Name: 모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 모 세관 배열을 이용한 다중 핵산 시각 검출법으로 유전자 변형 생물체(GMO)를 신속하게 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 사용자 친화적인 카세트 제작과 효율적인 다중 검출을 가능하게 합니다.

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이 연구에서 새로운 세기 뛰어난 재능에 대 한 국가 자연 과학 재단의 중국 보조금 (31370813, 3147670, 31670831 및 31600672,), 국립 유전자 변형 식물 특별 기금 (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), 프로그램 부분에 투자 되었다 대학, 국가 주요 연구 및 개발 프로젝트 (2016YFA0500601) 중국과 중국 박사 후 과학 재단 (2016 M 591667).

참고: 베어링 원하는 마이크로 채널 및 로딩 어댑터에 대 한 셰이프 스테인리스 형 되었습니다 이미이 프로토콜 가정 (3D 파일 추가 파일 1로 제공 됩니다과 2. ). 이 프로토콜은 또한 그 식물 DNA 분리 이미 실시 되었습니다 가정 합니다.
 1. 모 세관 배열 기반 준비-사용 카세트의 제작 <ol><li>스테인리스 스틸 금형 청소.
	</li><li>잠재적인 오염 물질을 제거 하 세척 세제, 에탄올, 그리고 이온된 수 스테인리스 형 <ol>. 질소에 의해 금형을 건조.</ol></li>
	</ol> <li>모세 혈관 청소 <ol><li>착용 안전 고글, 실험실, 균일 하 고 화학 보호 장갑.</li>
		<li>비 커에 장소 모 세관입니다. 유기 물질을 제거 하 5 분 30 mL 아세톤으로 모세 혈관을 청소 하 고 다음 씻어 이온된 수와 모세 혈관. 
		주의: 증기 두건에서 아세톤 처리.</li>
		<li>는 H 2 O 2의 10 mL를 비이 커에 부 어 하 고 4와 H 2 O 2로 느린 과열을 방지 하기 위해 떨고 그래서 H 2의 30 mL를 추가 합니다. 솔루션 (피 솔루션) 완전히 적어도 30 분에 대 한 모세 혈관을 커버 있는지 확인 
		주의: 피 솔루션을 처리 하는 동안 조심 (H 2 이렇게 4/H 2 O 2 = 3: 1, v/v) . 피 솔루션을 유출 하는 경우 많은 양의 물으로 신속 하 게 솔루션을 씻어 하 고 닦아 종이 타 올으로 표면. 
		참고: 모 세관의 철저 한 청소 램프 반응의 성공을 위해 핵심 포인트 중 하나입니다. 그것은 모세에 거품을 제거 하는 청소 과정 동안 산 실린더를 흔들 필요가 그리고 깨끗 한 시간 필요할 때 확장할 수도 있습니다.</li>
		<li>피 솔루션 많은 양의 물으로 씻어. 에탄올과 5 분 이온된 수와 모세 혈관을 씻어. 건조 건조 오븐에서 모세 혈관.</li>
	</ol></li> <li>입니다 (PDMS)을 부 어 <ol><li>PDMS 기본 및 치료 시 약 50 mL 튜브에 1: 1의 비율으로 무게. 일반적으로, 혼합의 탄성 중합체 고무 경화제의 5 g에 기본 5 g.</li>
		<li>철저 하 게 유리 막대와 약 5 분을 위한 혼합물을 저 어. PDMS와 튜브 드 가스에 대 일 분 동안 진공 벨 항아리에 배치.</li>
		<li>스테인리스 스틸 금형의 실린더에는 PDMS를 천천히 부 어. 건조 오븐에서 60 ℃에서 3 h에 대 한 치료 PDMS 허용 참고: PDMS 붓는 때 공기 방울을 피하기 위해 조심. 붓는 PDMS 후 PDMS에서 거품의 자연적인 제거를 위한 5 분 동안 서 서 허용 그것.</li>
	</ol></li> <li>에서 PDMS 몰드를 제거 <ol><li>는 PDMS, 경화 후 제거 형 실린더와 금형 밖으로 당겨. 메스와 금형의 여백 절단 하 여 원통에서 PDMS를 제거.</li>
		<li>세척 PDMS 세 번와 에탄올 이온된 수. 질소 건조는 PDMS 지원.</li>
	</ol></li> <li>소수 수 PDMS 지원의 낮은 표면 처리. 담가 PDMS에 슈퍼 소수 지원 코트 1 s. 드라이 실 온에서 10 분.</li>
	<li><ol><li>PDMS 지원에 모 세관을 삽입 PDMS 지원 구멍에 청소 4mm 모세 혈관을 삽입 하 고 떠나 PDMS 지원의 위쪽 표면 밖에 모 세관의 0.5 m m. 모 세관의 끝은 동일한 수준에 있는지 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>은 모세 혈관의 외부 표면 및 소수 성 수 PDMS 지원의 위쪽 표면 치료.
	</li><li>추가 15 µ L 슈퍼 소수 코트는 PDMS의 위쪽 표면에 <ol>지원. 코팅 즉시 모 세관 힘에 의해 (를 포함 하 여 PDMS 지원의 위쪽 표면 및 모 세관의 노출된 부분의 외부 표면) 상단 표면 전체 스프레드.</ol></li>
		<li>공기 건조 슈퍼 소수 수정된 모 세관 배열.</li>
	 <li>모 세관 배열에 뇌관을 수정 <ol><li>뇌관 솔루션을 준비. 0.65 g 키토 산 밖으로 무게 (분자 공식: (C 6 H 11 아무 4) n) 4.5-5.5 1.3%의 키토 산 농도 달성 하기 위해 초 산으로 pH를 조정 하 여 50 mL 이온된 수로 그것을 해산 하 고. 표 1에 의하여 뇌관 구성 믹스를 준비 합니다. 프라이 머에 대 한 보충 표 1을 참조 하십시오</li> <li>집합이 미리 정의 된 순서에 따라 모 세관 배열의 한 해당 모 세관 채우기 위해 뇌관의 혼합물의 추가 1.6 µ L. 
		참고: 나머지 두 빈 모 세관 부정적인 컨트롤로 설정 했다.</li>
		<li>앵커에 표준 플랫 바닥 96 잘 접시의 투명 한 잘 배열 하 고 적어도 2 h. 60 ° C에서 배열 건조</li>
	</ol></li> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>램프 뇌관 믹스 구성 요소 (초기 농도) 고정</td> <td>볼륨 (μ) </td></tr> <tr><td>ddH 2 O</td> <td>17.0</td></tr> <tr><td>키토 산 (1.3%)</td> <td>1.0</td></tr> <tr><td>FIP/BIP 뇌관 (20 μ M)</td> <td>2.0/2.0</td></tr> <tr><td>LoopF/LoopB 뇌관 (20 μ M)</td> &lt; td &gt; 1.0/1.0</tr> <tr><td>f 3/B3 뇌관 (20 μ M)</td> <td>0.5/0.5</td></tr> <tr><td>총 볼륨</td> <td>25.0</td></tr></tbody></table> 표 1: 램프의 구성 요소 담합 시 약 뇌관. 램프 뇌관 고정 믹스의 구성 요소는 테이블의 왼쪽된 열에 나열 된 및 각 부품의 오른쪽 열에 나열 됩니다.
<ol start="9"> <li>조립 카세트 다음과 같습니다. 고정된 배열 위에 로드 어댑터를 넣어. 어댑터의 접시는 그냥 모든 10 모세 (참조 그림 1)의 노출된 부분을 다루고 있는지 확인 하십시오.</li>
</ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56597/56597fig1.jpg"> 그림 1: 카세트 제조 및 어셈블리. (한) 스테인레스 형과 PDMS를 지원합니다. 금형 3 부분으로 구성 됩니다: 실린더, 댐 보드, 그리고 기둥 판. (b) PDMS의 회로도 지원 제조 그리고 모 세관 카세트의 조립. 5 단계를 포함 하는 전체 과정: 1. PDMS 따르고, 2. 곰 팡이 제거, 3. 모 세관 삽입 및 표면 코팅, 4. 뇌관 및 5. 카세트 정박입니다. 1. 금형;의 실린더 내 PDMS 붓으십시오 2. 댐 보드 밖으로 밀어 PDMS 몰드를 제거 지원; 3. 코트 PDMS의 아래쪽 표면 지원과 다음 모세는 PDMS 삽입 지원, 마지막으로 하 게 PDMS 지원의 상부 표면 코트 하 고 모세 혈관을 노출. 두꺼운 파란색 선이 나타냅니다 슈퍼 소수 코트; 4. 로드 뇌관 개별 모세 혈관;로 설정 5. 앵커 단일 96 잘 접시에 모 세관 배열 및 그것에 어댑터를 로드 하는 예제를 설치 합니다. 세부는 프로토콜 단계 1.1-1.9에에서 설명 했습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56597/56597fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
 2. 모 세관 배열에서 램프의 성능 반응 <ol><li>준비 반응 혼합 <ol><li>T 수 2에 의하여 램프 반응 혼합 준비.</li>
		<li>선택한 순서 대로, 표 2, 그리고 소용돌이 반응 혼합물 5 혼합물에 추가 시 약 s calcein를 추가한 후. 부드럽게에버텍스 Bst 중 합 효소 후 20 번 튜브 추가 됩니다.</li>
	</ol></li></ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>램프 구성 요소 (초기 농도)</td> <td>볼륨 (μ)</td></tr> <tr><td>ddH 2 O</td> <td>11.6</td></tr> <tr><td>MgSO 4 (100mm)</td> <td>2.0</td></tr> <tr><td>dNTPs (25 mM)</td> <td>1.4 &lt; /t d &gt;</td></tr> <tr><td>Betaine (5m)</td> <td>4.0</td></tr> <tr><td>버퍼 (10 배)</td> <td>2.5</td></tr> <tr><td>Calcein (1.25 m m)</td> <td>0.5</td></tr> <tr><td>MnCl 2 (25 mM)</td> <td>0.5</td></tr> <tr><td>Bst &lt; /em &gt; 중 합 효소 (8 U/μ)</td> <td>1.5</td></tr> <tr><td>DNA를 식물 (10 ng/μ)</td> <td>1.0</td></tr> <tr><td>총 볼륨</td> <td>25.0</td></tr></tbody></table> 표 2: 모 세관 배열 램프의 반응 시스템. 모 세관 배열 램프 구성 요소 반응 시스템의 구성 요소 왼쪽된 열에 나열 되 고 각 구성의 오른쪽 열에 나열 됩니다.
<ol start="2"> 는 시 약을 로드 하 고 카세트 인감 <li><ol><li>피 펫 20 µ L 램프 반응 혼합물 표준 100 µ L 팁. 에 그것을 잠글 수 로드 어댑터의 끝을 삽입 합니다. 부드럽게 어댑터;의 접시에 반응 혼합물을 주사 반응 혼합물 것입니다 신속 하 게 요리를 모 세관 힘을 통해 자동으로 모 세관 로드.</li>
		<li>잠긴된 팁과 어댑터를 제거 하 고 PCR 호환 투명 봉인 영화도 잘 봉인. 
		참고: 친수성 접시에 반응 혼합물을 만지고 모세 혈관만 가득 수 있습니다. 그래서 같은 높이 (참조 그림 2)의 모든 모세 혈관의 상부는 다는 것을 확인.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56597/56597fig2.jpg"> 그림 2: 샘플 로딩 로딩 어댑터를 사용 하 여 다이어그램. 그림 예를 들어 블루 솔루션을 채용 하는 로드 프로세스를 보여 줍니다. 에 팁을 삽입 하 고 주입 샘플 어댑터 천천히, 잠긴된 팁과 어댑터를 제거 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56597/56597fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="3"> <li>품 1 h. 63 ° C에서 인큐베이터에서 모 세관 배열</li></ol>
 3. 결과 판독 및 데이터 분석 <ol><li>형광 방출의 이미지.
	<ol><li>가시 광선을 필터링 하는 작은 휴대용 UV LED 손전등의 위쪽 표면에 UV 필터를 수정.</li>
		<li>는 자외선 손전등과 형광을 방출 하는 해리 calcein를 자극 합니다. 디지털 카메라 또는 스마트폰으로 모 세관 배열 위에서 이미지를 캡처.</li>
		<li>이미지를 찍을 때 카메라는 모세 혈관을 높은 품질, 이미지 취소 가능한 만큼의 영역 확대 된 확인 하십시오.</li>
	</ol></li> <li>분석 결과 <ol><li>이미지에 의해 이미지 분석 소프트웨어를 열고 다음 선택 " 이미지 &gt; 형 &gt; 회색조 &gt; 예 "와 " 이미지 &gt; 형 &gt; 16 비트 &gt; 네 ". 선택 " 파일 &gt;로 저장 &gt; 형식 &gt; TIFF " 16 비트 TIFF 형식으로 이미지 변환 하.</li>
		<li>는 Microarray 분석 소프트웨어 <ol><li>오픈 형광 강도의 값을 추출합니다. 소프트웨어의 인터페이스에 16 비트 TIFF 형식 이미지를 끌어서 다음의 파장을 선택 " 532 nm "의 색과 " 녹색 " 이미지를 표시 하.</li>
			<li>만들기 새로운 블록을 모세 혈관에서 형광 신호를 찾습니다. 선택 " 도구 &gt; 새로운 블록 "로 행과 열 수를 입력 하 고 " 1; 1 " 및 " 2; 5 "에 ' 블록 ' 및 ' 기능 ' 별도로 인터페이스.</li>
			<li>오른쪽 클릭 하 고 선택 " 기능 " 모델 및 위치와 직경 모 세관의 형광 영역에 맞게 조정 합니다. 선택 " 분석 " 형광 강도의 값을 추출 하.</li>
			<li>선택 " 파일 &gt;로 설정을 저장 " 블록 문서 저장을 선택 " 파일 &gt;으로 결과 저장 " 형광 강도 결과 저장 하려면. 램프는 모 세관에서 성공적으로 수행 되는지 여부를 정의 하는 SNR 계산. 
			참고:은 모세 혈관의 신호 기록 관광 명소 및 신호 잡음 비율 (SNRs)를의 회색 값 두 부정적인 전경 신호의 평균 평균값을 대상의 전경 신호의 평균값의 비율으로 정의 된에 의해 가져온 제어 합니다. 긍정적인 신호를 확인 하기 위해 컷오프 SNR로 설정 된 &gt; 2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+using+a+capillary-array+microsystem+with+integrated+DNA+extraction%2C+loop-mediated+isothermal+amplification%2C+and+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection.</a> Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-Care+Multiplexed+Assays+of+Nucleic+Acids+Using+Microcapillary-based+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).</li>
<li>Shao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+detection+of+multiple+genetically+modified+organisms+in+a+capillary+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array.</a> Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).</li>
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<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

진정 플랫폼 시연, 여기는 모 세관 배열 램프 기술을 결합, 단일, 매우 효과적이 고 테스트를 운영 하 게 쉬운에서 여러 유전자 GMO 관련 목표의 동시 탐지를 가능 하 게.
카세트에서 다중 램프 반응을 성공적으로 수행 하려면 세 가지 중요 한 포인트 주의 될 필요가 있다. 첫째, 모세 혈관의 상부 및 모 세관 배열의 친수성 및 소수 성 패턴에 대 한 동일한 높이 달성가 동시에 모든 모세 혈관에 시 약을 로드 합니다. 모 세관 로드 어댑터의 접시에 로드 반응 혼합물을 만질 수 있는 초기 PDMS 지원을 그들의 모든 삽입 후 접시에 의해 정렬 되어야 한다. 슈퍼 소수 코트와 모 세관 배열을 대우 할 때 모세 혈관의 안쪽 표면에 담가 외 투를 허용 하지 않습니다. 그냥 코트 PDMS 지원, 모 세관의 상단 부분의 외부 표면에 확산 코팅 수 탑의 위쪽 표면에 로드 하 여 모세 혈관의 외부 표면을 취급 합니다. 경우 그것은 때때로 모든 모세는 시 약으로 가득 차 있습니다, 그것은 특정 ...

여러 핵 산의 동시 검출을 위한 저가, 빠르고 사용 하기 쉬운 시스템 분야, 임상 진단1,2,3, GMO 검출4, 넓은 범위에서 긴급 하 게 필요 5,6,7,,89, 정밀 분석10,11, 그리고 특히 포인트의 케어 테스트 (POCTs), 어디 모니터링 미생물 자원 일반적으로 제한12,,1314있습니다.
연쇄 반응 (PCR), 실시간 PCR 및 멀티플렉스 PCR 파생 메서드를 포함 하 여 검출이 분야에 가장 널리 적용된 기술입니다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 검색 한 대상 한 테스트15 및 전기 및 정교한 전문 장비 필요한.
핵 산 탐지 하기 위한 또 다른 유망한 기술이 이다 루프 중재 등온 증폭 (램프)는 처음 200016에 설명 했다. 램프는 고효율 DNA 검출 방식 이다. 이론적으로, 그것은 수 있는 증폭 1 복사본에서 amplicons 109 복사본을 일정 한 온도, (즉, 60-65 ° C 사이)에서 모두 1 시간 이내. 성공적인 증폭 불용 성 부산물 파이 인산의 대량 생산 하 고 탁도17, 맨 눈으로 직접 관찰 될 수 있는 변경 될 것입니다. 색상 변화는 또한 금속 이온 또는 Calcein18, 핵 산 염색19, hydroxyl naphthol 블루20등 형광 염료의 추가 의해 관찰할 수 있습니다. 높은 감도의 장점과 운영의 편의 때문에 램프는 핵 산 탐지에서 넓게 적용 되 고.
현재, 다중 램프 분석 실험을 위한 주로 두 가지 전략이 있다. 하나는 여러 개의 램프를 갖는 다중 램프 분석 수행 하는 뇌관 1 개의 관21,,2223에 설정 합니다. 그러나, 복합성 및 증폭 효율 본질적인 간섭 및 다른 뇌관 세트 간의 경쟁에 의해 제한 될 것 이다. 또한, 그것은 다른 램프 제품 같은 반응에 어려울 수 있습니다. 또 다른 전략은 물리적 격리를 기반으로 합니다. 다른 뇌관 세트 개별 소형된 구획으로 고립 되었다 및 다중 램프 반응을 동시에 수행 됩니다 다음24,25. 미세 칩에 따라 일반적으로, 이러한 접근 높은 처리량 램프 반응에 대 한 잠재적인 솔루션을 제공 합니다. 그러나, 칩의 제조 및 뇌관 세트의 다중 사전 코팅은 복잡, 비용 증가 재현성을 줄일 수 있습니다.
최근, 몇 가지 연구는 미세 칩의 복잡 한 제조를 무시 하 고 저 비 탐지26,27달성에 모 세관에서 수행 램프 반응을 설명 했습니다. 그러나, 높은 처리량 분석에 관해서는 이러한 모세 혈관은 비슷합니다 PCR 스트립 튜브의 미니어처 버전 샘플 및 반응 시 약 (를 포함 하 여 다른 뇌관 세트) 개별적으로 준비 하 고 해야 합니다 다른에 게 전달 하기 때문에 모세 혈관 내에서 반응 단위입니다. 병렬 및 다중 분석을 달성 하기 위해 추가 장비, 예를 들어 멀티 채널 주사기 펌프는 샘플 또는 시 약의 병렬 로드에 대 한 필요 합니다.
핵 산의 다중 검출을 위한 현재 메서드에 연결 된 한계를 극복 하기 위해 우리 모 세관 배열로 시각적 램프 기술을 결합 하는 소형된 플랫폼을 개발 했습니다. 이 플랫폼은 다중 대상, 소형 크기, 낮은 비용, 그리고28를 운영 하 게 쉬운. 여기, 모 세관 배열 조작 배열에 램프 반응을 수행 하는 방법의 세부 사항을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 모델 유전자 변형된 유기 체 (GMO) 검출을 사용 하 여 표준화 되어 있다. 중요 한 것은,이 프로토콜 다른 핵 산 대상의 높은 처리량 검색에도 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>UltraEverDry (슈퍼 소수성 코트)</td> <td>UltraTech</td><td>4001</td><td>공급 업체:Exiron chemistry (CHINA) CO., LTD.</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>다우코닝</td><td>8332557</td><td></td></tr><tr><td>Bst 중합효소</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td></td></tr><tr><td>베타인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>칼세인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875-5G</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBP0495V</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>New England BioLabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Shanghai</td><td>Sangon</td><td>B804BA0022</td><td></td></tr><tr><td>chitosan</td><td>Shanghai Sangon</td><td>LJ0805S309J</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop 7.0 소프트웨어</td><td>Adobe Systems Inc., CA, USA</td><td></td><td>이미지 분석</td></tr><tr><td>GenePix Pro 6.1</td><td>Molecular Devices, CA, USA</td><td></td><td>마이크로어레이 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Adobe Systems Inc.</td><td></td><td>3D 건설 소프트웨어</td></tr><tr><td>UV 필터 (ZWB2)</td><td>YX스트리밍</td><td></td><td>공급 업체 : taobao</td></tr></tbody></table>

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

다중 대상, 짧은 시간, 그리고 단일 테스트 운영 하 게 쉬운에서 여러 핵 산의 검출에 대 한 리소스-저렴 한 방법론은 절실히 필요 질병 진단, 미생물 모니터링, 유전자 변형된 생명체 (GMO) 검출, 그리고 법정 분석입니다. 우리는 이전 진정 (Capillary Array 기반 Loop 중재 등온 증폭 핵 산의 Multiplex 비주얼 검색) 라는 플랫폼을 설명 했습니다. 여기, 우리는 향상 된 제조 및 성능 프로세스가이 플랫폼에 대 한 설명. 여기, 우리는 작은, 준비-사용 카세트 핵 산의 다중 영상 검출을 위한 모 세관 배열에 의해 조립 적용. 모 세관 배열 고정 루프 중재 등온 증폭 (램프) 뇌관 세트 모세 혈관에 전에 미리 소수 성 및 친수성 패턴으로 치료 이다. 로드 어댑터의 조립 후 램프 반응 혼합물은 로드 하 고 각 모 세관, 단일 pipetting 단계에 의해 모 세관 힘 때문에 고립. 램프 반응 모세 혈관에서 병렬로 수행 됩니다. 결과 휴대용 자외선 손전등 조명에 의해 밖으로 시각적으로 읽혀집니다. 이 플랫폼을 사용 하 여, 8 자주 높은 특이성 및 감도 요소와 GMO 샘플에서 유전자 표시의 모니터링 설명 합니다. 요약 하면, 여기에 설명 된 플랫폼 여러 핵 산의 탐지를 촉진 하기 위한 것입니다. 우리는 높은 처리량 핵 산 분석 필요 분야에 광범위 하 게 적용 될 것입니다 믿습니다.

이 방법에서는, 그것은 샘플 로드 하는 동안 다른 모세 혈관 간의 교차 오염을 방지 하는 것이 중요입니다. 이 개별 모 세관에 뇌관을 유지 수 있는 키토 산 도입 되었다. 그것은 일 또는 하지 여부를 테스트 하려면 우리 미리 고정 ADH1 (옥수수의 유전자 생 참조) 뇌관 "T"와 "U"의 패턴으로 모 세관 카세트에 설정에서 볼 수 있듯이 그림 3a. 예상 대로 포함 된 모세 혈관 뇌관만 설정 보여주는 긍정적인 신호 (그림 3b).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56597/56597fig3v2.jpg"> 
<stro...

이 프로토콜에서 작동 하기 쉬운 여러 핵 산의 비주얼 검색 적용 될 수 있는 작은, 준비-사용 카세트의 제작을 설명 합니다. 이 방법에서는, 모 세관 배열 멀티플렉스 및 고효율 검출 조합 목표의 사용 되었다.

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

이 절차의 전반적인 목표는 작동하기 쉬운 단일 테스트에서 여러 핵산을 육안으로 검출하는 데 적용할 수 있는 작고 바로 사용할 수 있는 카세트를 제작하는 것입니다. 이 방법은 유전자 변형 유기체 또는 GMO 검출과 같은 다중 핵산 검출 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 모세혈관을 청소하려면 실험복, 보안경, 화학 보호 장갑을 착용하십시오.모세혈관을 비커에 넣습니다. 30ml의 아세톤으로 모세혈관을 5분 동안 청소하여 유기물을 제거합니다. 그런 다음 모세 혈관을 탈 이온수로 씻으십시오.다음으로, 약 10ml의 과산화수소를 비커에 부어 피라냐 용액을 준비합니다. 그런 다음 과산화수소에 황산 30ml를 천천히 흔들어 과열을 방지합니다. 용액이 최소 30분 동안 모세혈관을 완전히 덮고 있는지 확인하십시오.그런 다음 많은 양의 물로 피라냐 용액을 씻어냅니다. 모세혈관을 에탄올과 탈이온수로 각각 5분씩 세척합니다. 건조 오븐에서 모세혈관을 건조시킵니다.다음으로, 50ml 튜브에서 PDMS 베이스 및 기어링 시약을 1:1 비율로 계량합니다. 일반적으로 5g의 엘라스토머 베이스와 5g의 엘라스토머 경화제를 혼합합니다. 유리 막대로 약 5분 동안 혼합물을 철저히 저어줍니다.PDMS가 있는 비커를 진공 벨 용기에 30분 동안 넣어 가스를 제거합니다. 그런 다음 PDMS를 스테인리스 스틸 몰드의 실린더에 천천히 붓습니다. PDMS가 섭씨 60도의 건조 오븐에서 3시간 동안 경화되도록 합니다.PDMS를 경화시킨 후 cylindar로 금형을 당겨 금형을 제거합니다. 메스로 금형의 가장자리를 잘라 실린더에서 PDMS를 제거합니다. PDMS를 에탄올과 탈이온수로 세 번 세척합니다.그런 다음 PDMS 지지대를 질소로 건조시킵니다. PDMS 지지대를 1초 동안 초소수성 코팅에 담궈 PDMS 지지대의 아래쪽 표면을 소수성으로 처리합니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 건조시킵니다.다음으로, 청소된 4mm 모세관을 PDMS 지지체의 구멍에 삽입하고 PDMS 지지부의 상단 표면 외부에 모세관의 영점 5mm를 남겨둡니다. 모세혈관의 끝이 같은 높이에 있는지 확인하십시오. 모세혈관의 외부 표면과 PDMS 지지체의 상단 표면을 소수성으로 처리하려면 PDMS 지지체 표면 위에 15마이크로리터의 초소수성 코팅을 추가합니다.초소수성 변형 모세관 어레이를 자연 건조합니다. 다음으로, 한 세트의 프라이머의 프라이머 고정 혼합물의 1 포인트

visual-detection-of-multiple-nucleic-acids-in-a-capillary-array

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

이 비디오에서는 자동화된 모세관 전기영동을 사용하여 cell-free DNA 또는 cfDNA 단편의 크기 분포를 분석합니다. 이 기술은 세포사멸 중에 암세포에서 방출되는 DNA 단편의 프로파일에 대한 통찰력을 얻는 데 도움이 됩니다.

CFDNA의 자동화된 모세관 전기영동 기반 단편 크기 분포 분석: 생체 유체에서 분리된 DNA 단편의 크기 분포를 연구하기 위한 DNA 마이크로칩 기반 방법

이 동영상은 다양한 샘플에서 얻은 형광 표지된 PCR 앰플리콘을 크기에 따라 분석하는 모세관 전기영동 기법을 설명합니다. 그것은 각 단편에 있는 표지된 형광 염료의 도움으로 단편의 염기쌍 길이를 결정하는 이동 패턴을 생성합니다.

모세관 전기영동: 형광 표지된 중합효소 연쇄 반응 앰플리콘을 분석하는 기법

이 동영상은 마우스 혈청에서 순환하는 항글라이칸 항체를 분석하기 위한 인쇄된 글라이칸 어레이 기술을 보여줍니다. 혈청의 항체는 칩의 특정 글라이칸과 상호 작용하며, 이는 면역 염색 후 형광 스캔으로 확인됩니다.

Printed Glycan Array를 사용한 순환 항글라이칸 항체 검출

우리는 DNA 혼성화 검출을위한 미세 유체 기반 전기 바이오칩을 제시한다. ssDNA를 프로브 작용에 따라, 특이도, 민감도 및 검출 한계 보완 및 비 보완 ssDNA를 목표로 공부하고 있습니다. 결과는 3.8 nm의 검출 한계와 함께, 전기 화학적 시스템의 DNA 혼성화 이벤트의 영향을 예시한다.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다.

고밀도 바코드 항체 마이크로 어레이의 흐름 패턴 가이드 제작

이 작품은 공기 방울 조작 플랫폼에서 다중 염기 다형성을 검출 할 수있는 간단하고 시각적 인 방법을 제시한다. 액적 조작 및 다 염기 다형성의 검출을 포함하는 제안 된 방법은 전체 실험을 통해 고급 장비의 도움없이 23 ° C 부근 수행 될 수있다.

공기 방울 조작 플랫폼에서 멀티 염기 다형성의 비주얼 색도계 감지

이 기사에서는 현장에서 제조 된 핵산 마이크로 어레이의 합성 및 응용 분야의 새로운 개발을 제시하고 논의합니다. 특히, 우리는 DNA 합성을 위한 프로토콜이 RNA로 확장될 수 있는 방법과 마이크로어레이가 어떻게 회수 가능한 핵산 라이브러리를 만드는 데 사용될 수 있는지 보여줍니다.

고밀도 DNA 및 RNA 마이크로어레이 - 광소학 합성, 하이브리드화 및 대형 핵산 라이브러리의 제조

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

배우세요 모 세관 배열을 이용한 다중 핵산 시각 검출법으로 유전자 변형 생물체(GMO)를 신속하게 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 사용자 친화적인 카세트 제작과 효율적인 다중 검출을 가능하게 합니다.

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

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