Name: Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: 배우세요 대량 세포측정법을 이용한 주변 혈액 단일 세포 면역표현형 및 사이토카인 분석 방법. 자가면역 질환에서 면역 조절 이상을 평가하고 세포 기능 차이를 식별하는 데 활용됩니다.

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우리는 그녀의 지적 입력 및 도움이 의견에 대 한 아미 Pugh-버나드를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 Boettcher 재단 웹 Waring 생명 의학 연구 상 및 수상 수 K23 1K23AR070897는 NIH에서 엘레나 W.Y. 셰에 의해 지원 되었다. 그녀는 또한 어린이 건강, 스탠포드 CTSA UL1 TR001085, 및 아동 건강 연구를 위한 아동 건강 및 인간 개발 및 루 패 커드 재단의 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소에서 보너스 번호 K12-HD000850에 의해 지원 되었다 연구소의 스탠포드 대학입니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 여는 콜로라도 여러 기관 검토 위원회 (COMIRB)의 콜로라도의 대학 승인 되었습니다. 필터링 된 피 펫 팁, 명시 되지 않는 한 아래의 모든 설명된 절차 무 균 조직 문화 후드에서 수행 해야 하 고 모든 시 약 필터링.
1. 주변 전체 혈액 처리용 시 약의 준비
<ol><li>준비 ruxolitinib 재고 aliquots (10-15 μ/단일 사용에 대 한 유리병) 10 m m (-80 ° C에 게) 제조업체의 지침에 따라 DMSO에 동결 건조 된 시 약을 diluting 하 여. 0.2% (vol/vol) unstimulated 컨트롤을 포함 하 여 분석 하는 모든 실험에서 DMSO 농도 유지.</li>
	<li>R848 준비 (resiquimod) 재고 aliquots (10-15 μ/단일 사용에 대 한 유리병)로 살 균 물에서 동결 건조 된 시 약을 희석 하 여 1 μ g/μ에는 제조업체의 지시 당. -80 ° c.에 게</li>
	<li>제조업체 지침에 따라 살 균 물에서 동결 건조 된 시 약을 diluting 하 여 lipopolysaccharide 1 μ g/μ에서 (LPS) 재고 aliquots (한 시간 전용 유리병 당 5 μ)을 준비 합니다. -80 ° c.에 게</li>
	<li>셀 얼룩 미디어 (CSM) PBS, 0.5% BSA 0.02% 할머니3를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>취득 하 고 유지 준비 단백질 수송 억제제 (PTI) 칵테일 (자료 테이블).</li>
	<li>해 동 하 고 메 마른 PBS (1mm)에 ruxolitinib 재고 유리병 (10mm) 1시 10분 희석. 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.</li>
	<li>해 동 하 고 희석 R848 재고 유리병 (1 μ g / µ L) 살 균 PBS에서 1시 10분 (0.1 μ g / µ L). 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.</li>
	<li>해 동 고는 LPS 재고 유리병 (1 μ g / µ L) 1: 100 살 균 PBS에 희석 (0.01 μ g / µ L). 실내 온도 조직 문화 후드에 따로 설정 합니다.</li>
	<li>미리 살 균 RPMI (없음 L-글루타민) (적어도 10 분)에 대 한 표준 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.</li>
	<li>1:5 필터링된 ddH2O (작업 농도)는 벤치탑 (살 균 될 필요 하지 않습니다)에 lyse/수정 버퍼를 희석. 참고: 전체 혈액의 1 mL 20 mL lyse/수정 버퍼의 작업의 필요합니다.<ol>
<li>전 혈 각 (적어도 100 mL)의 1 mL의 5 조건 lyse/수정 버퍼를 확인 합니다. Aliquot 20 mL 전 혈 (계속 필요할 때까지 37 ° C에서 lyse/수정 솔루션)의 밀리 리터 당 50 mL 원뿔 튜브에 lyse/수정 버퍼의 작업 농도의. 라벨을 lyse/수정 버퍼를 포함 하는 것은 다음과 같이 원뿔 관에 조건: T0 (시간 제로), T6 + 5R (시간 6 h 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (1 μ g/mL R848 가진 6 h 시간), T6 + LPS (0.1 μ g/mL LPS와 시간 6 h)에 게, T6 (6 h 시간).</li>
	</ol>
</li>
	<li>레이블은 아래쪽 모자 살 균 폴리스 티 렌 튜브 1 mL microcentrifuge 튜브 단계 1.10에서 동일한 명명법 라운드.</li>
</ol>2. 자극과 주변 전 혈 (그림 1)의 처리
<ol><li>하단 폴리스 티 렌 튜브 단계의 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) 선반에 라운드는 레이블이 배치 합니다. 참고: 다음 단계를 모두 수행 됩니다 튜브의이 종류에서 달리 지정 하지 않는 한. 조직 문화 후드와 불 임을 유지 하기 위해 인큐베이터 간에 전송할 때 튜브를 모자.</li>
	<li>각 튜브 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) 37 ° C RPMI (없음 L-글루타민)의 1 mL를 추가 합니다. 반전 혈액 컬렉션 튜브 여러 번, 전체 혈액의 1 mL 각 튜브를 더하고 RPMI 철저 하 게 혼합을 여러 번 위아래 플라스틱 (RPMI와 희석 6 h 잠복기 동안 혈액의 응집 방지).</li>
	<li>추가 1시 10분의 10 μ T6 + 5R ruxolitinib. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스. 37 ° c 배양 기에서 튜브의 랙을 놓고 시작 시기는 부 화 (T = 0).</li>
	<li>T0 샘플을 다음과 같이 처리 합니다.<ol>
<li>T0 튜브의 전체 내용을 포함 하는 37 ° C 작업 농도 lyse/수정 버퍼의 20 mL 레이블이 원뿔 관으로 플라스틱. 최적화 하려면 세포 복구, 작업 농도 lyse/수정 버퍼 튜브를 헹 구 십시오. 원뿔 튜브를 거꾸로 하 여 혼합.</li>
		<li>세포의 용 해 및 고정 수 있도록 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 고정, 다음 벤치탑에서 모든 후속 단계를 수행 합니다. 실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심</li>
		<li>상쾌한을 가만히 따르다. Resuspend 셀 헤어 펠 릿, 얼음 차가운 PBS의 1 mL에 다음 PBS에 채워 볼륨 15 mL 원뿔.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심 상쾌한을 가만히 따르다. 펠 릿은 빨간색 경우 PBS 세척 (단계 2.4.3–2.4.4)를 반복 합니다. CSM는 펠 릿 헤어 다음 항 체 얼룩이 지기에 대 한 레이블된 microcentrifuge 튜브 (1.11 단계)에 전송의 1 mL에 셀 resuspend 자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 10 µ L의 샘플을 가져가 라. 참고: 모든 셀이 시점에서 고정 되어, 이후 아니에요 생존 얼룩을 포함 하는 데 필요한.</li>
		<li>실 온에서 5 분 동안 500 x g에서 셀 원심 잔여 볼륨의 ~ 60 µ L에 펠 릿을 떠나 상쾌한 발음 다른 조건에서 샘플 처리 완료 때까지 얼음에이 펠 릿을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T = 30 분, 조직 문화 후드에 튜브 랙 (2.3 단계)를 이동 하 고 다음을 수행.<ol>
<li>0.1 μ g/μ의 10 μ 추가 T6 + R848 R848. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스.</li>
		<li>T6 + LPS를 0.01 μ g/μ LPS의 10 μ를 추가 합니다. P1000 피펫은 철저 하 게 믹스.</li>
		<li>T6, T6 + 5R, 그리고 T6 + LPS (하지만 하지 T6 + R848)의 단백질 수송 억제제 (500 X 주식) 4 μ를 추가 하 고 T까지 인큐베이터에 샘플 반환 = 6 h. P1000 피 펫 마다 2 h와 철저 하 게 혼합. 참고: R848 endoplasmic TLR 길 항 제 이며, 따라서 그 대상 수용 체에 대 한 액세스 수 있도록 단백질 수송 억제제 이외에 일시적인 지연 필요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>T = 2 h, T6 + R848 단백질 수송 억제 물 칵테일 (500 X 주식)의 4 μ 추가 튜브. 모든 샘플 P1000 피 펫 혼합 및 T까지 인큐베이터에 선반을 반환 = 6 h.</li>
	<li>T에서 한 번 더 한 P1000 샘플 혼합 4 h =.</li>
	<li>T = 6 h 처리 T6, T6 + LPS, T6 + R848, 그리고 T6 + 5R 혈액 샘플 튜브에 설명 된 대로 단계 T0 샘플에 대 한 2.4.</li>
	<li>미래의 날짜에 처리-80 ° C에서 잔여 CSM 볼륨에 셀 펠 릿을 저장 합니다. 또는, 바코드 및 저장 하지 않고 얼룩이 지는 항 체를 진행 합니다.</li>
</ol>3. 바코드 Lysed/고정 혈액 세포의
<ol><li>얼음;에 천천히-80 ° C 저장에서 lysed/고정 셀 샘플을 녹여 20 샘플의 최대 고유 바코드와 함께 표시 될 수 있습니다 그리고이 시스템을 사용 하 여 풀링된. 10 X barcoding 페름 버퍼 PBS; 1시 10분으로 희석 샘플 당 ~ 3 mL에 대 한 충분 한 버퍼를 확인 합니다.</li>
	<li>업체인 CSM와 1 X barcoding 페름 버퍼 하나 한 비 살 균 여 물통을 채우십시오. 얼음의 1 mL을 추가 갓 해 동 샘플, 차가운 CSM 피 펫, 철저 하 게 혼합 하 고 각각 미리 레이블이 지정 된 폴 리 프로필 렌 클러스터 관에 전송.</li>
	<li>자동된 셀 카운터 또는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수는 10 μ 샘플을 가져가 라. 각 클러스터 튜브에서 샘플 당 106 셀 x 1.5-2 셀 카운트 정상화: 제거 하 고 2 x 106 셀 이상 초과 셀의 볼륨을 삭제.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 셀 원심 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기와 멀티 채널 피 펫 1 X barcoding 페름 버퍼의 1 mL에 셀 resuspend 상쾌한에서 발음.</li>
	<li>정렬 순서에 있는 선반에 클러스터 튜브 샘플의 바코드와 일치 하도록 바코드 키에 표시 된 대로. 피 펫 팁 (아무 혼합) 셀 손실을 줄이기 위해 셀 펠 릿을 건드리지 않고 멀티 채널 피 펫에 의해 클러스터 튜브에서 모든 샘플 바코드 페름 버퍼 X 800 μ 1을 추가 합니다. 랙 클러스터 튜브와 함께 따로 설정 합니다.</li>
	<li>-20 ° C와 실 온에서 해 동에서 20-플렉스 Pd Barcoding 키트 튜브 스트립을 제거 합니다. 1 X barcoding 페름 버퍼의 100 μ를 추가 하 고, 철저 하 게 혼합 클러스터 튜브에 해당 셀 샘플으로 resuspended 바코드 믹스의 120 μ를 전송.</li>
	<li>개별적으로 바코드 샘플 사이의 교차 오염 없이 되도록 멀티 채널 피 펫에 의해 철저 하 게 혼합. 셀 라벨 바코드 수 있도록 실 온에서 30 분 동안 클러스터 튜브를 품 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 원심. 상쾌한, 발음 다음 CSM의 1 mL에 resuspend.</li>
	<li>원심 및 단계 3.8에서 다시 업체인 CSM에 resuspend. 참고: 각 샘플은 이제 고유 바코드 표시 및 샘플 풀링 될 준비가.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 단일 피 펫과 같은 팁을 사용 하 여, 전송 ~ 70-80에서 모든 셀 펠 릿 한 폴리스 티 렌 튜브에 μ 잔여 볼륨. 피 펫 팁;을 추출 하지 마십시오 단일 피 펫이 팁을 따로 설정 합니다.</li>
	<li>멀티 채널 피 펫과 새로운 팁, 셀 복구를 최대화 하기 위해 각 원래 클러스터 튜브를 ~ 100 μ CSM을 추가 합니다. 팁을 따로 설정 된 단일 피펫으로 ~ 100 μ 잔여 볼륨에서 모든 셀 쥐 똥 같은 폴리스 티 렌 튜브에 전송할.</li>
	<li>폴리스 티 렌 튜브 (~ 3 mL)을 가기에 CSM를 추가 합니다. 수와 기록 풀링된 바코드의 셀 번호 설정합니다. 실 온에서 5 분 동안 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 같은 날에 바코드 샘플을 얼룩이 지기를 진행 합니다. 참고: ~ 20-30% 셀 손실 barcoding 프로세스에서 기대 하는 정상입니다.</li>
</ol>4. 바코드의 얼룩 Lysed/혈액 세포와 분석에 대 한 준비에 고정 대량 Cytometry 악기
참고: 각 1 X titer의 항 체 얼룩이 지기 (100 당 항 체의 1 μ μ 반응 얼룩), 일반적으로 3-4 x 106 세포를 얼룩이 질 수 있다. 따라서, 모든 바코드 샘플 1 개의 관으로 풀링되지 때 항 체의 양은 조절 해야 합니다. 30 x 106 셀, 고 각 1 X titer 20 바코드 샘플 금액 3-4x 106 세포를 얼룩이 질 수 있다, 바코드 샘플만 필요 합니다는 10 X titer를, 각 샘플을 개별적으로 얼룩이 반대로 요구 하는 것의 항 체 (1 X 20 X 금액 개별 튜브)입니다. 휴대폰 번호에 항 체의 농도 각 개별 항 체 칵테일 (여기 설명)에 대 한 신중 하 게 적정 수 한다.
<ol><li>표면 얼룩 및 cytokine 유도 대 한 항 체 (테이블의 재료)를 사용 하 여 셀을 얼룩.<ol>
<li>확인 표면 얼룩 칵테일 추가 및 회계 pipetting 오류 수 금액을 계산 하 여 (즉, 각 샘플에 2 x 106 셀의 20 바코드 샘플 얼룩 titer 얼룩 X 10이 필요, 최종 볼륨 계산 보완할 pipetting 오류에 대 한 최종 솔루션 얼룩 10.5 X를 만들기).</li>
		<li>추가 표면 얼룩 볼륨 바코드 셀 펠 릿을의 가치가 10 배. 같은 팁과 세포 손실을 줄이기 위해 혼합 하 고 표면 얼룩과 셀 펠 릿의 볼륨을 측정 합니다.</li>
		<li>셀과 칵테일 얼룩의 볼륨에 따라 달라 집니다, 셀 샘플 (즉, 20 샘플, 20 = 1 mL X 50 μ의 집합을 실행 하는 경우) 수 당 50 μ의 최종 착 볼륨에 CSM를 추가 합니다. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 얼룩도 홍보 샘플 매 15 분 교 반 하십시오.</li>
		<li>표면 얼룩 인큐베이션 기간 동안 파 마/워시 버퍼 (자료 테이블)에 의해 준비 diluting 1:10 필터링된 ddH2수술 준비 및 볼륨을 permeabilization, 2 mL에 5 mL. 4 ° C에 또는 얼음에 계속.</li>
		<li>얼룩이 CSM, 튜브 표면에서 탑 그리고 5 분에 4 ° C에서 600 x g에서 원심 분리기는 상쾌한 발음. 4 ° C, 1시 10분의 2 mL에 바코드 샘플 resuspend 희석 파 마/워시 버퍼. 20-30 분 완전 세포를 permeabilize 4 ° C에서 품 어.</li>
		<li>5 분 동안 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
		<li>세포내 얼룩 비슷한 얼룩 단계 (표면 얼룩) 따릅니다. 그러나, 4 ° C, 1시 10분을 사용 하 여 셀에 얼룩이 지는 세포내에 걸쳐 permeabilizing 환경에서 계속 볼륨 얼룩 총 수 있도록 CSM 대신 희석 파 마/워시 버퍼.</li>
		<li>세포내 항 체 칵테일 표면에 얼룩이 지 고 셀 펠 릿 (단계 4.1.2–4.1.17) permeabilized를 추가 합니다. 볼륨 셀 샘플 수 당 50 μ를 얼룩이 지는 총을 가져와. 4 ° c.에 60 분 동안 품 어 얼룩도 되도록 샘플 매 15 분 교 반 하십시오.</li>
		<li>세포내 얼룩 동안 준비 intercalator 솔루션: 필터링 된 PBS + 필터링 된 16%의 100 μ의 900 μ PFA (1.6%의 최종 농도 PFA) + 0.2 μ uM intercalator 염료 (자료 테이블)의 500의.</li>
		<li>파 마/워시 버퍼 셀 펠 릿 + 세포내 항 체 칵테일 찬 1:10에서 최고.</li>
		<li>5 분, 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. CSM와 얼룩 튜브 떨어져 가기. 계산 하 고 휴대폰 번호를 기록 합니다. 5 분, 4 ° C에서 600 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음. 단계 4.9에서에서 intercalator 솔루션의 1 mL에 셀 resuspend 완전 윤에 대 한 실 온에서 20 분 이상 incubate 또는 (샘플 intercalator 솔루션에 머물 수 있습니다 4 ° C에서 질량 cytometry 악기에 그들을 실행 하기 전에 최대 1 주) 4 ° C에서 하룻밤.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대량 cytometry 악기에 대 한 셀을 준비 합니다.<ol>
<li>필터링 된 ddH2O 3 mL와 4 ° c.에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기 튜브 끝 잠재적으로 대량 cytometry 악기를 방해할 수 있는 집계 또는 어떤 파편 든 지 제거를 100 μ m 필터를 통해 필터링 된 ddH2O. 전달의 3 mL에 셀이이 정지를 resuspend.</li>
		<li>계산 하 고 셀 번호 후 여과 기록 합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 600 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:10 필터링된 ddH2o.에에서 그것을 diluting 하 여 교정 비드 솔루션 (테이블의 자료) 준비</li>
	<li>Resuspend는 스테인드 셀 1시 10분의 필요한 볼륨에 희석 교정 비드 솔루션 1 ~6 셀/10ml x의 세포 농도 달성 하기 위해. 참고: 45 µ L/분에 CyTOF1에 대 한 권장된 최적은 5 x 105 셀/mL; 헬 리오스에서 30 µ L/분, 7.5 105 셀/mL x에 대 한.</li>
	<li>대량 cytometry 악기9에 샘플을 실행 하려면 이동 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 소설, 단일 셀, proteomic 접근 방식은 동시에 여러 면역 세포 유형을 평가 하 고 환자 특정 "병원 성" 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하 여 설명 합니다. 이 방법은 분석 차량과 면역 세포 phenotypic와 기능 이상의 평가 위한 도구로 대량 cytometry로 주변 전 혈을 사용합니다. 메서드는 인간과 쥐 연구21, 쉽게 적용 하 고 다른 면역 기능 분석, 감지 신호 이상14등와 호환 되.
사용자는이 절차의 성공에 영향을 미칠 수 있는 변수의 수의 인식 해야 합니다. 우리의 경험을 바탕으로, 혈액 샘플을 피하기 위해 초기 유도 세포 cytokines (데이터 표시 되지 않음)의 컬렉션의 2 시간 이내 처리 한다. 혈액 샘플 있어야 실내 온도 (25 ° C)에서 대기 하는 동안 처리 합니다. 혈액 샘플을 수집 수 중 나트륨...

자가 면역 질환의 병 적 상태와 사망률 3-8%의 인구에 영향을 미치는 주요 원인입니다. 미국에서는, 자가 면역 질환에서는 젊은이 중 년 여성 사이에서 죽음의 주요 원인 중 (세 < 65 세)1,2. 자가 면역 질환 임상 유형이 다른 프레 젠 테이 션 및 다양 한 기본 면역 프로세스 특징입니다. 이 성분의 스펙트럼은 류 마티스 관절염 (RA) 공동 참여 및 다 발성 경화 증 (MS)에 신경 질환 등 다른 질환에서 잘 표현 된다. 그러나,이의이 수준은 또한 반성 루 푸 스 (SLE) 등 단일 장애 내 궁 행: 다른 혈액 또는 공동 참여3에서 고통을 하는 동안 일부 환자 신장 병 리, 현재 수 있습니다.
자가 면역 질환에 기본 immunopathogenesis 자동 및 하이퍼-활성화의 여러 하위 집합 타고 난 및 적응형 면역 세포, 및 부수적인 dysregulated cytokine 생산을 포함 하는 임상이 거울. Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을, 하는 동안 질병의 기계 장치에 그들의 특정 역할을 이해 했다 입증 도전. Cytokines는 pleiotropy 특징 이다 (한 cytokine 다른 세포 유형에 여러 효과 가질 수 있습니다), 중복 (여러 cytokines 동일한 효과 가질 수 있습니다), 이중성 (한 cytokine 다른 조건 하에서 프로 또는 안티 inflammatory 효과 가질 수 있습니다), 고 소성 (cytokines에서 그것의 "원래", 환경에 따라 서로 다른 역할에 주조 될 수 있다)4,,56. 따라서, 인구 수준 방법 다른 유형의 세포 응답 같은 "사이토카인 환경"을 구분할 수 없습니다. 마찬가지로, 연구 설계는 단일 셀 형식 (cytokine), 면역 체계의 특정 한 측면에 집중 하는 복잡 한 면역 질환에 관련 된 모든 요소에 대 한 글로벌 평가가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다.
최근에, 우리는 동시에 여러 개의 면역 세포 유형, 평가 하 고 환자 특정 "병원 성" 주변 혈액 플라스마 순환 요인의 주위에 그들의 다양 한 cytokine 물결을 감지 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 개발. 여기에 설명 된 워크플로 고립 된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 반대로 그대로 주변 전체 혈액 샘플의 사용에 의해 특징입니다. 주변 기기 전체 혈액 나타냅니다 조직의 면역 중재 질환, 자가 면역 질환 (즉, 중 성구, 혈소판), 및 2) 플라즈마 1) 비-단 혈 자주 참여를 포함 하 여 공부를 가장 순수 관련 차량을 면역 활성화 역할 있다 핵 산, 면역성이 있는 복합물, 및 cytokines, 등의 요소를 순환. 캡처하는 "본질적인 병원 성" dysregulated cytokine 생산, 주변 혈액 샘플 그리고 37의 ° C (생리 적 체온) 단백질 수송에서 외피의 6 h 혈액 무승부 (T0, 시간 제로), 후 즉시 처리 됩니다 cytokine 생산 (축적, T6 T0) "내장" 질병 상태 (그림 1)을 나타내는 것을 검출 하기 위하여 어떤 exogenous 자극 조건 (T6, 시간 6 h), 없을 경우에 억제 물. Dysregulated 프로세스에 반영 하는 신호 경로, 질병에 관련 된 면역 반응에 관련 된 주변 혈액 샘플은 아래의 활성화를 공부 하는 외 인으로 (단백질 수송 억제제와 37 ℃에서 6 h 외피) 치료 cytokine 생산 핵 산에 대 한 응답을 나타내는 것을 감지 하 질병 병 인, SLE (T6 + R848, 1 µ g/mL R848와 h 시간 6)의 경우 수신자 같은 수용 체 (TLR) 촉진제 등을 반영 하는 조건 자극 (T6 대 T6 T0 대 비교 + R848, 그림 1)입니다. 공부 하 고 사용할 수 있는 치료제 비보 전,의 immunomodulatory 효과 특정 환자에 대 한 정확한 면역 dysregulated 프로세스에 관련 된으로, 말 초 혈액 샘플은 JAK 억제제에는 관련 치료와 함께 처리 됩니다. 농도 (여기, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, 시간 6 h 5 uM ruxolitinib), 약물 (T6 대 T6 T0 대 + 5R, 그림 1)에 대 한 응답에서 "내장" 질병 상태에서 변화를 감지 하. JAK 억제제 JAK 저 해제 라스 같은 자가 면역 질환의 치료에 성공 하려면 표시 되었습니다 때문에이 연구에 대 한 선정
동시에 여러 면역 세포의 하위 집합, SLE에서 주변 혈액 샘플에서에서 설명한 dysregulated 프로세스를 평가 하기 위해 환자와 건강 한 컨트롤 위에서 설명한 대로 되었고 대량 cytometry 분석. 대량 cytometry, 일컬어 Cytometry 시간-의-비행, 스펙트럼의 문제7,,89오버랩 없이 단일 세포 분석의 40 개 이상의 매개 변수를 제공 합니다. 이 기술은 항 체, 대신 fluorophores10에 바인딩된 태그로 녹는 금속 이온의 형태에서 희토류 금속 동위 원소를 활용 합니다. 전화 외 에 맥 카시 외. (즉, 튜닝 및 교정, 샘플 수집) 대량 cytometry 기술 플랫폼에 관한 추가 정보를 찾을 수 있습니다. 11 , 12 대량 cytometry의 높은 차원 단일 셀 세분성 (자료 테이블) 타고 난 및 적응형 면역 세포 하위 집합에 걸쳐 여러 cytokines의 동시 측정을 수 있습니다.
현재 기존의 임상 및 실험실 매개 변수는 종종 나 지속적인 질병 활동 또는 특정 immunomodulators13, 더 나은 기본 면역 윤곽을 그리 다 하는 필요를 반영에 대 한 응답을 탐지 하기 위한 구체적 플레어 드라이브를 변경 합니다. 항 체 또는 작은 분자 억제제 cytokines를 대상으로 또는 단백질 cytokine 생산의 규칙에 관련 된 신호를 사용 하는 치료 접근의 과다는 면역 질환에서 cytokine dysregulation의 보급을 감안할 때, 최근 나왔다. 기본 형식, 여기에 설명 된 주변 혈액 분석 접근 환자 전용 dysregulated 셀 하위 집합 및 그들의 비정상적인 cytokine 생산 조직 발현과 자가 면역 질환에 식별 하기 위해 플랫폼을 제공 합니다. 이 방법을 특정 dysregulated cytokines를 확인할 수 있습니다, 그리고 구체적인 치료 옵션 수 테스트 ex vivo immunomodulate에 그들의 능력을 평가 하기 위해 환자 특정 질병 치료 선택의 개인 설정에 대 한 허용 프로세스입니다.

<table><tbody><tr><td>Ruxolitinib</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-364729A</td><td>증권 계수 : 10 mM; 최종 콘크: 5 &mu; M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>주식 가격: 1 &mu; 지/&무; L; 최종 콘크: 1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>주식 계수: 1 &mu; 지/&무; L; 최종 콘셉트: 0.1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>멸균 PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix Buffer</td><td>BD biosciences</td><td>558049</td><td>재고 계약: 5X; 최종 Conc : 1X (ddH2O에 희석)</td></tr> <tr><td>BD Phosflow perm / wash buffer I</td><td>BD biosciences</td><td>557885</td><td>Stock Conc : 10X; 최종 농도 : 1:10 (ddH2O에 희석)</td></tr> <tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>아지드 나트륨 (NaN3)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>S-8032</td><td>주식 농도 : >99.9 %; 최종 계약: 0.0002</td></tr><tr><td>단백질 수송 억제제(PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>재고 계약: 500X; 최종 Conc: 1X</td></tr><tr><td>DNA 인터컬레이터</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>주식 Conc: 500 &mu; M; 최종 콘셉트: 0.1 &mu; M</td></tr><tr><td>세포 염색 매체 (CSM)</td><td></td><td></td> <td>PBS + 0.5 % BSA, 0.02 % NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar 바코드 파마 버퍼</td><td>Fluidigm</td><td>201057</td><td>재고 Conc : 10X; 최종 계약: 1X</td></tr><tr><td>20-plex Pd 바코드 세트</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>재고 계약: 해당 사항 없음; 최종 Conc: 해당 없음</td></tr><tr><td>EQ TM 4요소 교정 비드</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>재고 Conc: 10X; 최종 농도 :</td></tr><tr><td>1X 16 % MeOH가없는 포름 알데히드 용액</td><td>Thermo</td><td>28908</td><td>주식 농도 : 16 % (w / v); 최종 Conc : 1.6 % (w / v)</td></tr> <tr><td>멸균 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>재고 Conc : n / a; 최종 Conc: 해당 사항 없음</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 클러스터 튜브</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>재고 계약: 해당 없음; 최종 Conc: n/a</td></tr><tr><td>Helios CyTOF 기기</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>CyTOF 분석에 사용되는 모든 용액에는 금속 오염이 없어야 합니다. ddH2O는 모든 용액의 준비에 사용되며 저항률은 18.0M&Omega 이상이어야 합니다. ddH2O 및 자체 준비된 용액은 한 번도 고압멸균된 적이 없는 새 플라스틱 또는 유리병에 보관해야 합니다.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mass Cytometry에 사용되는 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>표면 마커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>질량: 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>질량: 144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>질량: 174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>질량: 149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>질량: 142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>질량: 209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>질량: 152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>질량: 115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>질량: 154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>질량: 165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>질량: 163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>질량: 141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>질량: 155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>질량: 172</td></tr><tr><td>CD45 총</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>질량: 89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>질량: 153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>질량: 168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>질량: 113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>질량: 150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>질량: 143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>질량: 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>질량: 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>질량: 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>질량: 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>질량: 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>질량: 167</td></tr><tr><td>Cytokines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&알파;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>질량 : 147</td></tr><tr><td>IL-1 &beta;</td><td>바이오레전드&nbsp;</td><td>H1B-98</td><td>질량: 169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>산타크루즈&nbsp;</td><td>AS17</td><td>질량: 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>질량: 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>질량: 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>C8.6</td><td>질량: 171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>BL168</td><td>질량: 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>질량: 176</td></tr><tr><td>MIP1&beta;</td><td>BD</td><td>D21-1351</td><td>질량: 158</td></tr><tr><td>MCP1</td><td>BD</td><td>5D3-F7</td><td>질량: 170</td></tr><tr><td>IFN&alpha;</td><td>밀테니&nbsp;</td><td>LT27 : 295</td><td>질량 : 175</td></tr><tr><td>IFN &gamma;</td><td>바이오레전드</td><td>4S. B3</td><td>질량: 165</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>BD</td><td>A2B1</td><td>질량: 159</td></tr><tr><td>TNF&알파;</td><td>Biolegend</td><td>Mab11</td><td>질량: 166</td></tr><tr><td>Note: 제조업체가 Fluidigm으로 명시된 경우 이 항체는 금속이 사전 접합된 Fluidigm에서 구입했습니다. 제조업체가 Fluidigm 이외의 것으로 명시되어 있는 경우, 이 항체는 MaxPar Multi-Metal Labeling을 사용하여 자가 접합되었습니다. 제조업체 프로토콜에 따른 키트(Fluidigm Cat: 201300)입니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunophenotype 및 cytokine 생산 대량 cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines은 면역 질환의 병 인에서 중추적인 역할을 한다. 따라서, cytokine 레벨의 측정 self-tolerance 및 후속 면역의 붕괴에 지도 하는 정확한 메커니즘을 이해 하기 위해에서 여러 연구의 초점 되었습니다. 접근은 지금까지 단일 또는 몇 종류 (cytokines), 면역 체계의 특정 한 측면의 연구에 기초를 둔 하 고 복잡 한 자기 면역 질병의 세계적인 평가 제공 하지 않습니다. 환자 세라 기반 연구 자가 면역에 중요 한 통찰력 여유, 하는 동안 그들은 감지 dysregulated cytokines의 특정 세포 소스를 제공 하지 않습니다. Cytokine 생산 요인, 순환 하는 "본질적인" 환자 전용 플라즈마의 컨텍스트 내에서 여러 면역 세포 하위 집합에서 평가 하는 포괄적인 단일 셀 접근 방식은 여기에 설명 되어 있습니다. 이 방법은 환자 특정 면역 표현 형 (표면 마커)의 모니터링 가능 및 기능 (cytokines), 그것의 기본에서 "본질적인 병원 성" 질병 상태, 또는 치료제에비보 ( ex vivo)의 존재에.

그림 1 자극에 대 한 워크플로 보여 줍니다 및 혈액 샘플 aliquots의 할당을 포함 한 주변 혈액 샘플의 처리 자극 에이전트, 단백질의 추가의 타이밍 수송 억제 물 칵테일, 그리고 보육 적혈구 (RBC) 세포 및 고정까지 시간. 자극 제의 선택은 평가 대상 신호 및 cytokine 경로에 따라 달라 집니다. 예를 들어 여기에 설명 된 프로토콜 TLR 촉진제 여러 셀 종류에서 타고 난 면역 감지 메커니즘을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 대표 extracellular (LPS, TLR4 길 항 제) 및 (R848, TLR7/8 주 작동 근) endoplasmic agonists 선정 됐다. 다른 자극 에이전트 Phorbol Myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 등 Ionomycin (PMAIONO), T 세포 활성 제 역할을 할 수 있는. 특정 cytokines 또한으로 사용 될 수 있습니다 자극 하는 ...

여기 우리 면역 phenotypic와 기능 (세포내 cytokine 유도)를 평가 하는 단일 셀 proteomic 접근 방식을 설명 주변 전체 혈액 샘플, 대량 cytometry 통해 분석으로 변경.

Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

이 방법은 자가면역 질환 환경에서 주요 사이토카인 생성과 같은 세포 주파수 이상 및 기능 차이를 식별하는 것과 같은 자가면역 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 쉽게 얻을 수 있는 말초 혈액 샘플에서 광범위한 레퍼토리 또는 다양한 세포 유형 및 기능 차이를 캡처할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 프로세스를 처음 접하는 개인은 혈액 처리 단계의 타이밍을 올바르게 잡고, 항체 패널 설계, 바코드 프로세스 자체를 파악하고, 고차원 단일 세포 데이터를 분석하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.이 시스템 면역학 접근법은 면역 조절 장애가 말초 혈액에 만연하고 명백한 SLE와 같은 자가면역 질환에 특히 적합합니다. 이 방법의 시각적 시연은 단계의 타이밍을 명확히 하고 질량 세포 분석 전에 여러 샘플을 바코드로 지정하고 풀링할 수 있는 방법을 보여주는 데 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 전혈 처리를 위한 5가지 조건의 라벨이 부착된 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브를 랙에 놓습니다.다음으로, 각 튜브에 섭씨 37도 RPMI 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 각 튜브에 전혈 1ml를 넣고 RPMI와 완전히 혼합되도록 위아래로 여러 번 피펫을 넣습니다. 그런 다음 T six plus five R이라고 표시된 튜브에 미리 희석된 룩소리티닙 10마이크로리터를 넣고 완전히 혼합합니다.튜브 랙을 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓고 배양 타이밍을 시작합니다. T zero 샘플을 처리하려면 T zero 튜브의 전체 내용물을 작업 농도에서 섭씨 37도 용해/고정 버퍼 20ml가 들어 있는 라벨링된 원뿔형 튜브에 피펫팅합니다. 세포 회수를 최적화하려면 용해/고정 완충액으로 튜브를 헹구고 원뿔형 튜브를 뒤집어 혼합합니다.세포를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 용해와 고정을 허용합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 500배 G로 세포를 원심분리합니다. 그 후, 상등액을 디캔팅하고 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 세포를 다시 현탁시켜 펠릿을 분해합니다.그런 다음 PBS로 원뿔형 튜브를 15ml 용량으로 채웁니다. 그 후, 실온에서 5분 동안 500배 G로 세포를 원심분리합니다. 펠릿을 분해하기 위해 1ml의 CSM에 세포를 다시 현탁시킵니다.그런 다음 항체 염색을 위해 시료를 표지된 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 10마이크로리터 샘플로 세포를 계수합니다. 다음으로, 실온에서 5분 동안 500배 G로 세포를 원심분리합니다.그 후, 상등액을 흡인하여 펠릿을 약 60 마이크로 리터의 잔류 물로 남겨 둡니다. 다른 조건의 샘플이 처리를 완료할 때까지 이 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. T가 30분과 같으면 튜브 랙을 조직 배양 후드로 옮깁니다.T six plus R848 튜브에 마이크로리터당 0.1g의 R10 마이크로리터를 추가하고 완전히 혼합합니다. 그런 다음 T six plus LPS 튜브에 마이크로리터당 0.01마이크로그램의 LPS 10마이크로리터를 추가하고 철저히 혼합합니다. 그 후, T 6, T six plus five R, T six plus LPS라고 표시된 튜브에 4마이크로리터의 단백질 수송 억제제를 추가하고 T가 6시간이 될 때까지 샘플을 인큐베이터에 다시 넣습니다.2시간마다 P1000 피펫으로 샘플을 철저히 혼합합니다. T가 2시간과 같을 때 T six plus R848 튜브에 4마이크로리터의 단백질 수송 억제제 칵테일을 추가합니다. 모든 샘플을 혼합하고 T가 6시간이 될 때까지 랙을 인큐베이터에 다시 넣습니다.T가 4시간과 같을 때 샘플을 P1000 파이펫과 한 번 더 혼합합니다. T가 6시간과 같을 때, T 0 샘플에 대해 설명한 대로 T 6, T 6 플러스 LPS, T 6 플러스 R848 및 T 6 플러스 5 R 혈액 샘플 튜브를 처리합니다. 그런 다음 펠릿을 섭씨 영하 80도의 잔류 CSM 부피에 보관하여 나중에 처리합니다.용해되고 고정된 세포를 바코드로 만들려면 섭씨 영하 80도의 얼음 위에서 천천히 보관된 샘플을 해동합니다. PBS가 포함된 10X 바코드 펌 버퍼를 1-10으로 희석하고 샘플당 3밀리리터에 충분한 버퍼를 만듭니다. 비멸균 트러프 하나는 CSM으로, 다른 하나는 X 바코드 펌 버퍼로 채웁니다.그런 다음 갓 해동한 샘플에 얼음처럼 차가운 CSM 1ml를 넣고 완전히 혼합한 다음 사전 라벨링된 각각의 폴리프로필렌 클러스터 튜브로 옮깁니다. 이제 10마이크로리터 샘플을 채취하여 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 각 클러스터 튜브의 세포 수를 초과 세포의 부피를 제거하여 정규화합니다.그런 다음 실온에서 5분 동안 600배 G로 세포를 원심분리합니다. 멀티채널 피펫과 원심분리기를 사용하여 1mL의 X 바코드 펌 버퍼에 있는 세포를 실온에서 5분 동안 600배 G로 재현탁합니다. 그 후, 상층액을 흡입하십시오.바코드 키에 표시된 것과 동일한 순서로 클러스터 튜브를 랙에 정렬하여 샘플이 바코드와 일치하도록 합니다. 세포 펠릿을 건드리지 않고 클러스터 튜브의 모든 샘플에 멀티채널 피펫으로 800마이크로리터의 X 바코드 펌 버퍼를 추가하여 세포 손실을 줄입니다. 그런 다음 클러스터 튜브가 있는 랙을 따로 보관하십시오.영하 20도에서 20-plex 팔라듐 바코드 키트 튜브 스트립을 제거하고 실온에서 해동합니다. 100마이크로리터의 X 바코드 펌 버퍼 1개를 추가하고, 철저히 혼합한 다음, 다시 부유된 바코드 혼합물 120마이크로리터를 클러스터 튜브의 해당 세포 샘플로 옮깁니다. 멀티채널 피펫으로 철저히 혼합하여 개별적으로 바코드화된 시료 사이에 교차 오염이 발생하지 않도록 합니다.클러스터 튜브를 실온에서 30분 동안 배양하여 바코드가 세포에 라벨을 붙일 수 있도록 합니다. 30분 후, 실온에서 5분 동안 600배 G로 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 흡입한 다음 CSM 1ml에 다시 현탁합니다.그런 다음 CSM에서 다시 원심분리기 및 일시 중단합니다. 그 후, 실온에서 600배 G로 5분간 원심분리한 후 상층액을 흡인한다. 단일 피펫과 동일한 팁을 사용하여 약 70-80마이크로리터의 잔류 부피에 있는 모든 세포 펠릿을 하나의 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.피펫 팁을 꺼내지 마십시오. 이 팁으로 단일 피펫을 따로 보관하십시오. 멀티채널 피펫과 새로운 팁을 사용하여 각 기존 클러스터 튜브에 100마이크로리터의 CSM을 추가하여 세포 회수를 극대화할 수 있습니다.따로 보관된 팁이 있는 단일 피펫을 사용하여 잔류 부피 100마이크로리터의 모든 세포 펠릿을 동일한 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. CSM을 추가하여 폴리스티렌 튜브를 약 3밀리리터로 마무리합니다. 풀링된 바코드 세트의 셀 번호를 세고 기록합니다.그런 다음 실온에서 600배 G로 5분간 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 같은 날에 바코드가 부착된 샘플의 염색을 진행합니다. 이 회로도는 혈액 샘플 분취액 할당, 자극제 추가 시기, 단백질 수송 억제제 칵테일, 적혈구 용해 및 고정까지의 배양 시간을 포함하여 말초 혈액 샘플의 자극 및 처리를 위한 워크플로를 보여줍니다.자극제의 선택은 평가 대상이 되는 신호 전달 및 사이토카인 경로에 따라 달라집니다. 고정 및 적혈구 용해 후, 건강한 기증자로부터 개별적으로 용해되고 고정된 세포 샘플을 바코드로 찍고, 표면 마커에 대해 26개의 항체로 라벨링하고, 투과화하고, 사이토카인에 대해 14개의 항체로 염색했습니다. CD14 높은 단핵구의 식별을 나타내는 제한된 게이팅 전략이 여기에 나와 있습니다.왼쪽에서 오른쪽으로 표시되는 각 2D 플롯은 2D 플롯에서 바로 왼쪽에 있는 게이트 된 상위 인구의 모집단 하위 집합입니다. 8개의 면역 세포 subset을 대표하는 CD14 high monocytes를 사용하여 TLR agonist LPS 및 R848 및 T 세포 활성화 인자 PMA ionomycin을 사용한 자극 후 0 시간에 건강한 기증자의 말초 혈액 샘플에 대해 대량 세포 분석 분석을 수행했습니다. CD14 고단핵구에서 사이토카인 유도의 예를 나타내고, 사용된 자극제에 특이성을 가진 선택된 사이토카인을 나타내고 있다.R848은 CD14 고단핵구에서 IL-12p40 subunit 및 MCP1을 선택적으로 유도하는 반면 LPS는 유도하지 않습니다. 대조적으로, PMA ionomycin은 CD14 높은 단핵구에서 사이토카인을 유도하지 않습니다. 일단 숙달되면 혈액 자극은 약 7시간 안에 완료할 수 있으며 바코드 단계는 약 1시간 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때는 단계의 타이밍을 염두에 두고 그에 따라 미리 계획을 세우는 것이 중요합니다. 이 절차를 시행한 후에는 자신의 연구 목적에 맞는 면역 세포 반응을 평가하기 위해 질량 세포 분석 패널에서 혈액 자극 조건을 변경하는 것을 고려할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 전혈 샘플에서 사이토카인 반응을 유도하는 방법과 질량 세포 분석을 위해 여러 샘플을 바코드 세트로 풀링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

single-cell-analysis-immunophenotype-cytokine-production-peripheral

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

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