부력 활성화 세포 분류를 사용한 부유 선광 기반 T 세포 분리

부력 활성화 세포 분류(BACS)를 사용하여 면역 체계에 필수적인 백혈구인 T 세포를 분리하려면 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 현탁액을 채취합니다. PBMC에는 표적 T 세포와 B 세포, 단핵구, 자연 살해 세포 및 수지상 세포와 같은 비표적 세포가 포함되어 있습니다.

적절한 양의 비오티닐화 항-CD3 항체를 포함하는 완충액을 첨가하고 필요한 시간 동안 배양합니다. 항체는 T 세포의 특징인 세포 표면의 다량체 단백질 복합체인 CD3 복합체에 결합합니다.

항체 결합 T 세포의 양성 선택을 위해 기능화된 미세 기포(스트렙타비딘으로 코팅된 작은 구형 입자)를 추가합니다. 각 미세 기포의 핵심은 속이 빈 구체이므로 수용액에 떠 있을 수 있는 저밀도 입자입니다.

반하면서 혼합물을 배양하여 미세 기포와 샘플이 완전히 혼합되도록 합니다. 배양하는 동안 미세버블의 스트렙타비딘은 T 세포 결합 항체의 비오틴에 결합하여 마이크로버블의 세포를 고정시킵니다.

튜브를 원심분리합니다. 비표적 세포는 바닥에서 펠릿으로 혼합물에서 분리됩니다.

표적 T 세포 결합 미세 기포는 표면에 떠 있어 T 세포의 부력 기반 분리로 이어집니다. 이 분리 기술은 표적 세포에 대한 스트레스를 제한합니다. 얇은 피펫을 사용하여 미세 기포 층을 방해하지 않고 펠릿과 서브액을 제거합니다.

추가 처리를 위해 분리된 미세 기포 결합 T 세포를 적절한 배양 배지에 재현탁합니다.

시작하려면 3 x 10 8 상업적으로 얻은 PBMC를 비오티닐화된 항-CD3 항체와 함께 2.5밀리리터의 분리 완충액에서 배양합니다. 피펫팅으로 성분을 부드럽게 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

제조업체의 지침에 따라 스트렙타비딘 미세 기포를 0.5:1의 비율로 세포에 첨가하고 상업용 종단 회전기를 사용하여 실온에서 10-15분 동안 20RPM으로 혼합합니다. 실온에서 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 양성으로 선택된 세포는 스트렙타비딘 미세 기포가 있는 현탁액의 상단에 있고 선택되지 않은 나머지 세포는 튜브 바닥의 세포 펠릿에 있습니다.

9인치 유리 피펫을 사용하여 기포 세포층 아래의 팁을 튜브 바닥에 삽입합니다. 전자 피펫으로 세포 펠릿과 하층액을 흡인하여 새 튜브로 옮깁니다.

원래 튜브에 남아 있는 기포 세포층을 1밀리리터의 완전 T 세포 배지에 재현탁합니다. 하액액을 실온에서 5분 동안 400 x g으로 원심분리하고 순도 및 회수율의 간접 측정에 사용합니다.