Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

이 방법은 자가면역 질환 환경에서 주요 사이토카인 생성과 같은 세포 주파수 이상 및 기능 차이를 식별하는 것과 같은 자가면역 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 쉽게 얻을 수 있는 말초 혈액 샘플에서 광범위한 레퍼토리 또는 다양한 세포 유형 및 기능 차이를 캡처할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 프로세스를 처음 접하는 개인은 혈액 처리 단계의 타이밍을 올바르게 잡고, 항체 패널 설계, 바코드 프로세스 자체를 파악하고, 고차원 단일 세포 데이터를 분석하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 시스템 면역학 접근법은 면역 조절 장애가 말초 혈액에 만연하고 명백한 SLE와 같은 자가면역 질환에 특히 적합합니다. 이 방법의 시각적 시연은 단계의 타이밍을 명확히 하고 질량 세포 분석 전에 여러 샘플을 바코드로 지정하고 풀링할 수 있는 방법을 보여주는 데 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 전혈 처리를 위한 5가지 조건의 라벨이 부착된 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브를 랙에 놓습니다.

다음으로, 각 튜브에 섭씨 37도 RPMI 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 전혈 1ml를 넣고 RPMI와 완전히 혼합되도록 위아래로 여러 번 피펫을 넣습니다. 그런 다음 T six plus five R이라고 표시된 튜브에 미리 희석된 룩소리티닙 10마이크로리터를 넣고 완전히 혼합합니다.

튜브 랙을 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓고 배양 타이밍을 시작합니다. T zero 샘플을 처리하려면 T zero 튜브의 전체 내용물을 작업 농도에서 섭씨 37도 용해/고정 버퍼 20ml가 들어 있는 라벨링된 원뿔형 튜브에 피펫팅합니다. 세포 회수를 최적화하려면 용해/고정 완충액으로 튜브를 헹구고 원뿔형 튜브를 뒤집어 혼합합니다.

세포를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 용해와 고정을 허용합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 500배 G로 세포를 원심분리합니다. 그 후, 상등액을 디캔팅하고 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 세포를 다시 현탁시켜 펠릿을 분해합니다.

그런 다음 PBS로 원뿔형 튜브를 15ml 용량으로 채웁니다. 그 후, 실온에서 5분 동안 500배 G로 세포를 원심분리합니다. 펠릿을 분해하기 위해 1ml의 CSM에 세포를 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 항체 염색을 위해 시료를 표지된 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 10마이크로리터 샘플로 세포를 계수합니다. 다음으로, 실온에서 5분 동안 500배 G로 세포를 원심분리합니다.

그 후, 상등액을 흡인하여 펠릿을 약 60 마이크로 리터의 잔류 물로 남겨 둡니다. 다른 조건의 샘플이 처리를 완료할 때까지 이 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. T가 30분과 같으면 튜브 랙을 조직 배양 후드로 옮깁니다.

T six plus R848 튜브에 마이크로리터당 0.1g의 R10 마이크로리터를 추가하고 완전히 혼합합니다. 그런 다음 T six plus LPS 튜브에 마이크로리터당 0.01마이크로그램의 LPS 10마이크로리터를 추가하고 철저히 혼합합니다. 그 후, T 6, T six plus five R, T six plus LPS라고 표시된 튜브에 4마이크로리터의 단백질 수송 억제제를 추가하고 T가 6시간이 될 때까지 샘플을 인큐베이터에 다시 넣습니다.

2시간마다 P1000 피펫으로 샘플을 철저히 혼합합니다. T가 2시간과 같을 때 T six plus R848 튜브에 4마이크로리터의 단백질 수송 억제제 칵테일을 추가합니다. 모든 샘플을 혼합하고 T가 6시간이 될 때까지 랙을 인큐베이터에 다시 넣습니다.

T가 4시간과 같을 때 샘플을 P1000 파이펫과 한 번 더 혼합합니다. T가 6시간과 같을 때, T 0 샘플에 대해 설명한 대로 T 6, T 6 플러스 LPS, T 6 플러스 R848 및 T 6 플러스 5 R 혈액 샘플 튜브를 처리합니다. 그런 다음 펠릿을 섭씨 영하 80도의 잔류 CSM 부피에 보관하여 나중에 처리합니다.

용해되고 고정된 세포를 바코드로 만들려면 섭씨 영하 80도의 얼음 위에서 천천히 보관된 샘플을 해동합니다. PBS가 포함된 10X 바코드 펌 버퍼를 1-10으로 희석하고 샘플당 3밀리리터에 충분한 버퍼를 만듭니다. 비멸균 트러프 하나는 CSM으로, 다른 하나는 X 바코드 펌 버퍼로 채웁니다.

그런 다음 갓 해동한 샘플에 얼음처럼 차가운 CSM 1ml를 넣고 완전히 혼합한 다음 사전 라벨링된 각각의 폴리프로필렌 클러스터 튜브로 옮깁니다. 이제 10마이크로리터 샘플을 채취하여 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 각 클러스터 튜브의 세포 수를 초과 세포의 부피를 제거하여 정규화합니다.

그런 다음 실온에서 5분 동안 600배 G로 세포를 원심분리합니다. 멀티채널 피펫과 원심분리기를 사용하여 1mL의 X 바코드 펌 버퍼에 있는 세포를 실온에서 5분 동안 600배 G로 재현탁합니다. 그 후, 상층액을 흡입하십시오.

바코드 키에 표시된 것과 동일한 순서로 클러스터 튜브를 랙에 정렬하여 샘플이 바코드와 일치하도록 합니다. 세포 펠릿을 건드리지 않고 클러스터 튜브의 모든 샘플에 멀티채널 피펫으로 800마이크로리터의 X 바코드 펌 버퍼를 추가하여 세포 손실을 줄입니다. 그런 다음 클러스터 튜브가 있는 랙을 따로 보관하십시오.

영하 20도에서 20-plex 팔라듐 바코드 키트 튜브 스트립을 제거하고 실온에서 해동합니다. 100마이크로리터의 X 바코드 펌 버퍼 1개를 추가하고, 철저히 혼합한 다음, 다시 부유된 바코드 혼합물 120마이크로리터를 클러스터 튜브의 해당 세포 샘플로 옮깁니다. 멀티채널 피펫으로 철저히 혼합하여 개별적으로 바코드화된 시료 사이에 교차 오염이 발생하지 않도록 합니다.

클러스터 튜브를 실온에서 30분 동안 배양하여 바코드가 세포에 라벨을 붙일 수 있도록 합니다. 30분 후, 실온에서 5분 동안 600배 G로 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 흡입한 다음 CSM 1ml에 다시 현탁합니다.

그런 다음 CSM에서 다시 원심분리기 및 일시 중단합니다. 그 후, 실온에서 600배 G로 5분간 원심분리한 후 상층액을 흡인한다. 단일 피펫과 동일한 팁을 사용하여 약 70-80마이크로리터의 잔류 부피에 있는 모든 세포 펠릿을 하나의 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.

피펫 팁을 꺼내지 마십시오. 이 팁으로 단일 피펫을 따로 보관하십시오. 멀티채널 피펫과 새로운 팁을 사용하여 각 기존 클러스터 튜브에 100마이크로리터의 CSM을 추가하여 세포 회수를 극대화할 수 있습니다.

따로 보관된 팁이 있는 단일 피펫을 사용하여 잔류 부피 100마이크로리터의 모든 세포 펠릿을 동일한 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. CSM을 추가하여 폴리스티렌 튜브를 약 3밀리리터로 마무리합니다. 풀링된 바코드 세트의 셀 번호를 세고 기록합니다.

그런 다음 실온에서 600배 G로 5분간 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 같은 날에 바코드가 부착된 샘플의 염색을 진행합니다. 이 회로도는 혈액 샘플 분취액 할당, 자극제 추가 시기, 단백질 수송 억제제 칵테일, 적혈구 용해 및 고정까지의 배양 시간을 포함하여 말초 혈액 샘플의 자극 및 처리를 위한 워크플로를 보여줍니다.

자극제의 선택은 평가 대상이 되는 신호 전달 및 사이토카인 경로에 따라 달라집니다. 고정 및 적혈구 용해 후, 건강한 기증자로부터 개별적으로 용해되고 고정된 세포 샘플을 바코드로 찍고, 표면 마커에 대해 26개의 항체로 라벨링하고, 투과화하고, 사이토카인에 대해 14개의 항체로 염색했습니다. CD14 높은 단핵구의 식별을 나타내는 제한된 게이팅 전략이 여기에 나와 있습니다.

왼쪽에서 오른쪽으로 표시되는 각 2D 플롯은 2D 플롯에서 바로 왼쪽에 있는 게이트 된 상위 인구의 모집단 하위 집합입니다. 8개의 면역 세포 subset을 대표하는 CD14 high monocytes를 사용하여 TLR agonist LPS 및 R848 및 T 세포 활성화 인자 PMA ionomycin을 사용한 자극 후 0 시간에 건강한 기증자의 말초 혈액 샘플에 대해 대량 세포 분석 분석을 수행했습니다. CD14 고단핵구에서 사이토카인 유도의 예를 나타내고, 사용된 자극제에 특이성을 가진 선택된 사이토카인을 나타내고 있다.

R848은 CD14 고단핵구에서 IL-12p40 subunit 및 MCP1을 선택적으로 유도하는 반면 LPS는 유도하지 않습니다. 대조적으로, PMA ionomycin은 CD14 높은 단핵구에서 사이토카인을 유도하지 않습니다. 일단 숙달되면 혈액 자극은 약 7시간 안에 완료할 수 있으며 바코드 단계는 약 1시간 만에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때는 단계의 타이밍을 염두에 두고 그에 따라 미리 계획을 세우는 것이 중요합니다. 이 절차를 시행한 후에는 자신의 연구 목적에 맞는 면역 세포 반응을 평가하기 위해 질량 세포 분석 패널에서 혈액 자극 조건을 변경하는 것을 고려할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전혈 샘플에서 사이토카인 반응을 유도하는 방법과 질량 세포 분석을 위해 여러 샘플을 바코드 세트로 풀링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.