Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석
2011년 1월 30일
분석은 박테리아와 곰팡이의 초기 biofilm 형성을 측정하는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 미생물의 biofilm 형성에 대한 하층으로 microtiter 접시를 사용하고, biofilm은 크리스탈 바이올렛 스트레인을 사용하여 시각입니다. 분석도 초기 biofilm 형성에 대한 질적 양적 분석 또는를 제공합니다.
본 절차의 전반적인 목표는 마이크로타이터 플레이트 내에서 바이오필름을 형성하고 연구하는 것입니다. 이는 먼저 96웰 플레이트에 세균 배양액을 첨가함으로써 수행됩니다. 다음으로, 바이오필름을 염색하기 위해 미생물에 따라 적절한 온도와 시간 동안 배양액을 배양합니다.
각 박테리아 웰에 크리스탈 바이올렛을 첨가한 후, 박테리아를 세척합니다. 마지막으로, 웰을 촬영하고 박테리아의 양을 정량화합니다. 최종적으로 크리스탈 바이올렛 측정을 통해 시간에 따른 바이오필름의 축적과 형성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
이 방법의 주요 장점은 연구자가 세균 및 진균 생물체에서 바이오필름 형성을 빠르게 평가할 수 있다는 점입니다. 또한 고처리량 유전자 스크리닝이나 바이오필름 형성을 억제하는 새로운 치료 화합물을 식별하도록 구성할 수도 있습니다. 야생형 pseudomonas, aerogen 또는 돌연변이 균주의 5 mL 하룻밤 배양액을 준비하십시오.
LB 배지에서, 10 µL의 배양액을 마그네슘, 황산염, 포도당 및 카시노 산(cassino acids)이 첨가된 신선한 M 63 최소 배지 1 mL에 희석합니다. 다음으로, 피펫을 사용하여 희석된 배양액 100 µL를 96-웰 라운드 바텀 플레이트의 각각의 웰에 옮깁니다. 플레이트를 37 °C에서 4~24시간 동안 배양하여 바이오필름이 성장하도록 합니다.
바이오필름이 형성되면 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고, 플레이트를 뒤집어 액체를 털어냄으로써 배양 상층액을 제거합니다. 그런 다음, 배경 염색을 유발할 수 있는 잔류 미결합 세포나 배지 성분을 씻어내기 위해 플레이트를 작은 수조에 조심스럽게 담급니다. 물기를 털어내고 플레이트를 닦아낸 후, 세척 과정을 반복합니다.
플레이트가 깨끗해지면, 웰당 125 µL의 0.1% crystal violet 용액을 첨가합니다. 세포를 염색하기 위해 플레이트를 상온에서 10분에서 15분 동안 배양합니다.
그 다음, 앞서 시연한 대로 플레이트를 3~4회 세척합니다. 마지막 세척 후, 페이퍼 타월 뭉치 위에서 플레이트를 강하게 눌러 여분의 액체를 제거한 다음, 플레이트를 뒤집어 놓은 상태로 몇 시간 동안 건조시킵니다. 플레이트가 건조되면, 디지털 카메라로 웰을 촬영하여 바이오필름의 품질을 평가할 수 있습니다.
여기서 보는 바와 같이, 왼쪽의 pseudomonas aerogen 및 오른쪽의 pseudomonas fluorescence와 같은 운동성 박테리아는 바이오필름 성장 과정 중 공기-액체 계면에 바이오필름을 형성하는 경향이 있습니다. 이와 대조적으로, 비운동성 박테리아인 staphylococcus ora는 웰 바닥에 바이오필름을 형성합니다. 바이오필름을 정량화하려면, 먼저 아세트산만 포함된 공시료(blank) 웰을 포함하여 각 웰에 30% acetic acid 125 µL를 첨가하고, 바이오필름에 유지된 crystal violet이 용해될 수 있도록 플레이트를 실온에서 10~15분 동안 배양하십시오.
다음으로, 각 웰에서 125 µL의 가용화된 염색액을 새로운 평평한 바닥의 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 리더를 사용하여 550 nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 각 웰의 크리스탈 바이올렛 농도는 바이오필름 내의 세포 수에 비례합니다.
이 그래프는 37°C에서 배양하는 동안 시간이 경과함에 따라 pseudomonas fluorescence에 의해 형성 및 축적된 바이오필름의 정량적 수치를 보여줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, 현미경 관찰과 같은 다른 방법과 병행하여 사용되는 96-well 플레이트 바이오필름 분석법을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이는 바이오필름 형성에 대한 우리의 이해를 높이는 데 크게 기여할 수 있습니다.
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개요
본 분석법은 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 박테리아 및 곰팡이의 초기 바이오필름 형성을 측정하는 신속한 방법을 설명합니다. 바이오필름은 크리스탈 바이올렛 염색으로 시각화하여 정성적 및 정량적 분석이 모두 가능합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미생물학
- 바이오필름 연구
- 어세이 개발
배경
- 바이오필름은 표면에 부착되는 미생물 군집입니다.
- 바이오필름 형성을 연구하는 것은 미생물의 행동을 이해하는 데 매우 중요합니다.
- 크리스탈 바이올렛은 바이오필름을 시각화하는 데 사용되는 일반적인 염료입니다.
- 이 방법을 통해 바이오필름의 발달 정도를 신속하게 평가할 수 있습니다.
연구 목적
- 초기 바이오필름 형성을 위한 신뢰성 있는 분석법을 구축한다.
- 시간 경과에 따른 바이오필름 축적량을 정량화한다.
- 바이오필름 내 미생물 상호작용 연구를 용이하게 한다.
사용된 방법
- 박테리아 배양액을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 넣습니다.
- 적절한 온도와 시간 동안 배양액을 배양합니다.
- 바이오필름을 염색하기 위해 크리스탈 바이올렛을 첨가합니다.
- 웰을 세척하고 사진을 촬영하여 바이오필름 형성을 정량화합니다.
주요 결과
- 결과를 통해 시간이 경과함에 따라 바이오필름이 축적됨을 확인할 수 있습니다.
- 크리스탈 바이올렛 측정을 통해 정량적 데이터를 얻을 수 있습니다.
- 본 분석법은 바이오필름 형성을 명확하게 시각화하여 제공합니다.
결론
- 이 방법은 초기 바이오필름 형성을 연구하는 데 효과적입니다.
- 다양한 박테리아 및 진균 종에 적용할 수 있습니다.
- 이 분석법은 미생물 바이오필름 역학에 대한 이해를 높여줍니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
마이크로타이터 플레이트 바이오필름 형성 분석법은 초기 단계의 바이오필름 발달을 신속하고 고처리량으로 평가할 수 있어, 항균제 발굴 과정의 타겟 검증을 지원합니다. 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 바이오필름 축적량을 정량화함으로써, 이 방법은 미생물 부착 및 잔류를 표적으로 하는 치료제 후보 물질의 위험 요소를 감소시키는 데 도움이 되는 재현 가능하고 정량적인 데이터를 제공합니다. 이 확장 가능한 접근 방식은 박테리아 및 진균 시스템 전반에 적용 가능하여, 바이오필름 조절 화합물에 대한 초기 단계 스크리닝을 용이하게 합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: adhesin, pili 및 cyclic-di-GMP 경로와 같이 바이오필름 형성에 필수적인 유전자와 인자를 식별함으로써 치료 가설을 검증합니다.
- 운영적 가치: 표준화된 조건 하에서 미생물 균주의 기능 상실 스크리닝을 통해 기능적 표적 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 초기 바이오필름 형성을 억제하는 화합물과 효과가 없는 화합물을 구분하여 포트폴리오 우선순위 선정을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 재현 가능한 바이오필름 형성 지표를 수립하여 후속 화합물 스크리닝을 위한 검증된 미생물 시스템을 준비합니다.
- 운영적 가치: 96-웰 플레이트 형식을 사용한 표준화된 배양, 염색 및 정량 단계를 통해 분석법의 표준화를 구현합니다.
- 확장성: 다양한 미생물 균주에 걸쳐 유전자 스크리닝 및 화합물 라이브러리에 활용 가능한 스크리닝 준비 상태와 플랫폼 재사용성을 강조합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구 관련성: 초기 바이오필름 형성 데이터와 표현형 내성 프로필을 연결하여, 항균 후보 물질의 기전적 위험 제거를 지원합니다.
- 전임상 연속성: 시험관 내(in vitro) 바이오필름 억제 효과를 항생제 및 면역 작동제에 대한 내성과 연결함으로써, 위험 조정된 추진 결정을 가능하게 합니다.
- 바이오마커 일치성: 바이오필름 관련 내성 표현형과 상관관계가 있는 정량적 결과물을 통해 중개 바이오마커 개발을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
본 분석법은 표적 식별부터 리드 최적화까지의 신약 발견 연속 과정에 적합하며, 특히 바이오필름 매개 내성을 표적으로 하는 항감염제 프로그램에 유용합니다.
- 발견 생물학: 유전적 및 화학적 섭동을 통해 미생물 부착 및 바이오필름 형성 경로의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 바이오필름 형성과 크리스탈 바이올렛 정량을 통한 분석 준비 과정을 설명하여 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 가능하게 합니다.
- 분석: 550 nm에서의 정량적 흡광도 측정을 강조하여 다양한 조건 및 균주 간의 바이오필름 바이오매스 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 만성 감염에서 관찰되는 내성 기전을 모델링함으로써 초기 바이오필름 억제 데이터를 전임상적 관련성과 연결합니다.
- 기업 재사용: 본 방법을 여러 병원균 모델에 걸친 항균, 항진균 및 항바이오필름 프로그램에서 재사용 가능한 스크리닝 플랫폼으로 제시합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 유전적 또는 약리학적 개입 시 바이오필름 형성의 측정 가능한 감소를 통해 표적 검증에 대한 예측 신뢰도를 제공함.
- 운용적 가치: 고처리량 애플리케이션을 위한 96-웰 포맷 전반의 표준화, 재현성 및 확장성 확보.
- 전략적 가치: 직교적 바이오필름 정량을 통해 위양성을 줄임으로써 리드 화합물 발굴 단계에서 보다 정확한 진행/중단 결정 가능.
- 포트폴리오 영향: 초기 바이오필름 형성의 용량 의존적 억제 효과를 기반으로 화합물의 위험 조정 우선순위 설정.
구현 시 고려 사항
- 멸균 기술, 배양액 준비 및 바이오필름 취급에 관한 미생물학적 전문 지식이 필요합니다.
- 550 nm에서 흡광도 측정이 가능한 플레이트 리더기와 표준 96-well 마이크로타이터 플레이트에 대한 접근이 필요합니다.
- 웰 간 변동성을 최소화하기 위해 배양 시간, 세척 단계 및 염색 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 부착 특성이 다른 비모델 생물체나 진균으로 확장할 때 적응 고려 사항이 수반됩니다.
- 소스에 명시된 바와 같이, 성숙한 바이오필름 구조나 흐름 의존적 표현형을 모델링할 수 없다는 점과 같은 실질적인 제한 사항이 포함됩니다.
