면역 세포의 표현형 및 기능적 특성화를 위한 바코드 분석

자극 및 고정 면역 세포를 포함하는 테스트 샘플로 시작합니다.

자극은 세포에서 특정 마커의 발현을 유도하는 반면, 고정은 세포 표면 항원을 포함한 표현형 마커와 사이토카인을 포함한 기능적 상태 마커를 보존합니다.

각 샘플에 중금속 동위원소 접합 항체의 고유한 조합을 추가합니다.

이 기술은 여러 샘플을 고유하게 바코드화하여 중금속 동위원소의 조합으로 각 샘플을 구별합니다.

항체는 공통 에피토프에 결합하여 샘플의 모든 세포를 바코딩합니다.

다운스트림 처리를 위해 모든 바코드 샘플을 단일 튜브에 결합합니다.

금속 접합 항체 칵테일을 첨가하여 표면 항원을 염색합니다.

투과화 완충액을 첨가하여 세포내 염색을 위한 세포막 투과성을 증가시킵니다.

세포내 사이토카인을 염색하기 위해 또 다른 금속 접합 항체 세트를 추가합니다.

바코드를 사용하면 질량 세포 분석을 통해 풀링된 샘플을 동시에 염색하고 획득할 수 있습니다. 이 기술은 분석 효율성을 극대화하여 표현형 및 기능 상태 마커의 평가를 개선합니다.

용해된 고정 세포를 바코드로 표시하려면 섭씨 영하 80도 보관소에서 얼음 위에서 천천히 샘플을 해동합니다. PBS로 10x 바코드 퍼마 완충액을 1-10으로 희석하고 샘플당 3밀리리터에 충분한 완충액을 만듭니다.

멸균 트로프 1개에 CSM을 채우고 다른 1개에 1x 바코드 퍼마 버퍼를 채웁니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 CSM 1밀리리터를 갓 해동한 샘플에 추가합니다. 완전히 혼합하고 미리 라벨이 부착된 각각의 폴리프로필렌 클러스터 튜브로 옮깁니다.

이제 10마이크로리터 샘플을 채취하고 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 과도한 세포의 부피를 제거하여 각 클러스터 튜브의 세포 수를 정규화합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 세포를 600배 g으로 원심분리합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 1밀리리터의 1x 바코드 파마 완충액에 세포를 재현탁하고 실온에서 5분 동안 600배 g으로 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 흡인합니다.

바코드 키에 표시된 것과 동일한 순서로 클러스터 튜브를 랙에 정렬하여 샘플이 바코드와 일치하도록 합니다. 세포 손실을 줄이기 위해 세포 펠릿을 건드리지 않고 다중 채널 피펫으로 클러스터 튜브의 모든 샘플에 800마이크로리터의 1x 바코드 파마 완충액을 추가합니다.

그런 다음 클러스터 튜브가 있는 랙을 따로 보관하십시오. 섭씨 영하 20도에서 20플렉스 팔라듐 바코드 키트 튜브 스트립을 제거하고 실온에서 해동합니다. 100마이크로리터의 1x 바코드 파마 완충액을 추가하고 완전히 혼합한 다음 재현탁된 바코드 혼합물 120마이크로리터를 클러스터 튜브의 해당 세포 샘플로 옮깁니다.

개별적으로 바코드가 부착된 샘플 사이에 교차 오염이 없도록 다중 채널 피펫으로 완전히 혼합합니다. 클러스터 튜브를 실온에서 30분 동안 배양하여 바코드가 세포에 라벨을 붙일 수 있도록 합니다. 30분 후, 샘플을 실온에서 5분 동안 600배 g으로 원심분리합니다. 상청액을 흡인합니다. 그런 다음 CSM 1밀리리터에 재현탁합니다. 그 후, 원심분리하고 다시 CSM에 재현탁합니다.

그 후, 실온에서 5분 동안 600배g으로 원심분리하고 상청액을 흡인한다. 단일 피펫과 동일한 팁을 사용하여 모든 세포 펠릿과 약 70-80마이크로리터의 잔류 부피를 하나의 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 피펫 팁을 꺼내지 마십시오. 이 팁이 있는 단일 피펫을 따로 보관하십시오.

다중 채널 피펫과 새로운 팁을 사용하여 각 원래 클러스터 튜브에 100마이크로리터의 CSM을 추가하여 세포 회수를 극대화합니다. 따로 보관된 팁이 있는 단일 피펫을 사용하여 잔류 부피 100마이크로리터의 모든 세포 펠릿을 동일한 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. CSM을 추가하여 폴리스티렌 튜브를 약 3밀리리터까지 채웁니다. 풀링된 바코드 세트의 셀 번호를 계산하고 기록합니다. 그런 다음 실온에서 600배g으로 5분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인합니다. 같은 날 바코드 샘플의 염색을 진행합니다.