암세포의 복제 스트레스를 정량화하기 위한 면역형광 기반 방법

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DNA에 통합된 티미딘 뉴클레오티드의 합성 대체물인 IdU를 운반하는 암세포부터 시작합니다. 이 세포가 복제 스트레스에 직면하면 DNA 합성이 중단되어 노출된 단일 가닥 DNA 영역 내에서 IdU가 드러납니다.

세포를 고정하고 세제 분자를 첨가하여 세포막을 투과성 있게 만듭니다.

BSA를 첨가하여 비표적 항체 결합 부위를 차단합니다.

IdU 표지 단일 가닥 DNA와 상호 작용하는 항-IdU 항체를 도입합니다.

항-IdU 항체를 표적으로 하는 녹색 형광단 표지 2차 항체를 추가합니다. 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

핵을 염색하는 형광 염료가 포함된 설치 매체가 들어 있는 슬라이드에 커버슬립을 놓습니다.

형광 현미경으로 파란색 핵을 관찰합니다.

녹색 형광 초점은 단일 가닥 DNA에 결합하는 항체를 나타냅니다.

복제 스트레스 수준을 정량화하기 위해 초점의 수를 계산합니다.

24웰 플레이트의 웰에 놓인 폴리-L-라이신 커버슬립에 1밀리리터의 세포 현탁액을 첨가하고 표준 조건에서 배양 배지에서 세포를 성장시킵니다. 한 번의 집단 배가 된 후, 플레이트에서 기존 배지를 흡인하고 두 번의 후속 집단 배가를 위해 10마이크로몰 IdU로 세포를 펄스합니다.

세포를 수확하려면 배지를 얼음 위에 얼음처럼 차가운 0.5% PBSTx로 5분 동안 교체합니다. 세포 고정을 위해 PBSTx를 흡인하고 실온에서 3% 파라포름알데히드와 함께 세포를 15분 동안 배양합니다. PBS로 3-4회 세척한 후, 고정 세포를 추가로 사용할 때까지 섭씨 4도에 유지합니다.

고정 후, 얼음 위에 0.5% PBSTx를 사용하여 세포를 5분 동안 투과화하여 전체 커버슬립을 덮도록 합니다. 실온에서 0.2% PBST 1 밀리리터로 세포를 3 내지 4회 세척한 후, PBST를 흡인하고, PBS로 만든 5% BSA를 사용하여 실온에서 30분 동안 시료를 차단한다.

면역염색을 위해 바닥이 평평한 타파웨어에 젖은 종이 타월을 올려 가습 챔버를 준비합니다. 24웰 플레이트 뚜껑을 파라필름으로 덮습니다. 가습실에 넣고 접시 뚜껑에 커버슬립을 놓습니다. 커버슬립 상단에 희석된 항-BrdU 1차 마우스 항체 60마이크로리터를 추가합니다.

또는 항체의 건조를 줄이고 부피를 줄이려면 희석된 항체 한 방울을 파라필름에 놓고 커버슬립을 그 위에 뒤집습니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 1차 항체를 흡인합니다.

커버슬립을 24웰 플레이트로 되돌리고 0.2% PBST로 4회 세척합니다. 앞서 설명한 것처럼 커버슬립에 희석된 2차 항체를 첨가하고 실온에서 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 현미경 슬라이드에 라벨을 붙이고 DAPI 마운팅 매체로 슬라이드에 커버슬립을 장착합니다. 마운팅 매체를 경화하거나 경화시켜야 하는 경우 슬라이드를 실온에서 24시간 동안 어두운 곳에 보관하십시오.

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Last updated: 4 July 2026