시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 감염에 대한 반응으로 상피 세포 단층을 통과한 호중구의 수를 결정하는 것입니다. 이는 역트랜스웰 필터 기동을 사용하여 상피 세포 단층을 신중하게 배양하기 전에 트랜스웰을 콜라겐 코딩하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 트랜스웰 필터에서 자란 상피 단층의 정점 표면을 감염시키기 위해 세균 병원체를 배양하여 상피 세포가 내인성 호중구 화학 유인 물질을 생성하도록 합니다.

다음으로, 전혈에서 분리된 호중구를 트랜스웰 필터에서 성장한 감염된 상피 단층의 기저측 측에 첨가하여 기저측에서 정점측으로의 호중구의 이동을 분석합니다. 마이그레이션된 호중구에서 myelo peroxidase의 정량화를 기반으로 감염된 상피 단층에 대한 반응으로 관찰되는 trans epithelial moving 호중구의 수가 크게 증가했음을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 상피 장벽을 성장시키고 감염시키기 위한 역 트랜스웰 필터 조작은 틀에 얽매이지 않기 때문에 익숙하지 않은 연구 그룹이 실험실에서 확립하기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

이 기술의 의미는 폐렴 또는 낭포성 섬유증과 같은 감염을 포함하는 기도 염증성 질환의 치료로 확장되는데, 이는 과도한 호중구성 호중구, 점막 장벽 파괴의 해로운 영향을 완화할 수 있는 호중구 횡단 상피 이동의 양을 줄이기 위해 새로운 치료법을 개발하고 테스트할 수 있기 때문입니다. 제 연구실의 임상 펠로우인 Mark와 함께 선임 기술자 Wahi Preza와 박사 후 연구원 Michael Pesos가 절차를 시연할 것입니다. 먼저 0.33제곱센티미터의 성장 영역을 제거하고 포장에서 3마이크로미터의 기공 크기로 Transwell을 제거하고 12개의 Transwell이 포함된 24웰 플레이트를 후드 내부에 거꾸로 놓습니다.

바닥판을 들어 올려 옆에 둡니다. 트랜스웰은 이제 거꾸로 됩니다. 24 웰 플레이트 불꽃의 뚜껑 위에 놓여 무균 상태를 유지하고 식히십시오.

멸균 지혈 트랜스웰을 150 x 25mm 페트리 접시에 넣고 거꾸로 된 위치를 유지하고, 에탄올에 준비된 30마이크로리터당 밀리리터 콜라겐 용액을 70마이크로리터의 콜라겐 용액을 각 반전된 트랜스웰 표면의 필터 멤브레인에 피펫으로 주입합니다. 아래쪽 표면에 접근할 때 필터 멤브레인 주위에 벽이 없기 때문에 장력은 이 부피의 용액을 제자리에 유지해야 합니다. 콜라겐 용액이 트랜스웰 측면으로 떨어지지 않도록 주의하고 코팅 시술 중 트랜스웰이 움직이지 않도록 주의하십시오. 이 과정에서 무균 상태를 유지하기 위해 에탄올이 증발할 수 있도록 페트리 접시의 뚜껑을 최소 4시간 동안 열어 두십시오.

후드 팬과 자외선은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 상피 세포를 포장한 후 켜두십시오. 15ml 튜브에서 추출한 Resus 부유 세포 용액 70마이크로리터를 인버티드 콜라겐으로 코팅된 각 트랜스웰에 추가합니다. 트랜스웰을 파종하는 동안 세포가 15ml 튜브의 바닥에 가라앉는 것을 방지하기 위해 주기적으로 튜브를 부드럽게 반전시켜 세포 현탁액을 혼합합니다.

모든 inverted transwell에 상피 세포가 파종되면 페트리 접시 덮개를 교체하고 다음 날 조직 배양 인큐베이터에 세포를 조심스럽게 넣습니다. 원래 멸균 24웰 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 배지를 추가하고 멸균된 지혈제를 사용하여 1밀리리터의 배지가 들어 있는 각 웰로 각 반전된 트랜스 웰을 뒤집습니다. 각 트랜스 웰의 상단 챔버에 0.2ml의 배지를 추가하고 조직 배양 인큐베이터로 돌아갑니다.

인큐베이터에서 최소 8일 동안 Transwell 필터 멤브레인의 아래쪽에서 배양된 상피층을 지지하는 24개의 웰 플레이트를 제거합니다. 지혈제로 각 트랜스 웰의 가장자리를 잡고 24웰 플레이트에서 들어 올립니다. 트랜스웰을 폐기물 통 위로 뒤집어 트랜스웰 내부 챔버에서 배양 배지를 버립니다.

칼슘과 마그네슘이 함유된 Hank's Balanced Salt 용액 또는 Hank's Plus가 들어 있는 세척 비커에 각 Transwell을 담아 Transwell의 내부 챔버를 채웁니다. 그런 다음 내부 챔버의 유체를 폐기물 통에 버리십시오. 이 단계를 잠시 반복합니다.

두 번 세탁한 후 Hank's plus로 세탁하십시오. Transwells를 Hank's Plus 24ml가 들어 있는 새 1웰 플레이트에 넣습니다. 각 웰에서 각 트랜스웰의 상부 챔버를 관찰하여 상피 세포층 무결성을 평가합니다.

Hank's Plus는 24ml의 Hank's Plus가 들어 있는 1웰 플레이트의 웰에 놓일 때 Transwell의 상단 챔버로 누출되어 채워지지 않아야 합니다. 각 트랜스웰을 주의 깊게 관찰한 후 상단 챔버에 0.2ml의 Hanks Plus를 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 30-60분 동안 놓고 상피 세포층을 평형화하고 호중구 횡단 상피 이동 분석을 수행합니다.

Hank's Plus에서 평형을 이룬 Wash Transwells의 24웰 플레이트에서 지혈제로 각 트랜스웰을 잡고 상단 웰의 유체를 폐기물 통에 버립니다. 각 트랜스웰을 150 x 25mm 페트리 접시에 거꾸로 놓고 6개의 거꾸로 된 트랜스웰에 놓습니다. 25마이크로리터의 Hanks plus를 3개의 반전된 트랜스웰에 추가합니다.

25 마이크로리터의 슈도모나스, 아로사 또는 파오로 세포를 감염시키고, 텍스트 프로토콜에 기재된 바와 같이 행크스에 희석한 것을 더하여 최종적으로 3개의 인버티드 트랜스웰로 세포를 감염시키고, 또한 텍스트 프로토콜에 기재된 바와 같이 제조된 행크스 플러스에 희석된 25 마이크로리터의 대장균, K 12 또는 mc 1000으로 세포를 감염시키고, 37°C의 가습실에서 60분 동안 섭씨 37°C와 5%의 이산화탄소를 배양한 후, 텍스트 프로토콜에 기술된 바와 같이 세포를 감염시킨다. 지혈제로 트랜스웰을 잡고 1밀리리터의 Hank's plus가 들어 있는 24웰 세척판에 다시 뒤집어 세척합니다. 바닥 챔버에서.

상단 챔버에 0.2ml의 Hank's plus를 추가합니다. 지혈제로 Transwell을 잡고 첫 번째 세척판에서 제거합니다. 상단 챔버의 유체를 폐기물 통에 버리십시오.

Transwell을 두 번째 24웰 세척 플레이트에 넣기 전에 1ml의 Hanks와 0.2ml의 Hanks plus를 상단 챔버에 추가합니다. 이 단계를 한 번 더 반복하여 총 3회 세탁합니다. 세 번째 세척 후, 감염되지 않은 트랜스 웰 중 3개를 지혈 장소를 사용하여 트랜스 웰의 상부 챔버에서 폐기물 통으로 유체를 버리고, 10마이크로리터의 FMLP 용액의 음성 대조군 피펫 10마이크로리터를 1밀리리터의 행크스를 포함하는 24웰 마이그레이션 플레이트의 3개의 웰 각각에 넣는 24웰 마이그레이션 플레이트의 3개의 웰에 넣습니다. 또한 감염되지 않은 트랜스 웰 3개를 100 나노몰 FMLP를 포함하는 24웰 마이그레이션 플레이트의 3개의 웰에 배치하며, 이는 분리된 호중구의 이동 능력에 대한 긍정적인 대조를 나타냅니다.

그런 다음 PAO 1에 감염된 3개의 트랜스 웰과 mc 1000에 감염된 3개의 트랜스 웰을 1밀리리터의 행크스를 포함하는 24웰 마이그레이션 플레이트의 3개의 해당 웰에 넣고 각 트랜스의 0.1밀리리터 행크 플러스 위에 있는 모든 트랜스 웰의 상단 챔버에 0.1밀리리터의 행크 플러스를 추가합니다. 글쎄, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비된 20마이크로리터의 호중구 현탁액을 조심스럽게 첨가합니다. 호중구의 경 상피 이동을 허용하기 위해 2시간 동안 배양합니다.

2시간 동안 마이그레이션한 후 지혈제로 잡고 트랜스웰을 들어 올리고 24웰 마이그레이션 플레이트의 내벽을 부드럽게 두드립니다. 트랜스 웰을 버리기 전에 10 x 대물렌즈를 사용하여 도립 현미경으로 24웰 이동 플레이트의 웰을 관찰하여 웰에서 호중구의 이동을 전체적으로 평가합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 10 % Triton X 100을 24 웰 마이그레이션 플레이트, 각 표준 및 블랭크에 사용되는 각 웰에 추가합니다.

24웰 마이그레이션 플레이트 표준물질을 회전시키고 20분 동안 저속으로 블랭킹합니다. 섭씨 4도에서. 50마이크로리터의 구연산염 완충액을 추가합니다.

24의 좋은 이동 판에서 각 기준에 그리고 공백에 완전히 이용되는 2개의 우물. 각 샘플의 내용물을 최소 5회 이상 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 그런 다음 각 샘플 웰 100마이크로리터를 96웰 플레이트 이송, 각 표준물질 100마이크로리터 및 블랭크를 96웰 플레이트로 복제하여 이동합니다.

혼합 후 A BTS 용액에 30% 과산화수소 50마이크로리터를 넣고 와류를 용감합니다. 그런 다음 각 샘플에 100마이크로리터의 A BTS 기질 용액을 추가합니다. 96웰 플레이트에서 어두운 곳에서 5-10분 동안 플레이트가 현상되도록 합니다.

405 나노 미터의 파장에서 읽기 전에 lyse 호중구를 포함하는 플레이트의 우물에서 녹색의 발달을 관찰하십시오. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 호중구 횡단 상피 이동을 평가하면 상피층을 가로질러 정점 챔버로 완전히 이동한 호중구를 도립광 현미경을 사용하여 여기에서 시각화한 대로 24웰 이동 플레이트의 하단 웰에서 볼 수 있습니다. 극소수의 호중구가 부과된 화학주성 구배(chemotactic gradient) 없이 감염되지 않은 상피층을 가로질러 이동하는 것으로 관찰되었으며 분석에서 배경 수준을 나타냅니다.

대조적으로, FMLP 구배가 제공되었을 때 풍부한 transmi 호중구가 분명했습니다. 비병원성 대장균 mc 1000에 의한 상피의 감염은 눈에 보이는 trans migrated 호중구를 거의 발견하지 못했지만, 상피층이 폐 병원성 pseudomonas aerogen에 감염되었을 때 많은 trans migrated 호중구를 관찰할 수 있었습니다. 실험에서 이동한 호중구는 myelo peroxidase 활성을 측정하여 정량화됩니다.

호중구의 수는 호중구의 용해 후 측정된 과산화효소 활성의 양과 양의 상관관계가 있으며, 표준 곡선에 대해 선택된 호중구 수 범위에서 선형 관계를 나타내는 값이 있습니다. 상당한 수의 호중구는 A가 제공한 FMLP 구배에 반응하거나 PAO 1에 감염된 상피층에 반응하여 상피층을 가로질러 이동합니다. 자극이 없거나 비병원성 대장균 mc 1000에 의한 정점 상피 감염 후 이동하는 호중구의 수는 분석의 검출 한계 미만입니다.

이 기술을 완전히 익히면 콜라겐 코팅을 하고 상피 세포를 트랜스웰 필터에 파종하는 데 5시간 안에 완료할 수 있으며, 상피 세포가 자랄 때까지 최소 1주일이 걸릴 수 있습니다. 일단 상피 단층이 준비됩니다. 이동 분석은 호중구의 분리 및 박테리아의 준비를 포함하여 5시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 오염을 방지하기 위해 멸균 상태에서 트랜스웰 필터를 준비해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 염증 과정과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 이 절차를 조정할 수 있습니다. 이동한 세포, 상피, 요오초 또는 병원체에 대한 분석을 수행할 수 있습니다.