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그람 음성 박테리아의 외막 성분인 지질다당류(LPS)에 대한 단클론 항체를 포함하는 연속적으로 희석된 혈청 샘플을 채취합니다.
그람 음성 박테리아를 도입합니다. 혈청 항체는 박테리아 LPS에 결합합니다.
보체 단백질을 첨가하십시오. C1 복합체는 LPS 결합 항체에 결합하여 효소 활성 C1을 형성합니다.
활성화된 C1은 C4와 C2를 절단하여 C3 전환효소를 형성하고, C3를 절단하여 C5 전환효소를 형성합니다. 전환효소는 C5를 절단하여 C6과 C7을 모집하는 C5b를 생성합니다. 생성된 복합체는 외막에 삽입되어 C8 및 여러 C9와 결합하여 기공을 형성합니다.
외막 손상은 내막을 불안정하게 하여 세포 용해를 일으킵니다.
혼합물을 한천 접시에 놓고 펴 바릅니다. 박테리아 성장을 위해 배양합니다. 미생물 탈수소효소에 의해 환원되어 박테리아 콜로니에 붉은색을 부여하는 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)가 함유된 한천으로 플레이트를 덮습니다.
콜로니 수는 시료 희석에 따라 증가하며, 이는 항체 농도가 낮을수록 살균 활성이 감소함을 나타냅니다.
시작하려면 샘플을 섭씨 56도의 따뜻한 수조에서 30분 동안 배양하여 테스트 샘플을 열 비활성화합니다. 분석 플레이트와 20마이크로리터의 분석 완충액을 A행 내지 G 행의 1열 내지 12에 얻고, 분석 완충액 20마이크로리터를 H행 1열과 2열에 첨가하고, 각 테스트 샘플 30마이크로리터를 분석 플레이트의 H행에 이중으로 로드합니다.
테스트 샘플의 3배 연속 희석을 시작하려면 다중 채널 피펫을 사용하여 웰 3H에서 12H까지 10마이크로리터를 제거합니다. 샘플을 행 G의 해당 웰로 옮기고 위아래로 8-10회 피펫팅하여 샘플 웰을 혼합합니다. 그런 다음 이 웰에서 10마이크로리터를 제거하고 F행의 해당 웰로 옮기고 위아래로 8-10회 피펫팅하여 혼합합니다. 행 A를 통해 이 연속 희석 프로세스를 계속합니다. A행의 웰을 혼합한 후 웰 3A에서 12A까지 웰에서 10마이크로리터를 제거하고 폐기하여 모든 웰의 최종 부피가 20마이크로리터가 되도록 합니다.
냉동 표적 박테리아 스톡 바이알 1개를 회수하여 실온에서 해동합니다. 그런 다음 미리 결정된 최적 희석 계수에 따라 20ml의 분석 완충액에 박테리아를 희석합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 분석 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터의 희석된 박테리아를 추가합니다.
냉동 아기 토끼 보체 한 병과 냉동 열 비활성화 BRC 한 병을 회수합니다. 흐르는 찬물을 사용하여 바이알을 실온으로 해동합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 열 및 열 비활성화 BRC를 400마이크로리터의 분석 완충액과 혼합합니다. 이 20% 열 비활성화 BRC 용액 50마이크로리터를 열 1의 모든 웰에 추가합니다. 1밀리리터의 천연 BRC와 4밀리리터의 분석 완충액을 혼합합니다. 이 20% 혼합물 50마이크로리터를 열 2에서 12까지의 모든 웰에 추가합니다. 플레이트를 플레이트 셰이커에 10-15초 동안 놓아 분석 플레이트를 부드럽게 혼합합니다.
분석 플레이트를 미생물 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다. 한편, 두 개의 LB 한천 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 플레이트를 앞면이 위로 향하게 하여 생물학적 안전 캐비닛에 40-60분 동안 건조시킵니다. 배양이 완료되면 분석 플레이트를 젖은 얼음으로 옮기고 10-20분 동안 배양하여 반응을 멈춥니다. 12채널 피펫을 사용하여 H 행의 웰을 혼합하고 반응 혼합물 10마이크로리터를 LBA 플레이트 바닥에 스폿 플레이트합니다. 즉시 접시를 기울이고 반점이 약 1.5-2cm 동안 흐르도록 합니다.
G, F 및 E 행에 대해 이 절차를 반복하여 이전 행 위에 있는 위치를 찾습니다. 용액이 LBA 플레이트에 흡수될 때까지 실온에서 LBA 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 접시에 뚜껑을 덮고 거꾸로 미생물 인큐베이터에 옮겨 밤새 배양합니다.
다음날, 각 LBA 플레이트에 밀리리터당 100마이크로그램 TTC와 0.1% 아지드화나트륨을 함유한 섭씨 55도의 오버레이 한천 25ml를 추가합니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하여 살아남은 박테리아가 붉은 색을 띠도록 합니다. 그런 다음 디지털 카메라를 사용하여 플레이트를 촬영합니다. 이미지를 컴퓨터로 전송하고 NIST의 통합 콜로니 열거 소프트웨어를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미지를 분석합니다.