모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

이 절차의 전반적인 목표는 작동하기 쉬운 단일 테스트에서 여러 핵산을 육안으로 검출하는 데 적용할 수 있는 작고 바로 사용할 수 있는 카세트를 제작하는 것입니다. 이 방법은 유전자 변형 유기체 또는 GMO 검출과 같은 다중 핵산 검출 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 모세혈관을 청소하려면 실험복, 보안경, 화학 보호 장갑을 착용하십시오.

모세혈관을 비커에 넣습니다. 30ml의 아세톤으로 모세혈관을 5분 동안 청소하여 유기물을 제거합니다. 그런 다음 모세 혈관을 탈 이온수로 씻으십시오.

다음으로, 약 10ml의 과산화수소를 비커에 부어 피라냐 용액을 준비합니다. 그런 다음 과산화수소에 황산 30ml를 천천히 흔들어 과열을 방지합니다. 용액이 최소 30분 동안 모세혈관을 완전히 덮고 있는지 확인하십시오.

그런 다음 많은 양의 물로 피라냐 용액을 씻어냅니다. 모세혈관을 에탄올과 탈이온수로 각각 5분씩 세척합니다. 건조 오븐에서 모세혈관을 건조시킵니다.

다음으로, 50ml 튜브에서 PDMS 베이스 및 기어링 시약을 1:1 비율로 계량합니다. 일반적으로 5g의 엘라스토머 베이스와 5g의 엘라스토머 경화제를 혼합합니다. 유리 막대로 약 5분 동안 혼합물을 철저히 저어줍니다.

PDMS가 있는 비커를 진공 벨 용기에 30분 동안 넣어 가스를 제거합니다. 그런 다음 PDMS를 스테인리스 스틸 몰드의 실린더에 천천히 붓습니다. PDMS가 섭씨 60도의 건조 오븐에서 3시간 동안 경화되도록 합니다.

PDMS를 경화시킨 후 cylindar로 금형을 당겨 금형을 제거합니다. 메스로 금형의 가장자리를 잘라 실린더에서 PDMS를 제거합니다. PDMS를 에탄올과 탈이온수로 세 번 세척합니다.

그런 다음 PDMS 지지대를 질소로 건조시킵니다. PDMS 지지대를 1초 동안 초소수성 코팅에 담궈 PDMS 지지대의 아래쪽 표면을 소수성으로 처리합니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 건조시킵니다.

다음으로, 청소된 4mm 모세관을 PDMS 지지체의 구멍에 삽입하고 PDMS 지지부의 상단 표면 외부에 모세관의 영점 5mm를 남겨둡니다. 모세혈관의 끝이 같은 높이에 있는지 확인하십시오. 모세혈관의 외부 표면과 PDMS 지지체의 상단 표면을 소수성으로 처리하려면 PDMS 지지체 표면 위에 15마이크로리터의 초소수성 코팅을 추가합니다.

초소수성 변형 모세관 어레이를 자연 건조합니다. 다음으로, 한 세트의 프라이머의 프라이머 고정 혼합물의 1 포인트 6 마이크로 리터를 추가하여 사전 설계된 순서에 따라 모세관 어레이의 해당 모세관 1 개를 채운다. 어레이를 표준 평평한 바닥 96웰 플레이트의 투명한 웰에 고정하고 어레이를 섭씨 60도에서 최소 2시간 동안 건조시킵니다.

카세트를 조립하려면 고정된 어레이 상단에 로딩 어댑터를 놓습니다. 어댑터의 접시가 10개의 모세관의 노출된 부분만 덮고 있는지 확인하십시오. LAMP 반응 혼합물을 준비하려면 텍스트 프로토콜에 따라 혼합물에 시약을 추가하고 소성을 첨가한 후 5초 동안 반응 혼합물을 와류로 만듭니다.

Bst 중합효소를 첨가한 후 튜브를 20회 부드럽게 뒤집습니다. 환경에 존재하는 미량 DNA는 LAMP 믹스를 건네주기 전에 염산 1리터당 1몰로 조기에 세척하면 제거할 수 있습니다. 표준 100 마이크로리터 팁으로 LAMP 반응 혼합물 20 마이크로리터를 흡입합니다.

팁을 로딩 어댑터의 입구에 삽입하여 잠급니다. 반응 혼합물을 어댑터의 접시에 부드럽게 주입합니다. 반응 혼합물은 접시를 빠르게 채운 다음 모세관 힘을 통해 모세관을 자동으로 로드합니다.

잠금 팁이 있는 어댑터를 제거하고 PCR 호환 투명 밀봉 필름으로 웰을 밀봉합니다. 그런 다음 섭씨 63도의 인큐베이터에서 1시간 동안 모세관 어레이를 배양합니다. 형광 방출의 이미지를 획득하려면 UV 손전등을 사용하여 해리된 하소를 여기시켜 형광을 방출합니다.

모세관 어레이 상단에서 디지털 카메라 또는 스마트폰으로 이미지를 캡처합니다. 이미지를 촬영할 때 고품질의 선명한 이미지를 얻을 수 있도록 카메라가 모세관 영역을 최대한 확대해야 합니다. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어로 이미지를 엽니다.

그런 다음 이미지, 몰드, 그레이스케일, 예 및 이미지, 몰드, 16비트, 예를 선택합니다. 파일, 다른 이름으로 저장, 형식, TIFF를 선택하여 이미지를 16비트 TIFF 형식으로 변환합니다. 형광 강도의 값을 추출하려면 마이크로어레이 분석 소프트웨어를 엽니다.

16비트 TIFF 형식 이미지를 소프트웨어 인터페이스로 드래그한 다음 532나노미터의 파장과 녹색을 선택하여 이미지를 표시합니다. 그런 다음 캐필러리에서 형광 신호를 찾을 수 있는 새 블록을 만듭니다. 도구, 새 블록을 선택한 다음 열과 행의 수를 블록 및 기능 인터페이스에 개별적으로 1:1 및 2:5로 입력합니다.

마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 피쳐 모델을 선택합니다. 그런 다음 모세혈관의 형광 영역에 맞게 위치와 직경을 조정합니다. analyze(분석)를 선택하여 형광 강도 값을 추출합니다.

마지막으로 파일, 다른 이름으로 설정 저장을 선택하여 블록의 문서를 저장합니다. 그런 다음 선택, 파일, 결과를 저장하여 형광 강도 결과를 저장합니다. 여기에 표시된 것은 모세관 배열의 레이아웃입니다.

모세혈관 1번부터 8번까지, LAMP 프라이머 세트가 접두사로 붙습니다. 모세 혈관 9와 10은 2를 나타내며 프라이머 제어는 없습니다. 여기에 표시된 것은 유전자 변형 옥수수 MON863의 검출을 위한 형광 사진으로, 녹색은 긍정적인 LAMP 증폭을 나타냅니다.

성공적인 증폭은 빈 모세관 간의 오염 없이 예상되는 모세혈관 1, 6, 7 및 8에서만 나타납니다. 이 형광 사진은 GMO 혼합물을 감지하기 위한 것입니다. 녹색은 포지티브 LAMP 증폭을 나타냅니다.

성공적인 증폭은 빈 모세관 사이에서 오염 없이 예상되는 모세관 1, 4, 5, 6, 7 및 8에서만 나타났습니다. 여기에 표시된 형광 사진은 유전자 변형되지 않은 옥수수를 감지하기 위한 것이며, 녹색은 긍정적인 LAMP 증폭을 나타냅니다. 성공적인 증폭은 예상되는 모세관 8에서만 나타났으며 빈 모세관 사이에서는 오염이 없었습니다.

일단 숙달되면 이 감지 절차를 제대로 수행하면 한 지점에서 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다중 핵산 검출을 수행하기 위해 모세관 기반 카세트를 제작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.