Microtiter 디시 Biofilm 형성 분석

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로타이터 접시에서 생물막을 확립하고 연구하는 것입니다. 이는 먼저 96웰 플레이트에 박테리아 배양액을 추가함으로써 이루어집니다. 다음. 배양액은 생물막을 염색하기 위해 미생물에 따라 적절한 온도와 시간에 배양됩니다.

크리스탈 바이올렛을 박테리아의 각 웰에 첨가한 다음 박테리아를 씻어냅니다. 마지막으로, 우물을 촬영하고 박테리아를 정량화합니다. 궁극적으로, 크리스탈 바이올렛의 측정을 통해 시간이 지남에 따라 생물막의 축적 및 형성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법의 주요 장점은 조사관이 박테리아 및 곰팡이 유기체에서 생물막 형성을 빠르게 평가할 수 있다는 것입니다. 또한 고처리량 유전자 스크리닝을 위해 구성하거나 생물막 형성을 억제하는 새로운 치료 화합물을 식별할 수 있습니다. 야생형 슈도모나스, 에어로겐 또는 돌연변이 균주의 5밀리리터 하룻밤 배양을 준비합니다.

LB 배지에서 10마이크로리터의 배양액을 마그네슘, 황산염, 포도당 및 카시노산이 보충된 최소 배지인 1ml의 신선한 M 63으로 희석합니다. 다음으로, 피펫 이송을 사용하여 100마이크로리터의 희석된 배양액을 96웰 원형 바닥 플레이트의 별도 웰로 넣습니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 4-24시간 동안 배양하여 생물막이 성장할 수 있도록 합니다.

생물막이 형성되면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트를 뒤집고 액체를 흔들어 배양 상층액을 버립니다. 그런 다음 플레이트를 작은 물통에 부드럽게 담그어 배경 얼룩을 유발할 수 있는 결합되지 않은 세포나 중간 성분을 씻어냅니다. 물을 털어내고 접시를 닦아낸 다음 세탁을 반복합니다.

플레이트가 깨끗해지면 웰당 125마이크로리터를 추가합니다. 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액. 세포를 염색하려면 플레이트를 실온에서 10-15분 동안 배양합니다.

그런 다음 앞에서 설명한 것처럼 접시를 서너 번 씻으십시오. 최종 세척 후 여분의 액체를 제거하기 위해 종이 타월 더미에 접시를 세게 두드려 말리고 접시를 거꾸로 놓고 몇 시간 동안 거꾸로 말리십시오. 플레이트가 건조되면 디지털 카메라로 웰을 촬영하여 생물막의 품질을 평가할 수 있습니다.

여기에서 볼 수 있듯이 왼쪽의 슈도모나스 에어로겐(pseudomonas aerogen) 및 오른쪽의 슈도모나스 형광(pseudomonas fluorescence)과 같은 운동성 박테리아는 생물막이 성장하는 동안 공기 액체 계면의 위치에서 생물막을 형성하는 경향이 있습니다. 대조적으로, 포도상 구균 또는 박테리아는 우물 바닥에있는 비 운동성 형태의 생물막입니다. 먼저 생물막을 정량화하기 위해 아세트산만 포함된 빈 웰을 포함하여 각 웰에 125마이크로리터의 30% 아세트산을 추가하고 플레이트를 실온에서 10-15분 동안 배양하여 생물막에 의해 유지된 크리스탈 바이올렛이 용해될 수 있도록 합니다.

다음으로, 각 웰에서 125마이크로리터의 용해성 염색을 바닥이 평평한 새로운 96웰 마이크로타이터 플레이트로 옮깁니다. 플레이트 리더를 사용하여 550나노미터의 파장에서 각 웰의 흡광도를 정량화합니다. 각 웰에 있는 크리스탈 바이올렛의 농도는 생물막에 있는 세포의 수에 비례합니다.

이 그래프는 섭씨 37도에서 배양하는 동안 시간 경과에 따른 슈도모나스 형광에 의한 생물막 형성 및 축적의 정량화를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 현미경 검사와 같은 다른 방법과 함께 사용되는 96웰 Dish 생물막 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이는 생물막 형성에 대한 우리의 이해에 크게 기여할 수 있습니다.