 된 피루 베이트는 NADH를 소비하는 반응에서 효소 락 테이트 탈수소 효소에 의해 락 테이트로 전환됩니다. 따라서 분석은 NADH가 소비됨에 따라 340nm에서 흡광도 감소를 모니터링하면서 연속적인 방식으로 수행될 수 있습니다. 포도당 공여체로서 ADP- 포도당을 필요로하는 효소와 함께 사용하기에 쉽게 적응할 수 있습니다. 여기서, 글리코겐 합성 효소의 작용에 의해 방출 된 ADP가 피루 베이트 키나아제에 의해 직접 작용하기 때문에 결합 단계가 더 간단하다.
글리코겐 인산화 효소 활성의 측정에 사용할 수있는 다양한 분광 광도계 분석이 있습니다. 고전 버전에서 효소는 아래와 같이 글리코겐 합성 방향으로 뒤로 구동됩니다.
(포도당) n + 포도당 -1- 인산염 → (포도당) n + 1 + 피
시간 간격에서, 반응 혼합물의 분취량이 제거되고, 유리된 인산염의 양이 정량화된다(12,13). 우리의 손에서이 분석은 포스 포릴 라제 작용에 필요한 고농도의 글루코스 -1- 포스페이트와 결합 된 글루코스 -1- 포스페이트의 많은 상업적 제제에서 쉽게 측정 할 수있는 유리 포스페이트의 존재로 인해 제한적으로 사용되었습니다. 오히려, 우리는 글리코겐이 포스포릴라제13에 의해 분해됨에 따라 방출되는 포도당-1-인산을 측정하는 대체 분석을 일상적으로 사용했습니다. 아래에 예시된 결합 반응 반응이 사용된다.
(포도당) n + Pi → (포도당) n-1 + 포도당 -1- 인산염
포도당 -1- 인산 → 포도당 -6- 인산
포도당 -6- 인산 + NADP + → 6- 포스 포 글루코노 락톤 + NADPH + H +
포도당 -1- 인산은 포스 포 글루코 뮤 타제에 의해 포도당 -6- 인산으로 전환되고, 포도당 -6- 인산은 6- 포스 포 글루코노 락톤으로 산화되어 NADP +가 NADPH로 환원됩니다. 아래 프로토콜의 섹션 2에 자세히 설명된 절차는 Mendicino et al.14 및 Schreiber & Bowling 15에 설명된 방법에서 파생됩니다. 분석은 시간이 지남에 따라 340nm에서 흡광도가 증가하여 연속적인 방식으로 쉽게 수행할 수 있어 반응 속도를 결정할 수 있습니다.
탈분지형 효소 활성의 분광광도 측정은 인산화 효소 한계 덱스트린16에 대한 효소의 작용에 의해 방출되는 포도당의 측정에 의존한다. 이 화합물은 글리코겐을 글리코겐 인산화 효소로 철저히 처리하여 만들어집니다. 글리코겐 인산화 효소 작용은 α4 분기점에서 떨어진 1,6 개의 포도당 잔기를 멈추기 때문에 한계 덱스트린에는 글리코겐이 포함되어 있으며 그 외부 사슬은 ~ 4 개의 포도당 잔기로 단축되었습니다. 포스포릴라제 리미트 덱스트린의 제조는 Taylor et al.17 및 Makino & Omichi 18에 의해 개발된 것으로부터 유도된 절차를 사용하여 본원에 기재되어 있다.
디브랜칭은 2단계 프로세스입니다. 이관능성 탈분지 효소의 4-α-글루카노트랜스퍼라제 활성은 먼저 분기점에서 근처의 α1,4-연결된 포도당 사슬의 비환원 말단으로 3개의 포도당 잔기를 전달합니다. 분기점에 남아있는 단일, α1,6-연결된 글루코스 잔기는 이어서 α1,6-글루코시다제 활성(19)에 의해 가수분해된다. 분석은 전형적으로 중지된 방식으로 수행되며, 주어진 시간(또는 일련의 시간) 후에 방출된 포도당은 아래와 같이 결합된 효소 분석에서 측정된다:
(포도당) n → (포도당) n-1 + 포도당 
포도당 + ATP → 포도당 -6- 인산 + ADP
포도당 -6- 인산 + NADP + → 6- 포스 포 글루코노 락톤 + NADPH + H +
생성 된 NADPH의 측정은 포도당 생산의 척도를 제공합니다. 아래 프로토콜의 섹션 3에 설명된 절차는 Nelson et al.16에 의해 설명된 절차를 기반으로 합니다. NADH / NADPH의 소비 또는 생성에 의존하는 다른 방법과 마찬가지로 분석은 매우 민감합니다. 그러나, 아밀라아제 또는 다른 글루코시다아제의 존재는 또한 포스포릴라제 한계 덱스트린으로부터 유리 글루코스를 유리시킬 수 있으며, 이는 상당한 간섭을 일으킬 것이다(토론 참조).
분지 효소 활성의 비색 측정은 포도당의 α1,4- 연결된 사슬이 요오드에 결합하여 착색 된 복합체20을 형성하는 나선형 구조를 채택한다는 사실에 의존한다. 형성된 복합체의 색상은 α1,4- 연결된 사슬의 길이에 따라 다릅니다. 따라서, α1,4- 연결된 포도당의 길고 분지되지 않은 사슬로 구성된 아밀로스는 요오드와 진한 파란색 복합체를 형성합니다. 대조적으로, 외부 사슬이 일반적으로 6 내지 8 개의 포도당 잔기 길이의 순서 인 글리코겐은 오렌지-레드 복합체를 형성한다. 아밀로오스 용액을 분지 효소와 함께 배양하면 아밀로오스에 가지를 도입하면 α1,4- 연결된 포도당 사슬이 더 짧아집니다. 따라서 아밀로스 / 요오드 복합체의 흡수 최대치는 더 짧은 파장으로 이동합니다. 여기에서 논의 된 절차는 Boyer & Preiss21 에 의해 자세히 설명 된 것에서 파생되며 분지 효소 활성은 시간 경과에 따라 660nm에서 아밀로스 / 요오드 복합체의 흡수 감소로 정량화됩니다.
위의 논의에서 쉽게 알 수 있듯이 요오드와 α1,4- 포도당 사슬 사이에 형성된 복합체의 색상이 사슬 길이에 따라 달라진다는 사실은 글리코겐 / 요오드 복합체의 흡광도 스펙트럼이 글리코겐 분지 정도에 따라 달라야한다는 것을 의미합니다. 이것은 실제로 사실이며, 더 긴 외부 사슬을 가진 덜 분지형된 글리코겐/글리코겐은 더 분지되거나 더 짧은 외부 사슬을 가진 글리코겐보다 더 긴 파장에서 빛을 흡수합니다. 따라서 요오드 염색 반응은 글리코겐 분지 정도에 대한 신속하고 정성적 데이터를 얻는 데 사용될 수 있습니다(22). 오렌지 브라운은 요오드와 글리코겐 복합체가 특별히 강하지 않을 때 형성됩니다. 그러나, 발색은 포화 염화칼슘 용액(22)의 포함에 의해 향상될 수 있다. 이것은 방법의 감도를 약 10 배 향상시키고 글리코겐의 마이크로 그램 양을 즉시 분석 할 수있게합니다. 아래 프로토콜의 섹션 4에 설명된 분기 결정을 위한 분석은 Krisman22에 의해 개발된 절차에서 채택됩니다. 글리코겐 샘플을 요오드 용액 및 염화칼슘과 큐벳에 결합하고 330nm에서 800nm까지의 흡수 스펙트럼을 수집하여 간단히 수행됩니다. 흡광도 최대값은 분기 정도가 감소함에 따라 더 긴 파장으로 이동합니다.
종합적으로, 여기에 설명 된 방법은 글리코겐 대사의 주요 효소의 활성을 평가하고 글리코겐 분기 정도에 대한 질적 데이터를 얻기위한 간단하고 신뢰할 수있는 수단을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>밀랍 옥수수의 아밀로펙틴(아밀로스 무함유)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>아밀로스</td><td>바이오신스 카르보신스</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP, 다이소듐 솔</td>트 <td>밀리포어시그마</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스-1,6-비스포스페이트, 칼륨 솔</td><td>밀리포어시그마</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스-6-포스페이트, 나트륨 염</td><td>밀리포어시그마</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 등급 I, 효모</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐, 굴</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>Hexokinase</td><td>MilliporeSigma</td><td>11426362001</td><td></td></tr><tr><td>메타크릴레이트 큐벳, 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>메타크릴레이트는 다음과 같은 절차가 필요하기 때문에 필요합니다. 340nm 이하에서 수행</td></tr><tr><td>&beta;-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산나트륨 염</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 감소된 디소듐 염</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레오시드 5'-디포스페이트 키나아제</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>포스포에노피루베이트, 모노칼륨염</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>토끼 근육의 포스포글루코무타제</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>토끼 근육의 포스포릴라아제 A</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>토끼 근육의 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-포도당, 다이소듐 염</td><td>MilliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

진핵 글리코겐 대사 연구를위한 분광 광도법

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

글리코겐은 박테리아에서 동물에 이르기까지 다양한 유기체에 의해 포도당의 저장 형태로 합성됩니다. 분자는 α1,6- 결합의 추가를 통해 도입 된 가지를 갖는 α1,4- 연결된 포도당 잔기의 선형 사슬로 구성됩니다. 글리코겐의 합성 및 분해가 어떻게 조절되고 글리코겐이 특징적인 분지 구조를 얻는 방법을 이해하려면 글리코겐 저장 효소에 대한 연구가 필요합니다. 그러나 이러한 효소 활성을 연구하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법은 일반적으로 모든 연구자가 사용할 수 없는 시약 또는 기술을 사용합니다. 여기에서는 기술적으로 간단하고 비용 효율적이면서도 글리코겐 저장 제어에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 일련의 절차에 대해 논의합니다. 이 기술은 330에서 800 nm 범위에서 작동하는 분광 광도계에 대한 액세스가 필요하며 사용자가 일회용 플라스틱 큐벳을 사용한다고 가정하여 설명됩니다. 그러나 절차는 쉽게 확장 가능하며 마이크로 플레이트 리더에서 사용하도록 수정할 수 있으므로 고도의 병렬 분석이 가능합니다.

글리코겐 합성 효소 활성의 결정 그림 1 은 정제된 효소를 사용한 글리코겐 합성효소 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 패널 A에서, 약간의 지연에 이어서, 약 12분의 기간 동안 시간에 걸쳐 340nm에서의 흡수의 선형 감소가 있었다. 그림 1A 의 흡수 변화율은 ~0.12 흡광도 단위/분이었습니다. ~0.010에서 ~0.20 흡광도 단위/분 사이의 흡광도 변화율이 최적이며 첨가되는 글리코겐 합성효소의 양은 이 범위 내의 수율로 조정되어야 합니다. 패널 B에서, 분석에 너무 많은 글리코겐 신타제를 첨가한 결과가 도시되어 있다. 여기서, 반응은 처음 2분 이내에 완료되었다. 이러한 경우 글리코겐 합성 효소가 포함되지 않은 대조 반응은 시간이 지남에 따라 흡광도의 측정 가능한 감소를 나타내지 않았습니다. 논의에서 자세히 설명했듯이 이 분석에서 조직 균질액의 사용은 추가 제어 반응이 필요하지...

글리코겐 대사의 주요 효소의 활성을 측정하는 기술은 가시 범위에서 작동하는 간단한 분광 광도계를 사용하여 제시됩니다.

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

이 프로토콜은 방사성 동위 원소의 사용을 피하고 많은 근로자가 글리코겐 대사 효소를 연구하는 것을 방해 할 수있는 장벽을 제거하기 때문에 중요합니다. 설명 된 절차는 저렴하며 간단한 분광 광도계에만 액세스하면됩니다. 글리코겐 합성 효소 활성의 측정으로 시작하려면 이전에 준비된 UDP 포도당, ATP, 포스 포에 놀 피루 베이트 및 NDP 키나아제의 저장 용액을 얼음에서 해동하십시오.수조를 섭씨 30도까지 예열하십시오. 스톡 용액이 준비되면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시약을 15밀리리터 튜브에 추가하여 글리코겐 합성효소 분석 수에 따라 충분한 분석 혼합물을 준비합니다. 반응 혼합물로부터의 NADH를 물로 대체하여 블랭크 반응을 준비하고, 반응물을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮긴다.블랭크 반응을 사용하여 340 나노 미터의 파장에서 분광 광도계에 0을 설정하십시오. 반응 혼합물의 770 마이크로리터 분취량을 1.5 밀리리터 튜브에 취하고, NDP 키나아제 및 피루베이트 키나아제 혼합물을 각각 2 마이크로리터 튜브에 순차적으로 첨가한다. 혼합 후, 반응 혼합물을 예열하기 위해 수조에서 섭씨 30도에서 3 분 동안 튜브를 부드럽게 배양한다.이어서, 글리코겐 합성효소를 함유하는 샘플 30 마이크로리터를 pH 7.8에서 20 밀리몰 트리스 완충액에 첨가하고, 반응 혼합물을 폐기 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기기 전에 부드럽게 혼합한다. 큐벳을 분광 광도계에 넣고 340 나노 미터에서 10-20 분 동안 시간 간격으로 흡광도를 기록합니다. 그런 다음 시간에 대해 얻은 흡광도를 플로팅합니다.방출된 포도당을 측정하려면 가열된 글리코겐 샘플에서 40마이크로리터의 상청액을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다. 측정된 부피의 트리에탄올아민, 염산마그네슘 설페이트 완충액, NADP ATP 혼합물 및 물을 원고에 기재된 바와 같이 첨가한다. 기포를 만들지 않고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 혼합합니다.0.5 마이크로 리터의 포도당 -6- 인산 탈수소 효소를 각 큐벳에 첨가하십시오. 피펫팅으로 혼합한 후, 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양한 다음, 340 나노미터에서 흡광도를 기록한다. 다음으로, 앞서 설명한 바와 같이 각 큐벳에 0.5 마이크로리터의 헥소키나아제를 혼합하고, 흡수제 세트를 340 나노미터로 기록하기 전에 15분 동안 배양한다.이어서 실온에서 5분 동안 인큐베이션을 계속하고, 흡광도를 기록하였다. 흡수가

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Biochemistry

생화학

진핵생물 글리코겐 대사 연구를 위한 분광광도법

이 비디오는 글리코겐 합성효소 활성을 추정하기 위한 분광광도계 분석을 설명합니다. 이 방법은 시간이 지남에 따라 NADH의 흡수율 감소에 의존하며 글리코겐 합성효소 활성을 나타냅니다.

글리코겐 합성효소 활성을 결정하기 위한 분광광도계 분석

이 비디오에서는 특성화되지 않은 구조를 가진 글리코겐 샘플의 분지 정도를 결정하기 위한 정성적 분광 광도계 분석에 대해 설명합니다. 특성화되지 않은 샘플의 흡광도 최대값을 알려진 분지형 구조를 가진 다당류의 흡광도 최대값과 비교하면 특성화되지 않은 샘플에 분지화가 존재함을 나타냅니다.

글리코겐 분지화의 정도를 측정하기 위한 글리코겐 분지화 분석

우리는 여기에서 체외에서 글리코겐의 적정에 대한 정확한 재현하고 편리한 생화학 적 방법을 설명합니다. 이 기술은 ABCAM 글리코겐 분석 키트를 사용하여 형광 적정 포도당과 포도당 글리코겐의 연속적인 가수 분해에 기초한다.

글리코겐의 생화학 적정<em&gt; 체외</em

주기적 산 쉬프 염색은 조직의 다당류 함량을 시각화하는 기술입니다. 이 기사는 인간 정맥혈에서 정제된 말초 혈액 단핵 세포에 사용하도록 조정된 주기적인 산 Schiff 염색 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 샘플은 림프구와 면역 체계의 다른 백혈구를 위해 풍부합니다.

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

최적의 슈크로스 농도는 슈크로스 밀도 구배 원심분리를 사용하여 간 글리코겐의 추출을 위해 결정하였다. 글리코겐 분해 효소를 억제하기 위해 10분 끓는 단계를 추가하면 유익한 것으로 입증되었습니다.

글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출

수정 된 고정 후 절차는 조직에서 글리코겐 입자의 대비를 증가시킵니다. 이 논문은 조직을 처리하고, 이미징을 수행하고, 입체 학적 방법을 사용하여 골격근에서 섬유 유형 별 세포 내 글리코겐 분포에 대한 편향되지 않은 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제공합니다.

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

동물 조직 분석은 핵 섬광 검출을 활용하여 방사성 표지 포도당이 글리코겐에 혼입되는 것을 측정하여 글리코겐 합성효소의 효소 활성을 결정합니다.

동물 조직에서 글리코겐 합성효소 효소 활성의 방사화학적 평가

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

우리는 수정 된 소규모 추출 및 젖 산 염 그리고 pyruvate는 선 충 류에서의 색도계 분석 실험 설명 C. 선 충. 상업적인 분석 키트를 이용 하는 때 그들의 감도 정확도의 기술 개발이 중요 합니다. 추출 강 수 단백질은 세포내 대사 산물의 양적 결정에 대 한 가장 중요 한 단계 이다.

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

배우세요 분광 광도법을 이용한 글리코겐 합성효소 활성 측정 방법을. 방사성 동위원소 없이 저렴하고 안전하게 진핵 세포의 글리코겐 대사를 연구할 수 있습니다.

진핵 글리코겐 대사 연구를위한 분광 광도법

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