호중구와 생물막 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 체외 분석

생물막은 미생물 기원의 세포외 고분자 물질(EPS) 매트릭스 내부에 내장된 표면 부착 박테리아 군집입니다.

시험관 내에서 면역 세포-생물막 상호작용을 연구하려면 기회 병원체인 황색포도상구균의 생물막이 포함된 채널이 있는 슬라이드를 촬영합니다. 조작된 박테리아는 현미경 검출을 위해 형광 단백질을 발현합니다. 채널은 박테리아에 영양분을 공급하기 위해 매체로 채워진 저장소에 연결됩니다.

형광 세포 추적 염료로 표지된 호중구 현탁액을 추가합니다. 배지에는 죽은 세포의 DNA를 염색하는 에티듐 동형이량체도 포함되어 있습니다. 생리학적 조건에서 배양합니다.

호중구의 패턴 인식 수용체는 박테리아의 병원체 관련 분자 패턴에 결합합니다. 결합은 호중구가 박테리아를 식균하고 세포외 활성 산소종(ROS)을 생성하도록 유도하여 박테리아를 죽입니다.

면역 반응을 피하기 위해 박테리아는 세포 사멸을 유발하는 ROS와 류코시딘 독소를 감소시키는 해독 효소를 방출합니다. 단량체 류코시딘은 호중구의 특정 수용체에 결합하고 다질체화를 거쳐 기공을 형성하여 막 무결성을 파괴하고 세포를 죽입니다.

에티듐 동형이량체는 손상된 세포막을 통해 들어가 죽은 세포를 염색합니다.

광시야 형광 현미경에서 박테리아 세포와 호중구의 하위 집합이 죽은 것처럼 보이며 이는 호중구-생물막 상호 작용을 나타냅니다.

GFP를 발현하는 USA300과 같은 S. aureus의 형광 균주를 사용하여 현미경 이미징을 용이하게 합니다. 호중구를 100마이크로몰 BCD와 함께 섭씨 37도의 로커에서 5% 대기 중 이산화탄소와 함께 30분 동안 배양합니다. 샘플이 어두운 곳에서 배양되었는지 확인하고 빛 노출을 제한하십시오.

과도한 BCD를 세척하려면 호중구를 270 RCF에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인합니다. 호중구를 신선한 HBSS에 재현탁합니다. 그런 다음 BCD로 염색된 호중구에 에티듐 호모이머-1을 4마이크로몰의 최종 농도로 첨가하여 호중구 및 박테리아 사멸을 모니터링합니다.

HBSS로 생물막을 세척하고 마이크로슬라이드에서 성장한 황색포도상구균 생물막에 150마이크로리터의 호중구를 추가합니다. 마이크로슬라이드를 가습 챔버에서 30분 동안 배양합니다. 박테리아 세포의 수는 18시간 생물막 도금에서 얻은 세포 수를 기반으로 합니다.

형광 염료 또는 단백질의 여기 및 방출 파장에 해당하는 형광 채널을 사용하여 호중구 생물막 상호 작용을 이미지