Name: 시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 배우세요 시험관 내 공동 문화 분석을 통해 병원균 감염에 반응하는 호중구의 상피 이동을 평가하는 방법을. 이 기법은 면역 반응 메커니즘 연구와 점막 감염 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH (1 R01 AI095338-01A1)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
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저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

점막 상피 표면을 가로지르는 호중구 이동은 세균병원균3을가진 감염 다음 질병 병리학에서 일반적인 특징이다. 본 명세서에 기재된 방법론은 세균 감염에 의해 유발되는 염증 과정의 특징을 모델하는 체외 공동문화 분석 시스템에서 유래된 인간 세포를 사용하여 이 개별 이벤트를 실험적으로 격리하는 신속하고 간단한 접근법을 제공한다. 본 시스템은 원래 살모넬라 티피무륨, 시겔라 플렉스네리,및 다양한 병원성 대장균8,19,24,27,28을포함한 장내 병원균에 감염된 편광장 상피세포를 사용하여 개발되었다. 이러한 병원성 유기체의 각각은 거꾸로 된 콜라겐 코팅 투과성 트랜스웰 필터에서 자란 편광 장 상피 단층에서 호중구를 구동 할 수 있습니다. 이 실험 시스템은 폐 상피 장벽과 병원체 유도 호중구 트랜스 상피 이동18,26을탐구하는 수정으로 적응되었다. H292를 제외한 여러 기도 상피 세포주는 일반적으로 인용된 A549, ...

점막 표면은 환경에 만연한 외부 위협에 대한 보호를 제공하는 물리적 및 면역학 장벽 역할을한다 1,2. 병원성 유기체가2를침공할 때 이러한 보호 상피 장벽이 손상될 수 있다. 세균성 병원균의 경우, 이러한 만남은 종종 선천성 면역 체계를 활성화하고 호중구로 알려진 응급 구조자 과립구의 신속한 동원을 유발하여 염증 과정을선동2-4. 호중구 모집을 용이하게 하는 항암제는2-4의상피성 세포를 제거하려는 점막 상피 세포에 의해 부분적으로 생성된다. 점막 상피 표면의 과도하거나 해결되지 않은 호중구 침투는 중요한 병리학을 유발할 수있다 1,5. 이는 항균 호중구 무기고5-7에의한 비특이적 조직 손상의 결과입니다. 이러한 경우에, 호중구의 세균성 통관 능력은 전염성 모욕 도중 호스트 조직의 파괴에 의해 가려져 있습니다.  보호 상피 장벽 기능의 중단은 미생물 및 / 또는 독소에 기본 조직의 향상된 노출로 이어질 수 있습니다, 질병 병리학을 더욱 악화8,9. 이러한 결과는 폐 및 소화관을 포함한 여러 장기 시스템에서 관찰될 수 있다1,5. 더욱이, 천식의 심한 시합, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 염증성 장질환(IBD) 등 비감염성 질환은 과도한 호중구 반응에 의한 점막 상피 장벽의 병리학적 위반에 의해 표시된다4,5,10-12.
점막 감염 에 따른 호중구 모집의 복잡한 과정은 여러 구획 단계1,5,13,14를포함한다. 첫째, 호중구는 내피 이동1,13을용이하게 하는 일련의 세포 대 세포 상호 작용을 통해 순환에서 출발해야 한다. 호중구는 다음 세포 외 매트릭스를 포함하는 기존의 중간 공간을 탐색1,14. 감염된 점막의 루멘에 도달하려면 호중구는 상피 장벽1,4,5를가로 질러 이동해야합니다. 이 복잡한 다단계 현상은 감염15의생체 내 동물 모형을 사용하여 집계에서 수시로 조사됩니다. 이러한 모델은 전체 공정에 참여하지만 각 뚜렷한 구획화단계(16)에중요한 분자 기여도를 해결하기에는 크게 부적당한 체모키인, 접착 분자 또는 신호 경로와 같은 특정 요인의 필요성을 확립하는 데 유용하다. 호중구의 트랜스 내피, 트랜스 매트릭스 또는 트랜스 상피 이동을 모델링하는 시험관 내 시스템 내계가1,14,16,17에서특히 유용하였다.
견고한 동문화 분석 시스템은 병원성 감염18-22에대응하여 호중구 트랜스 상피 이동을 담당하는 메커니즘을 해독하기 위한 목적으로 개발되었다. 이 모형은 세균성 병원체를 가진 편광된 인간 상피 세포 층의 정압 표면을 감염시키는 것을 관련시킵니다18-22바칼측 표면에 새로 고립된 인간 호중구의 적용에 선행된. 호중구는 상피 유래 화학 물질 제품에 대한 응답으로 상피 장벽을 가로 질러 이동18,21-23병원성 감염 다음 분비. 본 모델 시스템은 적절한 조직 특정 세균병원균에 노출된 장 및 폐 상피 배양을 사용하여 사용되었으며 점막 감염 시 호중구 모집 과정에 중요한 새로운 분자 메커니즘을3,8,19,24-28로발표했다. 이 체외 공동문화 모델의 강점은 감소주의자 접근법을 통해 조사관이 잘 통제되고, 매우 재현가능하고, 상당히 저렴한 시스템에서 병원체, 상피 장벽 및/또는 호중구를 실험적으로 조작할 수 있게 한다는 것입니다. 이러한 접근법으로부터 수집된 통찰력은 생체 내 감염 모델22,29,30을사용하여 호중구 모집 중 구획화 된 사건의 집중분석을 수행하기 위해 효과적으로 활용할 수 있다.
이 문서에서는 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 탐구하기 위해이 재현 가능한 모델의 성공적인 설립에 필요한 여러 단계를 보여줍니다. 병원균 슈도모나스 아에루기노사에 감염된 폐 상피 장벽은 이 논문에 등장한다. 그러나, 그밖 조직 상피및 병원체는 경미한 수정으로 대체될 수 있습니다. 겨드개한 콜라겐 코팅 투과성 트랜스웰 필터에 편광 폐 상피 세포 층의 파종 및 배양은 병원성 P. aeruginosa의 성장과 전혈에서 호중구의 격리와 마찬가지로 본원에 상세합니다. 이러한 성분들이 병원균 유발 호중구 트랜스 상피 이동을 관찰하기 위해 결합되는 방법은 재현 가능한 분석법을 확립하기 위해 적절한 양성 및 음수 제어와 함께 제시된다. 병원체 유도 호중구 트랜스 상피 이동의 다양한 측면을 검사하는이 접근 방식의 다양성은 문학에서 특정 연구에 대한 참조와 함께 논의된다.

<table><tbody><tr><td>NCl-H292 세포</td>, <td>ATCC</td>, <td>CRL-1848</td><td></td></tr>, <tr><td>RPMI-1640, 매체</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td>, <td>ATCC</td><td>#47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC#</td><td>39531</td><td></td></tr>, <tr>칼슘 및 마그네슘이 없는<td>D-PBS(1x) 액체</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 태아 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% 배양 배지에</td></tr><tr><td>추가 페니실린-스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 페니실린 10,000 단위 및 10,000 &마이크로; ml당 스트렙토마이신의 g.</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>50ml 분취액은 -20°C에서 냉동 보관됩니다. 사용 중인 부분 표본은 4 &ordm에서 저장할 수 있습니다. C 단기.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>멸균, 칼슘 및 마그네슘 미함유</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>주식 = 0.4%</td></tr><tr><td>콜라겐, 쥐 꼬리</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>표준 프로토콜을 사용하여 실험실에서 쥐의 꼬리에서 직접 분리 할 수도 있습니다</td></tr><tr>구<td>연산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>1 M 구연산 완충액 및 산 구연산 포도당 (ACD) 용액의 구성 요소</td></tr><tr><td>구연산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>1 M 구연산 완충액</td></tr><tr><td>성분 포도당 무수</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8066-250G</td><td>산성 시트레이트 포도당(ACD) 용액의 구성 요소</td></tr><tr>염화<td>암모늄</td><td>시그마-알드리치</td><td>213330-500G</td><td>적혈구(RBC) 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr>중<td>탄산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S6014-500G</td><td>적혈구(RBC) 용해 완충액 EDTA</td></tr><tr><td>시그마-알드리치</td><td>ED-100G</td><td>적혈구(RBC) 용해 완충액의 구성 요소</td><td></td></tr><tr><td>HBSS(+) 분말</td><td>시그마-알드리치</td><td>H1387-10L</td><td>HBSS+HEPES의 주요 구성 요소</td></tr> <tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375-500G</td><td>HBSS+</td></tr><tr><td>시그마코트</td> 구성 <td>요소 시그마-알드리치</td><td>SL2-25ML</td><td>공급업체 지침에 따라 유리 피펫 팁을 코팅하십시오</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) 디아모늄 염 (ABTS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>ABTS 기질 용액의 주요 구성 요소</td></tr><tr><td>30 % 과산화수소 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>ABTS 기질 용액</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP 또는 fMLF)</td><td>의 구성 요소Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>DMSO에서 10 mM의 원액을 준비하고 분취액을 -20 °C에서 보관해야합니다.</td></tr><tr><td>젤라틴 타입 B</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>슈도모나스 분리 한천&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>제조사 따르기 PIA 플레이트를 만드는 데 필요한 지시</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>선택 사항, 호중구 순도를 향상시킬 수 있습니다</td></tr><tr><td>24-웰 마이그레이션 플레이트</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 워시 플레이트</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>70% 에탄올에 담그고 재사용 전에 철저히 세척하면 재사용 가능</td></tr><tr><td>96-웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Permeable Supports&nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>폴리카보네이트; 직경 : 6.5 mm; 성장 면적 : 0.33 cm2; 접시 스타일: 24웰 플레이트; 기공 크기: 3.0 &마이크로; m</td></tr><tr><td>페트리 디쉬</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>각 페트리 디쉬는 24개의 반전된 0.33 cm를 담을 수 있습니다2 Transwells.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0.2 & m 필터 / 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td> 유리 파스퇴르 피펫에 <td>산 시트레이트 덱스트로오스(ACD) 용액</td></tr><tr><td>5-3/4를</td> 살균하려면 <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>사용 전 Sigmacote로 팁 코팅</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td>곡선, 톱니 모양의</td></tr><tr><td>인버토스코프 도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max 마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

점막 표면은 병원성 유기체에 대한 보호 장벽 역할을합니다. 선천성 면역 반응은 주로 호중구를 마이그레이션하는 염증 세포와 조직의 침투로 이어지는 병원균을 감지할 때 활성화됩니다. 이 과정은 과도하거나 해결되지 않은 상태로 유지되는 경우 조직에 파괴적 일 가능성이 있습니다.  체외 모델의 공동 배양은 병원체 유도 호중구 트랜스 상피 이동에 관여하는 독특한 분자 메커니즘을 연구하기 위해 활용될 수 있다. 이 유형의 모델은 병원체, 상피 장벽 또는 호중구의 제어 조작기회를 통해 실험 설계의 다기능성을 제공합니다. 투과성 트랜스웰 필터에서 자란 편극상 단층의 정량적 표면의 병원성 감염은 생리학적으로 관련된 바소포탈을 유혈성 호중구 표면에 적용한다. 본 명세서에서 기술된 시험관 내 모델은 병원성 P. aeruginosa (PAO1)에 감염된 편광폐 상피 단층을 통해 호중구 이주를 입증하는 데 필요한 다중 단계를 보여줍니다. 인간 유래 폐 상피 세포와 투과성 트랜스웰의 파종 및 배양은 전체 인간의 혈액으로부터 호중구의 격리와 함께 PAO1 및 비병원성 K12 E. 대장균(MC1000)의 배양과 함께 설명된다.   병원성 감염에 대응하여 동원된 성공적으로 이주한 호중구의 이민 과정 및 정량적 분석은 양성 및 음의 대조군을 포함한 대표적인 데이터로 나타난다. 이 시험관 내 모델 시스템은 조작하여 다른 점막 표면에 적용할 수 있습니다. 과도 한 호중구 침투를 포함 하는 염증 성 응답 호스트 조직에 파괴 될 수 있으며 병원 성 감염의 부재에서 발생할 수 있습니다. 본 명세서에 기재된 체외 공동학 분석 시스템의 실험적 조작을 통해 호중구 트랜스 상피 이동을 촉진하는 분자 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 염증성 질환뿐만 아니라 다양한 점막 전염에 대한 새로운 치료 목표를 식별할 수 있는 중요한 잠재력을 가지고 있다.

몇몇 연구 결과는 병원체 감염한 상피 층이 호중구 환피상피이동3,8,19,24-28,31,32를용이하게 한다는 것을 보여주었습니다. 이는 상피 세포 유래 호중구 화학작용체 그라데이션3,23의병원체 특이적 유도를 통해 발생한다. 예를 들어, 병원성 P. 아에루기노사가 폐 상피 세포의 정표면과 상호 작용하여 상피층18,22,25,26,33,34를통해 이동하는 호중구의 상당수를 일으킨다. 이 임상적으로 관련된 분석 시스템은 적절한 제어와 결합 할 때 주요 병원균 및 호스트 분자 기여자를 공개하는 여러 가지 방법으로 조작 될 수있다.
미리 감염되지 않은 편광 상피 세포 층에 추가된 호중구는 상당한 숫자로 마이그레이션하지 못합니다. 그러나, 감염되지 않은 상피 층을 통해 화학 요법 그라데이션의 응용 프로그램은 전역 호중구의 상당수를 구동합니다. 병원체 감염 상피 층을 통해 호중구 이주를 조사할 때 각 분석결과 내에...

점막 세균 감염에 응하여 호중구 트랜스 상피 이동은 상피 손상 및 임상 질병에 기여합니다.  시험관 내 모델은 병원체, 인간 호중구 및 트랜스웰 필터에서 자란 편광 된 인간 상피 세포 층을 결합하여이 현상을 조율하는 분자 메커니즘을 해명하는 쪽으로 조사를 용이하게하는 것으로 개발되었습니다.

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

다음 실험의 전반적인 목표는 감염에 대한 반응으로 상피 세포 단층을 통과한 호중구의 수를 결정하는 것입니다. 이는 역트랜스웰 필터 기동을 사용하여 상피 세포 단층을 신중하게 배양하기 전에 트랜스웰을 콜라겐 코딩하여 달성됩니다. 두 번째 단계로, 트랜스웰 필터에서 자란 상피 단층의 정점 표면을 감염시키기 위해 세균 병원체를 배양하여 상피 세포가 내인성 호중구 화학 유인 물질을 생성하도록 합니다.다음으로, 전혈에서 분리된 호중구를 트랜스웰 필터에서 성장한 감염된 상피 단층의 기저측 측에 첨가하여 기저측에서 정점측으로의 호중구의 이동을 분석합니다. 마이그레이션된 호중구에서 myelo peroxidase의 정량화를 기반으로 감염된 상피 단층에 대한 반응으로 관찰되는 trans epithelial moving 호중구의 수가 크게 증가했음을 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 상피 장벽을 성장시키고 감염시키기 위한 역 트랜스웰 필터 조작은 틀에 얽매이지 않기 때문에 익숙하지 않은 연구 그룹이 실험실에서 확립하기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.이 기술의 의미는 폐렴 또는 낭포성 섬유증과 같은 감염을 포함하는 기도 염증성 질환의 치료로 확장되는데, 이는 과도한 호중구성 호중구, 점막 장벽 파괴의 해로운 영향을 완화할 수 있는 호중구 횡단 상피 이동의 양을 줄이기 위해 새로운 치료법을 개발하고 테스트할 수 있기 때문입니다. 제 연구실의 임상 펠로우인 Mark와 함께 선임 기술자 Wahi Preza와 박사 후 연구원 Michael Pesos가 절차를 시연할 것입니다. 먼저 0.33제곱센티미터의 성장 영역을 제거하고 포장에서 3마이크로미터의 기공 크기로 Transwell을 제거하고 12개의 Transwell이 포함된 24웰 플레이트를 후드 내부에 거꾸로 놓습니다.바닥판을 들어 올려 옆에 둡니다. 트랜스웰은 이제 거꾸로 됩니다. 24 웰 플레이트 불꽃의 뚜껑 위에 놓여 무균 상태를 유지하고 식히십시오.멸균 지혈 트랜스웰을 150 x 25mm 페트리 접시에 넣고 거꾸로 된 위치를 유지하고, 에탄올에 준비된 30마이크로리터당 밀리리터 콜라겐 용액을 70마이크로리터의 콜라겐 용액을 각 반전된 트랜스웰 표면의 필터 멤브레인에 피펫으로 주입합니다. 아래쪽 표면에 접근할 때 필터 멤브레인 주위에 벽이 없기 때문에 장력은 이 부피의 용액을 제자리에 유지해야 합니다. 콜라겐 용액이 트랜스웰 측면으로 떨어지지 않도록 주의하

in-vitro-coculture-assay-to-assess-pathogen-induced-neutrophil-trans

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.

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우리는 uropathogenic 대장균 방광 감염 동안 급성 염증 반응의 중요 성분을 모방 체외 모델을 개발 하였다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 세균 감염이나 화학 유인 물질에 대한 응답으로, 투과 지원에서 배양, 방광 상피를 통해 인간의 호중구 이주의 양적 평가를 할 수 있습니다.

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

Dysregulated 장 상피 장벽 기능 및 면역 반응은 생리적인 모형의 부족 때문에 제대로 조사되지 않는 선동적인 장 질병의 특징입니다. 여기서는 생체 내 점막 투과성 및 백혈구 모집을 연구하기 위해 잘 혈관화되고 외부화된 장 세그먼트를 사용하는 마우스 장 루프 모델을 설명합니다.

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

대장균은 출생 무렵에 박테리아를 섭취하는 신생아에게 패혈증을 일으킵니다. 대장균이 장내에서 혈류로 이동하는 능력과 관련된 과정은 잘 이해되지 않았습니다. 이 시험관 내 모델은 대장균 균주가 장 상피 세포를 통해 이동하는 능력을 평가합니다.

신생아 대장균 균 혈증 분리물의 장 트랜스사이토시스 평가

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

이 연구는 조직 줄기세포에서 유래한 장 오가노이드를 이용한 세균 감염의 시험관 내 조사 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 2차원에서 오가노이드를 배양하고 구분하는 방법, 침착성 대장균으로 감염시키는 방법, 그리고 상피 장벽 돌파, 감염 영상, 상피 RNA 반응 등 주요 측정값을 평가하는 방법을 설명합니다.

숙주-박테리아 상호작용을 연구하기 위한 침입 또는 저저막 추출물에 적용한 2차원 오가노이드 배양

배우세요 시험관 내 공동 문화 분석을 통해 병원균 감염에 반응하는 호중구의 상피 이동을 평가하는 방법을. 이 기법은 면역 반응 메커니즘 연구와 점막 감염 치료 전략 개발에 활용됩니다.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

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