진핵생물 글리코겐 대사 연구를 위한 분광광도법

이 프로토콜은 방사성 동위원소의 사용을 피하고 많은 연구자들이 글리코겐 대사 효소를 연구하는 것을 방해할 수 있는 장벽을 제거하기 때문에 중요합니다. 설명된 절차는 저렴하여 간단한 분광 광도계에만 액세스하면 됩니다. 글리코겐 합성효소 활성을 측정하기 위해 이전에 준비된 UDP 포도당, ATP, 포스포에놀피루베이트 및 NDP 키나아제의 원액을 얼음에서 해동합니다.

수조를 섭씨 30도로 예열하십시오. 원액이 준비되면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 15ml 튜브에 시약을 첨가하여 글리코겐 합성효소 분석 수에 따라 충분한 분석 혼합물을 준비합니다. 반응 혼합물의 NADH를 물로 대체하여 블랭크 반응을 준비하고 반응을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다.

블랭크 반응을 사용하여 340나노미터의 파장에서 분광 광도계를 0으로 설정합니다. 1.5 밀리리터 튜브에 반응 혼합물의 770 마이크로리터 분취액 1개를 취하고, NDP 키나아제와 피루베이트 키나아제 젖산 탈수소효소 혼합물 각각 2 마이크로리터를 튜브에 순차적으로 첨가합니다. 혼합 후 섭씨 30도의 수조에서 튜브를 3분 동안 부드럽게 배양하여 반응 혼합물을 예열합니다.

그런 다음 pH 7.8에서 20 밀리몰 트리스 완충액에 글리코겐 합성효소가 함유된 샘플 30마이크로리터를 첨가하고 반응 혼합물을 폐기 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기기 전에 부드럽게 혼합합니다. 큐벳을 분광 광도계에 놓고 10-20분 동안 일정 시간 간격으로 340나노미터의 흡광도를 기록합니다. 그런 다음 시간에 대해 얻은 흡광도를 플로팅합니다.

방출된 포도당을 측정하려면 가열된 글리코겐 샘플에서 40마이크로리터의 상등액을 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮깁니다. 그리고 원고에 설명된 대로 측정된 부피의 트리에탄올아민, 염산염 마그네슘 황산염 완충액, NADP ATP 혼합물 및 물을 추가합니다. 기포가 생성되지 않도록 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 혼합합니다.

각 큐벳에 0.5마이크로리터의 포도당-6-인산 탈수소효소를 추가합니다. 피펫팅으로 혼합한 후 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양한 다음 340나노미터에서 흡광도를 기록합니다. 다음으로, 앞서 설명한 대로 0.5마이크로리터의 헥소키나제를 각 큐벳에 혼합하고 15분 동안 배양한 후 흡수 세트 340나노미터를 기록합니다.

그런 다음 실온에서 5분 동안 배양을 계속한 다음 흡광도를 기록합니다. 흡수가 15분에 기록된 것보다 증가한 경우 340나노미터에서 최종 흡수를 기록하기 전에 5분 동안 배양을 계속합니다. 글리코겐 분지화를 확인하려면 1.5ml 튜브에 650마이크로리터의 요오드 염화칼슘 색소 시약과 100마이크로리터의 물을 결합하고 일회용 메타크릴레이트 큐벳으로 옮기기 전에 용액을 철저히 혼합합니다.

큐벳을 분광 광도계에 놓고 330에서 800나노미터의 배경 스펙트럼을 수집하기 위한 파장 스캐닝 모드에서 실행을 수행합니다. 별도의 1.5 밀리리터 튜브에 650 마이크로 리터의 작동 요오드 염화칼슘 색소 시약과 50 마이크로 그램의 굴 글리코겐을 결합하고 물로 750 마이크로 리터의 최종 부피를 구성합니다. 혼합물을 철저히 혼합한 후 용액을 일회용 메타크릴레이트 큐벳에 옮겨 330-800나노미터의 흡수 스펙트럼을 수집합니다.

마찬가지로, 앞에서 설명한 대로 50마이크로그램의 아밀로펙틴과 30마이크로그램의 아밀로스로 흡수 스펙트럼을 얻습니다. 특성화되지 않은 글리코겐 샘플의 분지 구조를 확인하려면 25-50마이크로그램의 글리코겐을 650마이크로리터의 작동 요오드 염화칼슘 색소 시약과 결합하고 앞서 설명한 대로 진행하여 흡수 스펙트럼을 획득합니다. 글리코겐 합성효소 분석법에서 시간이 지남에 따라 340나노미터에서 흡수의 선형 감소가 관찰되었습니다.

분석에 글리코겐 합성효소를 너무 많이 첨가하면 처음 2분 이내에 반응이 완료되었습니다. 글리코겐 합성효소(glycogen synthase)를 함유하지 않은 대조 반응에서는 흡광도가 측정 가능한 감소를 보이지 않았습니다. 정제된 효소를 사용한 글리코겐 인산화효소 분석의 데이터는 3분 동안 지속되는 선형 상을 가졌습니다.

분당 약 0.01에서 0.04 단위의 흡광도 증가율이 최적입니다. 글리코겐 탈분기 효소 분석법에서 반응은 최소 10분 동안 지속되는 선형상을 보여주었습니다. 글리코겐 분지 효소 분석의 대표적인 데이터는 분지 효소가 없는 대조군 샘플과 분지 효소를 함유한 반응 간의 흡광도 차이를 보여주었습니다.

분석의 좁은 동적 범위가 설명되어 있습니다. 생성할 수 있는 흡광도의 최대 변화는 0.4 흡광도 단위이며, 흡수 변화가 약 0.2 흡광도 단위일 때 선형성은 손실됩니다. 글리코겐 분지화 평가에 사용된 글리코겐, 아밀로펙틴 및 아밀로스의 질량은 각각 다른 흡광도 최대값에서 약 0.7에서 0.8의 최대 흡광도 판독값을 나타냈습니다.

글리코겐 샘플은 약 400나노미터와 460나노미터에서 두 개의 피크를 생성했습니다. 요오드 염화칼슘 색소 시약은 매우 조밀합니다. 흡수 스펙트럼을 수집하기 전에 글리코겐 샘플이 시약과 완전히 혼합되었는지 확인하는 것이 중요합니다.